Kohlenwasserstoff-Schadstoffe sind widerspenstig gegenüber dem Abbau und ihre Anreicherung in der Umwelt ist giftig für alle Lebensformen. Bakterien kodieren zahlreiche katalytische Enzyme und sind von Natur aus in der Lage, Kohlenwasserstoffe zu verstoffwechseln. Wissenschaftler nutzen die Artenvielfalt in aquatischen Ökosystemen, um Bakterien mit biologischem Abbau- und Bioremediationspotenzial zu isolieren. Solche Isolate aus der Umwelt bieten eine Vielzahl von Stoffwechselwegen und Enzymen, die weiter genutzt werden können, um den Abbauprozess im industriellen Maßstab zu skalieren. In diesem Artikel skizzieren wir den allgemeinen Prozess der Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten aus aquatischen Lebensräumen und untersuchen ihre Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle in vitro mit einfachen Techniken zu nutzen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung verschiedener Bakterienarten und deren anschließende Identifizierung mittels der 16S rRNA-Analyse. Das Protokoll enthält auch Schritte zur Charakterisierung des Kohlenwasserstoffabbaupotenzials von Bakterienisolaten. Dieses Protokoll wird für Forscher nützlich sein, die versuchen, Bakterienarten aus Umwelthabitaten für ihre biotechnologischen Anwendungen zu isolieren.