Erzeugung von selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden aus pluripotenten Stammzellen

Yonatan R. Lewis-Israeli; Brett D. Volmert; Mitchell A. Gabalski; Amanda R. Huang; Aitor Aguirre

doi:10.3791/63097

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Methodenartikel

Erzeugung von selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden aus pluripotenten Stammzellen

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DOI:

10.3791/63097

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15. September 2021

Yonatan R. Lewis-Israeli¹^,² , Brett D. Volmert¹^,² , Mitchell A. Gabalski¹^,² , Amanda R. Huang¹^,² , Aitor Aguirre¹^,²

¹Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, ²Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Herstellung entwicklungsrelevanter menschlicher Herzorganoide (hHOs) unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen durch Selbstorganisation. Das Protokoll beruht auf der sequentiellen Aktivierung von Entwicklungshinweisen und produziert hochkomplexes, funktionell relevantes menschliches Herzgewebe.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, die menschliche Herzentwicklung in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, ist durch die Fähigkeit, die Komplexität des menschlichen Herzens in vitro zu modellieren, stark eingeschränkt. Die Entwicklung effizienterer organähnlicher Plattformen, die komplexe In-vivo-Phänotypen wie Organoide und Organe auf einem Chip modellieren können, wird die Fähigkeit verbessern, die Entwicklung und Erkrankung des menschlichen Herzens zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung hochkomplexer menschlicher Herzorganoide (hHOs) durch Selbstorganisation unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen und schrittweise Aktivierung des Entwicklungsweges unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren. Embryoide Körper (EBs) werden in einer 96-Well-Platte mit runden, extrem niedrigen Befestigungstöpfen erzeugt, was die Suspensionskultur individualisierter Konstrukte erleichtert.

Die EBs werden durch eine dreistufige Wnt-Signalmodulationsstrategie in hHOs differenziert, die eine anfängliche Wnt-Signalwegaktivierung zur Induktion des kardialen Mesodermenschicksals, einen zweiten Schritt der Wnt-Hemmung zur Schaffung definitiver Herzlinien und einen dritten Wnt-Aktivierungsschritt zur Induktion von Proepikardorgangewebe beinhaltet. Diese Schritte, die in einem 96-Well-Format durchgeführt werden, sind hocheffizient, reproduzierbar und produzieren große Mengen an Organoiden pro Lauf. Die Analyse mittels Immunfluoreszenzbildgebung von Tag 3 bis Tag 11 der Differenzierung zeigt erste und zweite Herzfeldspezifikationen und hochkomplexe Gewebe in hHOs an Tag 15, einschließlich Myokardgewebe mit Regionen von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten sowie interne Kammern, die mit Endokardgewebe ausgekleidet sind. Die Organoide weisen auch ein kompliziertes vaskuläres Netzwerk in der gesamten Struktur und eine äußere Auskleidung des epikarden Gewebes auf. Aus funktioneller Sicht schlagen hHOs robust und weisen eine normale Kalziumaktivität auf, wie sie durch Fluo-4-Live-Imaging bestimmt wird. Insgesamt stellt dieses Protokoll eine solide Plattform für In-vitro-Studien in menschlichen organähnlichen Herzgeweben dar.

Einleitung

Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigste Art von angeborenen Defekten beim Menschen und betreffen etwa 1% aller Lebendgeburten1,2,3. Unter den meisten Umständen bleiben die Gründe für KHK unbekannt. Die Fähigkeit, menschliche Herzmodelle im Labor zu erstellen, die dem sich entwickelnden menschlichen Herzen sehr ähnlich sind, stellt einen bedeutenden Schritt nach vorne dar, um die zugrunde liegenden Ursachen von KHK beim Menschen und nicht in Leihtiermodellen direkt zu untersuchen.

Der Inbegriff von im Labor gezüchteten Gewebemodellen sind Org....