Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.
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Methodenartikel
Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Augenerkrankung des hinteren Segments wie die diabetische Retinopathie verändert die Physiologie der Netzhaut. Die diabetische Retinopathie ist gekennzeichnet durch eine Netzhautablösung, den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) und die retinale Angiogenese. Ein In-vivo-Rattenmodell ist ein wertvolles experimentelles Werkzeug, um die Veränderungen in der Struktur und Funktion der Netzhaut zu untersuchen. Wir schlagen drei verschiedene experimentelle Techniken im Rattenmodell vor, um morphologische Veränderungen von Netzhautzellen, retinalen Gefäßen und kompromittiertem BRB zu identifizieren. Die Netzhauthistologie wird verwendet, um die Morphologie verschiedener Netzhautzellen zu untersuchen. Die quantitative Messung erfolgt auch durch retinale Zellzählung und Dickenmessung verschiedener Netzhautschichten. Ein BRB-Abbauassay wird verwendet, um das Austreten von extraokularen Proteinen aus dem Plasma in Glaskörper aufgrund des Abbaus von BRB zu bestimmen. Die Fluoreszenzangiographie wird verwendet, um die Angiogenese und das Austreten von Blutgefäßen zu untersuchen, indem retinale Gefäße mit FITC-Dextran-Farbstoff sichtbar gemacht werden.
Einleitung
Die diabetische Retinopathie (DR) ist eine der komplexesten sekundären Komplikationen des Diabetes mellitus. Es ist auch die Hauptursache für vermeidbare Blindheit in der Bevölkerung im erwerbsfähigen Alter weltweit. In einer kürzlich durchgeführten Meta-Analyse von 32,4 Millionen blinden Menschen waren 830.000 (2,6%) Menschen aufgrund von DR1 blind. Der Anteil des Sehverlusts, der auf Diabetes zurückzuführen ist, belegte 2015 mit 1,06% (0,15-2,38) weltweit den siebten Platz2,3.
Die diabetische Retinopathie wird durch Gefäßanomalien im hinteren Augengewebe di....
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Protokoll
Dieses Protokoll folgt allen Tierpflegerichtlinien, die von der Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, zur Verfügung gestellt werden.
1. Netzhauthistologie
- Enukleation und Fixierung des Auges
- Euthanasieren Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen alt) mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein nachweisbarer Herzschlag bestätigt den Tod innerhalb von 2-5 min.
- Enukleieren Sie das Auge, indem Sie Einschnitte mit einer Skalpellklinge an....
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Ergebnisse
Netzhauthistologie
In der diabetischen Netzhaut erleiden Netzhautzellen eine Degeneration. Darüber hinaus nimmt die Dicke der Netzhautschichten aufgrund von Ödem22 zu. Die nach der Hämatoxylin- und Eosinfärbung erhaltenen Bilder können für die Zellzählung und die Messung der Dicke verschiedener Schichten verwendet werden, wie in Abbildung 2 mit ImageJ gezeigt.
Blut-Netzhaut-Barriere-Abbau-Assay
Da das.......
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Diskussion
Histologie
Die Netzhauthistologie wird durchgeführt, um die morphologischen Veränderungen von Netzhautzellen und -schichten zu visualisieren. Verschiedene Schritte, einschließlich der Wahl der fixativen Lösung, der Fixationsdauer, der Dehydratation und der Paraffinimprägnierung, müssen optimiert werden. Die Gewebegröße sollte 3 mm nicht überschreiten, da die fixative Penetration langsam wird. Das häufig verwendete 4%ige Paraformaldehyd führt aufgrund der relativ hohen Osmolarität der Lösung im Verglei.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren möchten den Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) zur Förderung von Dr. Nirmal J. Wir möchten uns auch bei der University Grant of Commission für die Bereitstellung eines Junior Research Fellowship für Manisha Malani und der Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, für die Bereitstellung infrastruktureller Einrichtungen bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Histologie | |||
| Reagenzien | |||
| Isofluran | Abbott | Anästhesiemittel | |
| Ketaminhydrochlorid | Troikaa Pharmaceuticals | Anästhesiemittel | |
| Xylazin | Indian Immunologicals Limited | Anästhesiemittel | |
| Pentobarbital-Natrium | Zora Pharma | Euthanasiemittel | |
| Fixierlösung (1 % Formaldehyd, 1,25 % Glutaraldehyd | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Eigens hergestellt |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydratisierung |
| Xylol | HiMedia MB-180 | Reinigung von Ethanol oder Paraffin | |
| Paraffinwachs | HiMedia | GRM10702 | zur Einbettung von Gewebe |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | Zur Vorbereitung von albuminbeschichteten Objektträgern. Glycerin und Eialbumin werden im Verhältnis 1:1 gemischt, um Objektträger zu beschichten |
| Salzsäure | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | Zur Herstellung von 1 % saurem Alkohol |
| Essigsäure | HiMedia | AS119 | Zur Herstellung von Eosin |
| Scotts Wasser | Leica | 3802900 | Bläuereagenz |
| Papanicolaou-Lösung 1b Hämatoxylinlösung | Sigma | 1.09254.0500 | Färbung von Zellkernen |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Färbung von Zytoplasma, 0,25 %ige Lösung wurde hergestellt hauseigene |
| DPX Eindeckmittel | Sigma | 6522 | Visualisierung und Schutz von Netzhautschnitten |
| Ausrüstungen | |||
| Glaswaren | Borosil | ||
| Hornhautzange | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissektion |
| Colibri Pinzette | Stephens | Instruments S5-1135 | |
| Dissektion Gebogene Mikroschere | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissektion |
| Vannas Schere | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissektion |
| Irisschere | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissektionskassetten |
| HiMedia | PW1292 | Zum Halten von Gewebe während der Histologieverarbeitung | |
| Wasserbad | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperaturerhaltung |
| Paraffin-Einbettstation | Myr | EC 350 | Vorbereitung von Paraffinblöcken |
| Mikrotom | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Schnittklingen |
| Leica | Leica 818 | ||
| Schnittpräparate | HiMedia | BG005 | Halten von Paraffingewebeschnitten |
| Deckgläser | HiMedia | BG014C | Zum Abdecken von Gewebe nach Zugabe von Einbettmedien |
| Blut Abbau der Netzhautbarriere | |||
| Reagenzien | |||
| Isofluran | Abbott | B506 | Anästhesie |
| Trockeneis | Nicht anwendbar | Dissektion | |
| Bradford-Reagenz | Sigma | B6916 | Proteinquantifizierung |
| Ausrüstungen | |||
| Hornhautzange | Stephens | Instruments S5-1200 | |
| Dissektion Colibri Pinzette | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissektion |
| Gebogene Mikroschere | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissektion |
| Vannas Schere | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissektion |
| Iris Schere | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissektion |
| Glaswaren | Borosil | Nicht zutreffend | |
| EDTA-beschichtete Röhrchen | J.K Diagnostics | Nicht zutreffend | Trennen von Plasma und Vollblut |
| Homogenisierungsröhrchen | MP Biomedicals | Artikelnummer: 115076200-CF | Homogenisierung von glasartigen |
| Homogenisierungskappen | MP Biomedicals | Artikelnummer: 115063002-CF | Homogenisierung von |
| Glaskügelchen | MP Biomedicals | Artikelnummer: 116914801 | Homogenisierung von Glaskörpern |
| Homogenisator | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenisierung von glasartigen |
| 96-Well-Platten - Transparent | Grenier | GN655101 | Proteinquantifizierung |
| Plattenleser | Molekulare Geräte | SpectrMax M4 | Absorptionsmessung |
| Zentrifuge | REMI | CPR240 Plus | Zentrifugation |
| Fluoreszenzangiographie | |||
| Reagenzien | |||
| Isofluran | Abbott | B506 | Anästhesie |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylindilaurat, DMSO | FITC, Dextran und Dibutylindilaurat von Sigma; DMSO von HiMedia | FITC-F3651, Dextran-31390, Dibutylindilaurat -29123, DMSO-TC185 | Hergestellt im eigenen |
| Haus Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-Fading-Eindeckmedium |
| Ausrüstungen | |||
| Hornhautzange | Stephens Instruments | S5-1200 | |
| Stephens Instruments | S5-1135 | Dissektion | |
| Gebogene Mikroschere | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissektion |
| Vannas Schere | Stephens | Instruments S7-1387 | Dissektion |
| Iris Schere | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissektion |
| Glaswaren | Borosil | Nicht zutreffend | |
| Objektträger | HiMedia | BG005 | Flatmount-Vorbereitung |
| Deckgläser | HiMedia | BG014C | Zum Abdecken von Gewebe nach dem Hinzufügen von Eindeckmedien |
| Konfokales Mikroskop | Leica | DMi8 | Visualisierung von Flatmount |
Referenzen
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
