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Methodenartikel

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

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DOI:

10.3791/63101

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7. Dezember 2021

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In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen den Prozess der Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von Bakterien, die Identifizierung mit der 16S-rRNA-Methode und die Prüfung ihres Kohlenwasserstoffabbaupotenzials. Dieser Artikel würde Forschern helfen, die mikrobielle Biodiversität in Umweltproben zu charakterisieren und insbesondere nach Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu suchen.

Zusammenfassung

Kohlenwasserstoff-Schadstoffe sind widerspenstig gegenüber dem Abbau und ihre Anreicherung in der Umwelt ist giftig für alle Lebensformen. Bakterien kodieren zahlreiche katalytische Enzyme und sind von Natur aus in der Lage, Kohlenwasserstoffe zu verstoffwechseln. Wissenschaftler nutzen die Artenvielfalt in aquatischen Ökosystemen, um Bakterien mit biologischem Abbau- und Bioremediationspotenzial zu isolieren. Solche Isolate aus der Umwelt bieten eine Vielzahl von Stoffwechselwegen und Enzymen, die weiter genutzt werden können, um den Abbauprozess im industriellen Maßstab zu skalieren. In diesem Artikel skizzieren wir den allgemeinen Prozess der Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten aus aquatischen Lebensräumen und untersuchen ihre Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle in vitro mit einfachen Techniken zu nutzen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung verschiedener Bakterienarten und deren anschließende Identifizierung mittels der 16S rRNA-Analyse. Das Protokoll enthält auch Schritte zur Charakterisierung des Kohlenwasserstoffabbaupotenzials von Bakterienisolaten. Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die versuchen, Bakterienarten aus Umwelthabitaten für ihre biotechnologischen Anwendungen zu isolieren.

Einleitung

Kohlenwasserstoffe (HC) werden sowohl als Kraftstoffe als auch in chemischen Anwendungen in großem Umfang eingesetzt. Aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol und Xylol werden häufig als Lösungsmittel verwendet1. Alkene wie Ethylen und Propylen dienen als Vorläufer bei der Synthese von Polyethylen- bzw. Polypropylenpolymeren. Durch die Polymerisation eines anderen Kohlenwasserstoffs, Styrol, entsteht Polystyrol. Anthropogene Aktivitäten bringen Kohlenwasserstoffe während ihrer Produktion und ihres Transports in die Umwelt ein. Die Kontamination von Boden und Wasser durch Kohlenwasserstoffe ist für die Umwelt und die menschliche Gesundh....

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Protokoll

1. Probenentnahme, -verarbeitung und -analyse

HINWEIS: Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Einige der Isolate können pathogen sein, tragen Sie daher Handschuhe und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich vor und nach dem Gebrauch.

  1. Entnehmen Sie 500 ml Wasserprobe in fünf sterilen Glasflaschen an verschiedenen Stellen des Gewässers. Messen Sie den pH-Wert und die Temperatur jeder Probe mit einem pH-Messgerät bzw. einem Thermometer.
    HINWEIS: Das Protokoll ist nicht standortspezifisch und kann leicht angepasst werden, um Organismen auch aus kohlenwasserstoffko....

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Verfahren zur Isolierung und zum Screening von Bakterien aus aquatischen Lebensräumen und deren anschließende Identifizierung durch 16S rRNA-Analyse. Wasserproben aus einem Feuchtgebiet in Dadri, Indien, wurden in sterilen Glasflaschen gesammelt und sofort zur Verarbeitung ins Labor gebracht. Die Proben wurden durch Filterschichten mit einer Porengröße von 0,22 μm geleitet, und die Filterpapiere wurden in Kontakt mit verschiedenen M.......

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Diskussion

Es ist allgemein bekannt, dass nur etwa 1 % der Bakterien auf der Erde ohne weiteres im Labor kultiviert werdenkönnen 6. Selbst unter den kultivierbaren Bakterien bleiben viele uncharakterisiert. Verbesserungen in molekularen Methoden haben der Analyse und Bewertung von Bakteriengemeinschaften eine neue Dimension verliehen. Solche Techniken haben jedoch ihre Grenzen, aber sie machen die Kulturanalysen nicht überflüssig. Reinkulturtechniken zur Isolierung einzelner Bakterienarten sind nach wie vor .......

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Karthik Krishnan und den Mitgliedern des RP-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. DS wird durch das SNU-Doctoral Fellowship und das Earthwatch Institute India Fellowship unterstützt. Das RP-Labor wird durch ein CSIR-EMR-Stipendium und Start-up-Mittel der Shiv Nadar University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseSigma-AldrichA4718Gelelektrophorese
Ammoniumchlorid (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Wachstumsmedium Komponente
AmmoniumsulfatSigma-AldrichA4418Wachstumsmedium Komponente
Bacto-AgarMillipore1016141000Herstellung fester Medien
Calciumchlorid (CaCl2)MERCKC4901-500GWachstumsmedium Komponente
CatecholSigma-Aldrich135011Kohlenwasserstoff-Abbauassay
Cetyltrimethylammoniumbromid, CTABSigma-AldrichH6269Genomische DNA-Isolierung
ChloroformHIMEDIAMB109Genomische DNA-Isolierung
Dinatriumphosphat (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Wachstumsmedium Komponente
EDTASigma-AldrichE9884gDNA Pufferkomponente
Eisensulfat, Heptahydrat (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Wachstumsmedium Komponente
GlucoseSigma-AldrichG7021Wachstumsmedium
Komponente GlycerinSigma-AldrichG5516Wachstumsmedium Komponente; Glycerinaktien
IsopropanolHIMEDIAMB063Genomische DNA-Isolierung
LB AgarDifco244520Wachstumsmedium
Luria-Bertani (LB)Difco244620Wachstumsmedium
Magnesiumsulfat (MgSO4)MERCKM2643Wachstumsmedium Komponente
Mangan(II)-sulfat-Monohydrat (MnSO4. H20)Sigma-Aldrich221287Komponente des Wachstumsmediums
Nährstoffbrühe (NB)Merck (Millipore)03856-500GWachstumsmedium
PeptonMerck91249-500GKomponente des Wachstumsmediums
PhenolSigma-AldrichP1037Isolierung der genomischen DNA
Kaliumphosphat, zweibasisch (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Wachstumsmedium Komponente
Kaliumphosphat, monobasisch (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Wachstumsmedium
Komponente Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546Genomische DNA-Isolierung
QIAquick Gel ExtraktionskitQIAGEN160016235DNA Aufreinigung
QIAquick PCR AufreinigungskitQIAGEN163038783DNA-Aufreinigung
R2A AgarMillipore1004160500Wachstumsmedium
SmartSpec Plus SpektralphotometerBIO-RAD4006221Absorptionsmessung
NatriumacetatSigma-AldrichS2889Genomische DNA-Isolierung
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichS9888Wachstumsmediumkomponente
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-AldrichL3771Genomische DNA-Isolierung
StyrolSigma-AldrichS4972Biologischer Abbau von Styrol
Taq-DNA-PolymeraseNEBM0273X16s rRNA-PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Resuspension genomischer DNA
Tryptische Sojabrühe (TSB)Merck22092-500GWachstumsmedium
HefeextraktSigma-AldrichY1625-1KGWachstumsmedium Komponente
Zinksulfat Heptahydrat (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Wachstumsmedium Komponente

Referenzen

  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environme....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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