Summary
В этом исследовании сообщается о новом подходе к измерению нескольких митохондриальных функциональных параметров на основе проточной цитометрии и двойного окрашивания двумя флуоресцентными репортерами или антителами для обнаружения изменений в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале, уровне активных форм кислорода, составе митохондриальной дыхательной цепи и митохондриальной ДНК.
Abstract
Митохондрии играют важную роль в патофизиологии многих нейродегенеративных заболеваний. Изменения в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале (MMP), митохондриальной продукции активных форм кислорода (АФК) и количестве копий митохондриальной ДНК (мтДНК) часто являются особенностями этих процессов. В этом отчете подробно описывается новый подход на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в различных типах клеток, включая индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs) и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Эта стратегия, основанная на потоке, использует живые клетки для измерения объема митохондрий, уровней MMP и АФК, а также фиксированные клетки для оценки компонентов митохондриальной дыхательной цепи (MRC) и связанных с мтДНК белков, таких как митохондриальный фактор транскрипции A (TFAM).
Путем совместного окрашивания с флуоресцентными репортерами, включая MitoTracker Green (MTG), тетраметилродаминэтиловый эфир (TMRE) и MitoSox Red, изменения в объеме митохондрий, MMP и митохондриальном АФК могут быть количественно определены и связаны с содержанием митохондрий. Двойное окрашивание антителами против субъединиц комплекса MRC и транслоказы наружной митохондриальной мембраны 20 (TOMM20) позволяет оценить экспрессию субъединицы MRC. Поскольку количество TFAM пропорционально числу копий мтДНК, измерение TFAM на TOMM20 дает косвенное измерение мтДНК на митохондриальный объем. Весь протокол может быть выполнен в течение 2-3 ч. Важно отметить, что эти протоколы позволяют измерять митохондриальные параметры, как на общем уровне, так и на конкретном уровне на митохондриальный объем, используя проточную цитометрию.
Introduction
Митохондрии являются важными органеллами, присутствующими почти во всех эукариотических клетках. Митохондрии отвечают за энергоснабжение, производя аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования и действуют как метаболические посредники для биосинтеза и метаболизма. Митохондрии глубоко вовлечены во многие другие важные клеточные процессы, такие как генерация АФК, гибель клеток и внутриклеточная регуляция Ca2+. Митохондриальная дисфункция была связана с различными нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Хантингтона (БГ), атаксию Фридрейха (FRDA) и боковой амиотрофический склероз (БАС)1. Считается, что повышенная митохондриальная дисфункция и аномалия мтДНК также способствуют старению человека 2,3.
Различные типы митохондриальной дисфункции встречаются при нейродегенеративных заболеваниях, а изменения в объеме митохондрий, деполяризация MMP, производство АФК и изменения в количестве копий мтДНК распространены 4,5,6,7. Поэтому способность измерять эти и другие митохондриальные функции имеет большое значение при изучении механизмов заболевания и тестировании потенциальных терапевтических агентов. Более того, ввиду отсутствия животных моделей, которые точно воспроизводят нейродегенеративные заболевания человека, создание подходящих модельных систем in vitro, которые рекапитулируют заболевание человека в клетках мозга, является важным шагом на пути к лучшему пониманию этих заболеваний и разработке новых методов лечения 2,3,8,9.
Человеческие ИПСК могут быть использованы для генерации различных клеток мозга, включая нейронные и ненейрональные клетки (то есть глиальные клетки), а митохондриальное повреждение, связанное с нейродегенеративными заболеваниями, было обнаружено в обоих типах клеток 3,10,11,12,13. Соответствующие методы дифференциации iPSC в нейронные и глиальные линии доступны 14,15,16. Эти клетки обеспечивают уникальную платформу для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств. Кроме того, поскольку они получены от пациентов, нейроны и глиальные клетки, полученные из iPSC, обеспечивают модели заболеваний, которые более точно отражают то, что происходит у людей.
На сегодняшний день существует мало удобных и надежных методов измерения множественных митохондриальных функциональных параметров в ИПСК, особенно в живых нейронах и глиальных клетках. Использование проточной цитометрии предоставляет ученому мощный инструмент для измерения биологических параметров, включая митохондриальную функцию, в отдельных клетках. Этот протокол предоставляет подробную информацию о генерации различных типов клеток мозга, включая нервные стволовые клетки (NSC), нейроны и глиальные астроциты из iPSCs, а также новые подходы на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в разных типах клеток, включая iPSCs и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Протокол также обеспечивает стратегию совместного окрашивания для использования проточной цитометрии для измерения объема митохондрий, MMP, уровня митохондриальной АФК, комплексов MRC и TFAM. Включая измерения объема или массы митохондрий, эти протоколы также позволяют измерять как общий уровень, так и конкретный уровень на митохондриальную единицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов и Дополнительную таблицу S1 для рецептур всех сред и решений, используемых в этом протоколе.
1. Дифференциация ИПСК человека в NCS, дофаминергические (DA) нейроны и астроциты
- Подготовьте пластины с матричным покрытием.
- Разморозьте флакон 5 мл матрицы на льду за ночь. Разбавьте 1 мл матрицы 99 мл холодной модифицированной среды Eagle Medium advanced Dulbecco/F-12 Ham (Advanced DMEM/F12) (конечная концентрация 1%). Сделайте 1 мл аликвоты и храните их при -20 °C.
- Разморозьте матричный раствор при 4 °C (держите его холодным) и покройте 6 лунок (1 мл на скважину в 6-луночной плите).
- Поместите пластину с матричным покрытием в увлажненный 5% CO2/95% воздушный инкубатор при 37 °C в течение 1 ч. Выньте тарелку из инкубатора и дайте ей уравновеситься до комнатной температуры (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пластину в течение 3 дней после нанесения покрытия. Однако пластина с покрытием может храниться до 2 недель при температуре 4 °C. Просто не забудьте вынуть его и дать ему нагреться до RT перед использованием. Для длительного хранения добавьте 1 мл питательной среды iPSC к покрытой пластине, чтобы избежать высыхания матрицы.
- Размораживающие иПСК
- Предварительно прогрейте пластины с матричным покрытием при RT или в инкубаторе при 37 °C в течение 20-30 мин. Предварительно прогреть необходимое количество питательной среды iPSC на РТ.
- Смешайте 6 мл предварительной питательной среды iPSC с 12 мкл ингибитора Y-27632 ROCK для получения конечной концентрации 10 мкМ.
- Частично разморозьте замороженный флакон иПСК при 37 °C на водяной бане, пока не останется небольшой кусочек льда.
- Медленно добавляют 1 мл предварительной питательной среды iPSC с 12 мкл ингибитора ROCK по каплям к клеткам. Перенесите жидкое содержание флакона с iPSCs по каплям в одну лунку 6-луночной предварительно покрытой пластины с помощью пипетки 5 мл.
- Переместите пластину в перпендикулярных направлениях, чтобы перемешать содержимое скважины и вернуть пластину в инкубатор. Замените питательную среду iPSC через 24 ч после промывки фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (DPBS) (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте ингибитор ROCK к последующим кормлениям. Ежедневно меняйте среду культуры iPSC.
- Субкультурирование ИПСК
- Предварительно прогрейте пластины с матричным покрытием при RT или в инкубаторе при 37 °C в течение 20-30 мин. Предварительно прогреть необходимое количество питательной среды iPSC на РТ.
- Аспирируйте питательную среду из пластин, содержащих клетки. Промыть иПСК DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине).
- Добавьте ЭДТА (0,5 мМ) (1 мл на скважину в 6-луночной плите). Насиживайте пластины при 37 °C до тех пор, пока края колоний не начнут подниматься из лунки (обычно 3-5 мин). Аспирация ЭДТА.
- Добавьте предварительно расплавленную питательную среду iPSC (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и принудительно отсоедините колонии iPSC с помощью стерильной пипетки объемом 10 мл один раз. Не пипетка вверх и вниз, так как это может разбить комки клеток на отдельные клетки.
- Перенесите содержимое каждой скважины в две отдельные скважины в 6-луночной плите с матричным покрытием (2 мл на скважину в 6-луночной плите) и инкубируйте при 37 °C. Не создавайте пузырьков в суспензии во время пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно встряхните тарелку, прежде чем держать ее в инкубаторе. Коэффициент разделения может составлять от 1:2 (одна скважина на 2 новые скважины) до 1:4 (одна скважина на 4 новые скважины). - Заменяйте среднюю суточную до тех пор, пока колонии не достигнут 60% слияния с хорошими размерами и соединениями.
- Нейронная индукция и генерация нейронных предшественников
- Приготовьте 500 мл химически определенной среды (CDM), 500 мл нейронной индукционной среды (NIM) и 500 мл среды без сыворотки нервных стволовых клеток (NSC SF).
- Промыть ячейки DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине) и добавить NIM (3 мл на скважину в 6-луночную пластину). Настройте как День 0.
- Замените NIM (3 мл на скважину в 6-луночной пластине) на день 1, день 3 и день 4 и наблюдайте под микроскопией ежедневно.
- На 5-й день отделите нейронные розетки в культуру суспензии, как описано ниже.
- Один раз аккуратно вымойте DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине). Добавить коллагеназу IV (1 мл на лунку в 6-луночную пластину) и выдержать в инкубаторе 1 мин. Аспирировать коллагеназу IV и вымыть один раз DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) осторожно.
- Добавьте 2 мл NSC SF Medium на скважину в 6-луночную плиту. Отделите ячейки, соскребая дно скважин, рисуя сетки с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл.
- Соберите клеточную суспензию с 6-луночной пластины в 10-сантиметровую неприлипшную посуду. Увеличьте объем до 12 мл с помощью NSC SF Medium.
- Встряхните неадгезивную посуду со скоростью 65-85 об/мин на орбитальном шейкере в инкубаторе, чтобы предотвратить агрегацию.
- Дифференциация нейронов DA
- На 7-й день добавьте 12 мл CDM, дополненное 100 нг/мл фактора роста фибробластов-8b (FGF-8b), и поместите чашку на орбитальный шейкер в инкубаторе.
- На 8-13 день меняйте среду каждые 2 дня и ежедневно наблюдайте под микроскопией.
- На 14-й день добавьте 12 мл CDM, дополненного 100 нг/мл FGF-8b и 1 мкМ пурморфамина (PM). Поместите тарелку на орбитальный шейкер в инкубаторе.
- На 15-20 день меняйте среду каждые 2 дня и ежедневно наблюдайте за клетками под микроскопией.
- Механически проходите сферы, используя наконечники 1000 мкл, чтобы разбить большие сферы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение может быть 1:2 (одно блюдо на 2 новых блюда).
- Прекращение дифференциации
- Покройте 6-луночную пластину или крышки поли-L-орнитином (PLO) и ламинином, как описано ниже.
- Покрыть 6-луночную пластину 1 мл ПЛО на лунку и инкубировать пластину при 37 °C в течение 20 мин. Аспирировать решение ООП.
- Стерилизуйте пластину под ультрафиолетом в течение 20 мин. Промывайте скважины дважды DPBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите).
- Добавьте в скважину 5 мкг/мл раствора ламинина (1 мл на скважину в 6-луночной пластине) и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч. Аспирировать ламинин и ненадолго промыть скважины DPBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите) один раз перед нанесением покрытия.
- Соберите все сферы (начиная с шага 1.5.5) в трубки по 50 мл и дополните DPBS (1x). Отжимать при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
- Инкубировать с 2 мл реагента диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °С на водяной бане с последующим мягким тритурированием пипеткой 200 мкл (в 20-50 раз в зависимости от размера сфер, избегая образования пузырьков).
- Нейтрализуют реагент диссоциации клеток 2 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и центрифугируют коническую трубку объемом 50 мл, содержащую клетки при 300 × г в течение 5 мин при RT. Аспирировать супернатант.
- Добавьте 1 мл CDM, дополненного 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и 10 нг/мл нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеточных линий (GDNF), чтобы повторно суспендировать клеточные гранулы путем осторожного пипетирования вверх и вниз для получения одноклеточных суспензий.
- Аспирировать раствор ламинина с пластины (стадия 1.6.1.3), ненадолго промыть DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и засеять клетки (со стадии 1.6.5) в предварительно покрытые пластины или крышки в 3 мл CDM, дополненных 10 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF. Кормите клетки каждые 4 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация культур может сохраняться в течение многих недель до 3 месяцев. Нейронная морфология обычно появляется через 2 недели после прекращения и может быть использована для последующего анализа с этого момента. BDNF и GDNF не нужны для культивирования для более длительного обслуживания (до 2 месяцев).
- Покройте 6-луночную пластину или крышки поли-L-орнитином (PLO) и ламинином, как описано ниже.
- Генерация НСК
- Покрытие матричных пластин.
- Соберите все нейронные сферы (сгенерированные из шага 1.4) в трубки по 50 мл и пополните DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free). Открутить при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать супернатанты.
- Инкубируют гранулы с 2 мл клеточного диссоциационного реагента в течение 10 мин при 37 °С на водяной бане с последующим мягким тритурированием пипеткой 200 мкл (в 20-50 раз в зависимости от размера сфер, избегая образования пузырьков).
- Нейтрализуют 2 мл ДМЭМ с 10% ФБС и центрифугируют конические трубки объемом 50 мл, содержащие клетки при 300 × г в течение 5 мин при РТ. Аспирация супернатантов. Повторное суспендирование клеточных гранул путем осторожного пипетирования вверх и вниз для получения одноэлементных суспензий.
- Аспирировать матричный раствор из предварительно покрытой пластины и засеять клетки в предварительно покрытые пластины в NSC SF Medium (3 мл на скважину в 6-луночной пластине). Подкармливайте клетки каждые 2-3 дня и расщепляйте клетки при слиянии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, НСК могут быть расширены и заморожены.
- Дифференциация астроцитов глии
- Дифференцировка астроцитов от НСК
- Приготовьте 500 мл среды дифференцировки астроцитов.
- Семена НСК на пластинах/крышках с покрытием из поли-D-лизина (PDL) со средой NSC SF.
- На следующий день промыть клетки DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и добавить среду дифференцировки астроцитов (3 мл на скважину в 6-луночной пластине). Настройте как День 0.
- Ежедневно наблюдают за НСК под микроскопом и заменяют среду дифференцировки астроцитов (3 мл на лунку в 6-луночной пластине) каждые 2 дня с 1 по 27 дни.
- Созревание астроцитов
- Готовят среду созревания астроцитов.
- На 28-й день промыть клетки DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и добавить среду созревания астроцитов (3 мл на скважину в 6-луночной пластине).
- На 29 день и далее ежедневно наблюдайте за клетками под микроскопом и заменяйте среду созревания астроцитов (3 мл на лунку в 6-луночной пластине) каждые 2 дня.
- После одного месяца созревания расширьте клетки и криоконсервируйте их с этой стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе количество клеток увеличится. При расщеплении клеток для культивирования не нужны покрытые PDL чехлы.
- Дифференцировка астроцитов от НСК
2. Характеристика клеток иммуноцитохимией и иммунофлуоресцентным окрашиванием
- В конце периода культивирования переложите покровы с клетками на 12-луночную пластину.
Промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (1x) два раза и инкубировать в течение 10 мин в 4% параформальдегиде (PFA) (0,5 мл на лунку в 12-луночной пластине) на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированный образец может быть покрыт 2 мл PBS (1x) и храниться при 4 °C до тех пор, пока не потребуется иммуноокрашивание. PFA токсичен и подозревается в возникновении рака. Предотвращайте воздействие на кожу и глаза и работайте под химическим дымом. - Блокируют и проникают клетки и инкубируют блокирующим буфером, содержащим PBS (1x), 0,3% Triton X-100 и 10% нормальную козью сыворотку в течение 1 ч при RT.
- Инкубировать с первичными антителами в блокирующем буфере в течение ночи при 4 °C: окрашивать иПСК с антиоктамер-связывающим фактором транскрипции 4 (Oct4) и антистадийным эмбриональным антигеном-4 (SSEA4), НСК с анти-определяющей пол областью Y box-2 (Sox2) и анти-Nestin, нервные сферы с антипарным боксом-6 (Pax6) и анти-Nestin, астроциты с антиглиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) и анти-S100 кальций-связывающим белковым β (S100β) и нейроны DA с антитирозингидроксилазой (TH), анти-β III тубулин (Tuj 1), анти-синаптофизин и анти-PSD-95 (0,5 мл раствора первичного антитела на лунку в 12-луночной пластине; см. Таблицу материалов для деталей).
- Промывайте образцы PBS (1x) три раза в течение 10 минут каждый с мягким раскачиванием.
- Инкубировать с раствором вторичных антител (1:800 в блокирующем буфере, 0,5 мл раствора вторичных антител Alexa Fluor на лунку в 12-луночной пластине) в течение 1 ч при РТ с мягким раскачиванием.
- Инкубируют клетки с Hoechst 33342 (1:5000, 0,5 мл на лунку в 12-луночной пластине) в PBS (1x) в течение 15 мин на RT для маркировки ядер.
- Установите клетки с монтажной средой и высушите в течение ночи в RT для визуализации под флуоресцентным микроскопом в темноте. Дополнительный рисунок S1 для настроек и параметров микроскопа.
3. Измерение проточной цитометрии митохондриального объема, MMP и митохондриального АФК в живых клетках
- Засейте клетки отдельно в 4 лунки в 6-луночную пластину, пока ячейки не достигнут 50-60% слияния. Обозначьте эти четыре скважины как # 1, # 2, # 3 и # 4.
- В конце периода культивирования готовят 5 отдельных окрашивающих растворов (500 мкл на лунку в 6-луночной пластине) следующим образом: No1 только культуральная среда (до скважины No1, содержащей только клетки для контроля); No2-1, содержащий FCCP (100 мкМ); No2-2, содержащий FCCP (100 мкМ) + TMRE (100 нМ) + МТГ (150 нМ) в питательной среде; No3, содержащий TMRE (100 нМ) + МТГ (150 нМ) в питательной среде; #4, содержащий MitoSox Red (10 мкМ) + MTG (150 нМ) в PBS (1x) с 10% FBS. См. Рисунок 1А, Дополнительная таблица S2 и Таблица материалов для получения подробной информации об этих соединениях и настройке проточной цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте культуральную среду для приготовления окрашивающего раствора. Разогрейте среду и PBS (1x) на RT перед использованием. FCCP токсичен; предотвращать воздействие на кожу и глаза и работать под химическим дымом. - Аспирируйте среду из лунки No2 и добавьте раствор No2-1 (только FCCP). Инкубировать клетки при 37 °C в течение 10 мин.
- Аспирировать среду из скважин No2 и No3 и добавить раствор No2-2 (FCCP + TMRE + MTG) в скважину No2 и раствор No3 (ПМРЭ + МТГ) в Луну No3. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 45 мин.
- Аспирировать среду из лунки No4 и добавить раствор No4 (MitoSox Red + MTG). Инкубируют клетки при 37 °C в течение 15 мин.
- Аспирировать среду из всех скважин. Промывайте PBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите). Отсоедините клетки с помощью 1 мл клеточного диссоциационного реагента (1 мл на лунку в 6-луночной пластине) при 37 °C в течение 5 мин. Нейтрализуют клеточный диссоциационный реагент в 1 мл DMEM с 10% FBS (2 мл на лунку в 6-луночной пластине).
- Соберите содержимое всех колодцев в конические трубки по 15 мл. Центрифугируйте пробирки по 300 × г в течение 5 мин. Вымойте гранулы PBS (1x) один или два раза.
- Аспирируйте супернатанты, но оставляйте примерно 100 мкл в пробирках. Повторное суспендирование клеточных гранул в 300 мкл PBS (1x). Перенесите клетки в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл. Держите трубки в темноте при RT.
- Анализируйте клетки с помощью проточного цитометра (с конфигурацией 3 синего и 1 красного лазера). Обнаружение MTG в фильтре 1 (FL1) с помощью полосового фильтра 530/30, TMRE в фильтре 2 (FL2) с помощью полосового фильтра 585/40 и MitoSox Red в фильтре 3 (FL3) с помощью полосового фильтра 510/580.
4. Измерение проточной цитометрии субъединиц комплекса MRC и TFAM в фиксированных клетках
- В конце периода культивирования отсоединяют клетки (~106) путем добавления реагента диссоциации клеток; затем гранулируют и собирают клетки в пробирку объемом 15 мл. Промыть ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин.
- Зафиксируйте клетки в 1,6% PFA (1 мл 1,6% PFA в пробирке 15 мл) на RT в течение 10 мин. Промыть ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин.
- Пермеабилизируйте клетки ледяным 90% метанолом (1 мл 90% метанола в пробирке 15 мл) при -20 °C в течение 20 мин.
- Блокируйте образцы в блокирующем буфере, содержащем 0,3 М глицина, 5% козьей сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) - фракцию V в PBS (1x) (1 мл блокирующего буфера в пробирке 15 мл). Промывайте ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды (как на этапе 3.7).
- Инкубируют клетки со следующими первичными антителами в течение 30 мин: анти-NDUFB10 (1:1000) для измерения субъединицы комплекса I, антисукцинатдегидрогеназного комплекса флавопротеиновая субъединица A (SDHA, 1:1000) для измерения субъединицы комплекса II и анти-ЦОГ IV (1:1000) для измерения комплексной IV субъединицы и анти-TFAM антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 488 (1:400). Окрашивают такое же количество клеток отдельно антителом против TOMM20, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:400) в течение 30 мин (1 мл раствора первичного антитела в пробирке объемом 15 мл; подробнее об антителах см. Таблицу материалов ).
- Промыть ячейки PBS (1x) однократно с центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Добавьте вторичное антитело (1:400) в пробирки NDUFB10, SDHA и COX IV и инкубируйте клетки этими растворами в течение 30 мин.
- Промывайте ячейки PBS (1x) однократно центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатанты, оставляя примерно 100 мкл в пробирках. Повторное суспендирование клеточных гранул в 300 мкл PBS (1x). Переложите клетки в 1,5 мл микроцентрифужных трубок, хранящихся в темноте на льду.
- Проанализируйте клетки на проточном цитометре (с конфигурацией 3 синих и 1 красный лазер). Обнаружение сигналов в фильтре 1 (FL1) с помощью полосового фильтра 530/30. Дополнительный рисунок S2 для настроек и параметров микроскопа.
5. Сбор и анализ проточной цитометрии
- Используйте неокрашенную контрольную трубку для установки диаграмм рассеяния прямого рассеяния (FSC-A) и области бокового рассеяния (SSC-A) на основе размера и сложности анализируемой популяции клеток. Дополнительный рисунок S2 для настроек и параметров микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка неокрашенных элементов управления для отдельных типов клеток. - Используйте непятнистые контрольные трубки для выбора положительных затворов и используйте одноцветные управляющие трубки для компенсации флуоресцентного спектрального перекрытия между MTG (флуорофор-1 [FL-1]) и TMRE (FL-2) в многоцветной проточной цитометрии. Используйте контроль изотипов для отрицательного контроля для мониторинга фонового окрашивания в образцах MRC и TFAM. Используйте трубку FCCP в качестве деполяризационного контроля для окрашивания TMRE.
- Выгоните посторонний мусор для отбора живых клеток и основного затвора с передней и боковой диаграммы рассеяния (рисунок 2А). Выгоняйте дублеты, используя график плотности прямого рассеяния (FSC-H) против (vs.) FSC-A для исключения дублетов, а также построения боковой высоты рассеяния (SSC-H) против графика SSC-A (рисунок 2A).
- Сбор данных (проточный цитометр)
- Используя неокрашенные или изотипные образцы в качестве отрицательного элемента управления, создайте затвор над основной популяцией одноклеточных событий при просмотре SSC-A и различных фильтров (FL1, FL2, FL3, FL4) (рисунок 1B и рисунок 2B).
- Анализ данных (программное обеспечение CFlow)
- Скопируйте положение затворов на образцы окрашенных клеток и запишите количество положительно окрашенных клеток для положительного окрашивания.
- Для каждой подпопуляции клеток выберите график гистограммы и проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) различных каналов фильтра (FL1, FL2, FL3, FL4) (ось X).
- Рассчитайте уровни TMRE, вычитая MFI FL2 клеток, обработанных FCCP, из MFI FL2 из образцов, окрашенных #3 TMRE, в гистограмме, как в Eq (1) ниже.
Уровни TMRE = MFI FL2 из образцов, окрашенных #3 TMRE - MFI FL2 клеток, обработанных FCCP #2 (1) - Рассчитайте конкретные значения для MMP и митохондриальной АФК по MFI в TMRE или MitoSox Red, разделив индикатор объема митохондрий MTG.
- Рассчитайте конкретное значение для сложной субъединицы и TFAM с помощью MFI в комплексном выражении или TFAM, разделив индикатор объема митохондрий TOMM20.
- Рассчитайте уровни TMRE, вычитая MFI FL2 клеток, обработанных FCCP, из MFI FL2 из образцов, окрашенных #3 TMRE, в гистограмме, как в Eq (1) ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематическое описание метода дифференциации и цитометрических стратегий потока показано на рисунке 3. Человеческие ИПСК дифференцируются в нейронные розетки, а затем поднимаются в культуру суспензии для дифференциации в нейронные сферы. Нейронные сферы далее дифференцируются и созревают в нейроны DA. Нервные сферы диссоциируются на отдельные клетки для генерации глиальных астроцитов, перестраиваются в монослои в виде НСК, а затем дифференцируются в астроциты. Этот протокол предоставляет стратегии, необходимые для получения и анализа образцов с помощью проточной цитометрии для измерения MMP, объема митохондрий, уровней митохондриальной АФК, уровней экспрессии комплексных субъединиц MRC и TFAM (косвенное измерение относительного числа копий мтДНК). В частности, совместное окрашивание с флуоресцентными репортерами, TMRE и MTG, использовалось для обнаружения и количественной оценки изменений в MMP и митохондриальном объеме. Совместное окрашивание с MitoSox Red и MTG позволяет измерять выработку митохондриального АФК в живых клетках. Окрашивание антителами против субъединиц комплекса MRC вместе с TOMM20 позволяет оценить MRC и окрашивание TFAM и TOMM20 для косвенной оценки номера копии мтДНК. Важно отметить, что MTG и TOMM20 позволяют измерять на митохондриальный объем, противодействуя влиянию митохондриального объема на эти параметры.
Нейроны DA генерируются из иПСК посредством двойного ингибирования SMAD и подвергаются воздействию FGF-8b и агониста PM Sonic hedgehog (SHH), как показано на рисунке 4A. Человеческие ИПСК высеваются в культуральную среду iPSC на пластинах с матричным покрытием. Когда клетки достигают 50%-80% конфлюентности, среду изменяют на NIM с использованием CDM, дополненного SB431542, ингибитором AMPK, соединением C и N-ацетилцистеином в течение 5 дней. Через 5 дней ИПСК (Рисунок 4В, а) прогрессируют до нейронной эпителиальной стадии, демонстрируя четкие нейронные розетки (Рисунок 4В, б). На 5-й день нейронные сферы генерируются путем подъема нейронного эпителия в культуру суспензии и культивирования их в среде NSC SF на орбитальном шейкере внутри инкубатора. Круглые, четко определенные сферы показаны на рисунке 4B, c. На 7-й день среда превращается в CDM, дополненную 100 нг/мл FGF-8b. На 14-й день среда превращается в МЧР, дополненную 100 нг/мл FGF-8b и 1 мкМ ТЧ. На 21-й день сферы диссоциируют на нейроны DA в монослое, диссоциируя их на отдельные клетки и культивируя их в CDM, дополненном 10 нг / мл BDNF и 10 нг / мл GDNF в PLO и пластинах / покровах, покрытых ламинином. Нейроны (рисунок 4B, e), созревшие в течение 15-30 дней, в дальнейшем используются для митохондриальных функциональных измерений.
НСК продуцируются путем диссоциации нервных сфер на отдельные клетки, а затем перекладывания их в монослои для генерации астроцитов. Эти НСК демонстрируют классический внешний вид нейронного предшественника (рисунок 4B, d). НСК на данном этапе могут быть легко расширены и зарезервированы для дальнейшего использования. Чтобы инициировать дифференцировку астроцитов, НСК наносят на покрытые PDL покровные листы в среде NSC SF. На следующий день среда превращается в среду дифференцировки астроцитов в течение 28 дней. Через 28 дней дифференцированные астроциты далее созревают в среде созревания астроцитов. На этом этапе астроциты должны демонстрировать звездообразную морфологию (рисунок 4B, f), и эти клетки могут быть расширены и сохранены для дальнейшего использования, включая митохондриальную функциональную оценку.
Во время дифференцировки идентичность клеток подтверждается с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. На рисунке 5А иммуноокрашивание показывает, что иПСК экспрессируют специфические плюрипотентные маркеры, SSEA4 и Oct4. Рисунок 5B показывает, что нейронные сферы демонстрируют положительное окрашивание Nestin и Pax6, в то время как Рисунок 5C показывает, что NSC, полученные из iPSC, в монослоях демонстрируют положительное окрашивание Nestin и Sox2. Для идентификации нейронов DA клетки окрашивают нейронным маркером β III Tubulin (Tuj 1) и нейронным маркером DA тирозингидроксилазой (TH) (рисунок 6B). Кроме того, нейроны DA показывают окрашивание для синаптических маркеров, синаптофизина и PSD-95, подтверждая их функциональные синаптические связи (рисунок 5B). Иммуноокрашивание астроцитов, полученных из iPSC, показывает экспрессию маркеров астроцитов, глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и кальций-связывающего белка S100 β (S100β).
Исследование митохондриальной функции в дифференцированных нейронах и астроцитах с помощью проточной цитометрии выполняется, как описано выше в разделах протокола 3 и 4. Для сбора данных использовался проточный цитометр, а для анализа данных — CFlow Sampler, как показано на рисунке 1B.
На рисунке 2 показан метод измельчения живых одиночных ячеек. Мертвые клетки и клеточный мусор исключаются с помощью графика FSC против SSC (рисунок 2A, a). Дублеты ячеек исключаются с использованием графика FSC-H против FSC-A (рисунок 2A, b), за которым следует график SSC-H против SSC-A (рисунок 2A, c). Фоновая флуоресценция должным образом оценивается, если отрицательная популяция определенного типа клеток сравнивается с положительной популяцией в пределах этого же типа клеток (рисунок 2B, a). Для образцов MMP обработка клеток FCCP устраняет помехи от потенциала митохондриальной мембраны и окрашивания TMRE (рисунок 2B, b).
Эти проточные цитометрические подходы были использованы для изучения нейронов DA, генерируемых человеческими ИПСК, несущими мутацию (мутации) в каталитической субъединице митохондриальной ДНК-полимеразы, POLG (W748S), и сравнения их с образцами без болезней, полученными из фибробластов Детройта 551. Как сообщалось ранее4, это исследование также продемонстрировало снижение MMP и увеличение специфических уровней митохондриального ROS в нейронах POLG DA (рисунок 7). Тем не менее, объем митохондрий, общий MMP и общий уровень митохондриальной АФК остались неизменными. На рисунке 8 результаты показывают снижение конкретных сложных уровней I, более низкие общие и специфические уровни TFAM, но аналогичные специфические уровни комплекса II в мутантных нейронах DA по сравнению с контрольной группой.
Этот подход также использовался для изучения астроцитов, генерируемых из тех же линий iPSC. Как сообщалось ранее7 и показано на рисунке 9, результаты показывают, что POLG-мутированные астроциты имели более низкий общий и специфический MMP, но аналогичный объем митохондрий и митохондриальный АФК по сравнению с контрольной группой, а также снижение уровня специфических комплексов I и IV (рисунок 10). Однако не было никаких изменений в общих уровнях комплексов I и IV и не было изменений в общих и специфических уровнях комплекса II в астроцитах POLG. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что проточный цитометрический анализ множественных митохондриальных параметров обеспечивает приближение первого шага, которое ценно при оценке митохондриальной функции в клетках, таких как иПСК и их нейронные и глиальные производные.
Рисунок 1: Установка для проточной цитометрии. (A) MMP, митохондриальный объем и окрашивание митохондриальной АФК; (B) пример сбора данных в проточном цитометре C6. Сокращения: MMP = митохондриальный мембранный потенциал; АФК = активные формы кислорода; FCCP = карбонильный цианид р-трифторметоксифенилгидразон; TMRE = тетраметилродамин этиловый эфир; MTG = MitoTracker Зеленый. Также см. дополнительную таблицу S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегии сбора данных. (A) Сбор данных; (B) гистограммы флуоресценции с окрашиванием MTG и TMRE в живых клетках. Сокращения: SSC-A = площадь бокового рассеяния; FSC-A = площадь прямого рассеяния; SSC-H = высота бокового рассеяния; FSC-H = высота прямого рассеяния; FL#-A = флуорофор # площадь; MTG = MitoTracker Зеленый; FCCP = карбонильный цианид р-трифторметоксифенилгидразон; TMRE = тетраметилродамин этиловый эфир. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схематическое представление рабочего процесса протокола. Сокращения: DA = дофаминергический; MMP = митохондриальный мембранный потенциал; АФК = активные формы кислорода; NDUFB 10 = NADH: субъединица 10 убихиноноксидоредуктазы; SDHA = сукцинатдегидрогеназный комплекс флавопротеиновой субъединицы А; ЦОГ IV = комплекс цитохром с оксидазы IV; мтДНК = митохондриальная ДНК; TFAM = митохондриальный транскрипционный фактор A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: дифференцировка iPSC. (A) Блок-схема и (B) репрезентативные изображения для клеток с разных стадий дифференцировки, включая iPSCs (a), нейронную розетку (b), нейронные сферы (c), NSC (d), нейроны DA (e) и астроциты (f). Шкала стержней = 25 мкм. Сокращения: iPSC = индуцированная плюрипотентная стволовая клетка; NSC = нервные стволовые клетки; DA = дофаминергический; SFM = среда без сыворотки; CDM = химически определенная среда; FGF-8b = фактор роста фибробластов-8b; ТЧ = пурморфамин; BDNF = нейротрофический фактор, полученный из мозга; GDNF = нейротрофический фактор, полученный из глиальной клеточной линии; PLO = поли-L-орнитин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные конфокальные изображения ИПСК и их нейронных производных. (A) Иммуноокрашивание SSEA4 (красный) и Oct4 (зеленый) в IPSCs. (B) Иммуноокрашивание Нестина (красный) и Pax6 (зеленый) в нейронных сферах, полученных из iPSC. (C) Иммуноокрашивание Nestin (красный) и Sox2 (зеленый) в NSC, полученных из iPSC. Ядра окрашиваются DAPI (синий). Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: iPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; NSC = нервные стволовые клетки; SSEA4 = стадийно-специфический эмбриональный антиген-4; Oct4 = октамер-связывающий транскрипционный фактор 4; Pax6 = парная коробка-6; Sox2 = определяющая пол область Y box-2; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Репрезентативные конфокальные изображения астроцитов, полученных из iPSC, и нейронов DA. (A) Иммуноокрашивание GFAP (красный) и S100β (зеленый) в астроцитах, полученных из iPSC. (B) Иммуноокрашивание маркера нейронной линии TH (зеленый), Tuj 1 (красный) и нейронного функционального маркера Synaptophysin (зеленый) и PSD-95 (красный) в нейронах DA, полученных из iPSC. Ядра окрашиваются DAPI (синим цветом). Шкала стержней = 25 мкм. Сокращения: iPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; S100β = S100 кальций-связывающий белок β; Тудж 1 = β III Тубулин; PSD-95 = белок постсинаптической плотности 95; DA = дофаминергический; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Проточный цитометрический анализ нейронов DA, полученный из одного клона ИПСК пациента POLG и одного клона контрольных ИПСК Detroit 551. (A) Объем митохондрий, измеренный MTG, (B) общий MMP, измеренный TMRE, (C) специфический уровень MMP, рассчитанный по общему TMRE / MTG, (D) общий митохондриальный АФК, измеренный MitoSox Red, и (E) ) специфический уровень митохондриальной АФК, рассчитанный по общему количеству MitoSox Red/MTG. Данные представлены как средние ± стандартной погрешности среднего (SEM) для числа образцов (n ≥ 3 на клон). Данные анализируются и производятся с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Тест Mann-Whitney U использовался для оценки статистической значимости переменных. Значение обозначается для P < 0,05. *P < 0,05; ns, не значительный. Сокращения: DA = дофаминергический; POLG = СУБЪЕДИНИЦА ДНК-полимеразы гамма; iPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; MMP = митохондриальный мембранный потенциал; АФК = активные формы кислорода; MTG = MitoTracker Зеленый; TMRE = тетраметилродамин этиловый эфир. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Проточный цитометрический анализ астроцитов, полученных из одного клона ИПСК пациента POLG и одного клона контрольных иПСК Detroit 551. (A) Митохондриальный объем, измеренный MTG, (B) общий MMP, измеренный TMRE, (C) специфический уровень MMP, рассчитанный по общему TMRE / MTG, (D) общий Rmitochondrial ROS S, измеренный MitoSox Red, и (E) ) специфический уровень митохондриальной АФК, рассчитанный по общему количеству MitoSox Red/MTG. Данные представлены как средние ± стандартной погрешности среднего (SEM) для числа образцов (n ≥ 3 на клон). Данные анализируются и производятся с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Тест Mann-Whitney U использовался для оценки статистической значимости переменных. Значение обозначается для P < 0,05. *P < 0,05; ns, не значительный. Сокращения: POLG = СУБЪЕДИНИЦА ДНК-полимеразы гамма; iPSC = индуцированная плюрипотентная стволовая клетка; MMP = митохондриальный мембранный потенциал; АФК = активные формы кислорода; MTG = MitoTracker Зеленый; TMRE = тетраметилродамин этиловый эфир. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Проточный цитометрический анализ нейронов DA, полученный из одного клона ИПСК пациента POLG и одного клона контрольных ИПСК Детройта 551. (A) Общий комплекс I, измеренный NDUFB10, (B) конкретный комплексный I уровень, рассчитанный по общему NDUFB10/TOMM20, (C) общий комплекс II, измеренный SDHA, (D) конкретный уровень комплекса II, рассчитанный по общему уровню SDHA/TOMM20, (E) общий TFAM, измеренный TFAM, и (F) конкретный уровень TFAM, рассчитанный по общему TFAM/TOMM20. Данные, представленные как средние ± стандартной погрешности среднего значения (SEM) для числа выборок (n ≥ 3 на клон). Данные анализируются и производятся с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Тест Манна-Уитни U используется для оценки статистической значимости переменных. Значение обозначается для P < 0,05. *P < 0,05; ns, не значительный. Сокращения: DA = дофаминергический; POLG = СУБЪЕДИНИЦА ДНК-полимеразы гамма; iPSC = индуцированная плюрипотентная стволовая клетка; NDUFB10 = NADH: субъединица убихиноноксидоредуктазы 10; TOMM20 = транслоказ наружной митохондриальной мембраны 20; SDHA = сукцинатдегидрогеназный комплекс флавопротеиновой субъединицы А; TFAM = митохондриальный транскрипционный фактор A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Проточный цитометрический анализ астроцитов, полученных из одного клона ИПСК пациента с POLG и одного клона контрольных ИПСК Детройта 551. (A) Общий комплекс I, измеренный NDUFB10, (B) специфический комплексный I уровень, рассчитанный по общему уровню NDUFB10/TOMM20, (C) общий комплекс II, измеренный SDHA, (D) специфический комплексный II уровень, рассчитанный по общему уровню SDHA/TOMM20, (E) общий комплекс IV, измеренный ЦОГ IV, (F) специфический комплексный IV уровень, рассчитанный по ЦОГ IV/TOMM20, (G) общий TFAM, измеренный TFAM, и (H) конкретный уровень TFAM, рассчитанный по общему TFAM/TOMM20. Данные, представленные как средние ± стандартной погрешности среднего значения (SEM) для числа выборок (n ≥ 3 на клон). Данные анализируются и производятся с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Тест Mann-Whitney U использовался для оценки статистической значимости переменных. Значение обозначается для P < 0,05. *P < 0,05; ** P < 0,01; ns, не значительный. Сокращения: POLG = СУБЪЕДИНИЦА ДНК-полимеразы гамма; iPSC = индуцированная плюрипотентная стволовая клетка; NDUFB10 = NADH: субъединица убихиноноксидоредуктазы 10; TOMM20 = транслоказ наружной митохондриальной мембраны 20; SDHA = сукцинатдегидрогеназный комплекс флавопротеиновой субъединицы А; TFAM = фактор митохондриальной транскрипции А; ЦОГ IV = комплекс цитохром-с-оксидазы IV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Настройки конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа и шаги для получения изображений. (A) Выберите инструмент «Конфигурация » и выберите правильный тип лазера из текущего доступного лазера и установите его мощность. (B) Выберите режим Acquire-Acquisition Mode-SEQ и выберите соответствующий фоторежим флуоресцентной длины волны из базы данных. (C) Выберите Последовательное сканирование-загрузка и импорт соответствующего режима. (D) Выберите объектив 40x и добавьте по каплям. (E) Конкретные параметры настройки для съемки фотографий на различных длинах волн. (F) Задайте параметры фотографии, просмотрите и сохраните фотографию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Шаги и настройки для проточной цитометрии. (A) Откройте программное обеспечение Cflow, выберите инструмент «Файл» и выберите «Открыть файл или шаблон CFlow». (B) Установите 40000 событий и выберите ворота, содержащие только живые одиночные ячейки на панели «Ограничения выполнения ». Выберите «Средняя скорость» на панели Fluidics . (C) Выберите FSC-A и FSC-A участок (a) для настройки основного затвора. Выберите график FSC-A против FSC-H (b) и SSC-A против SSC-H ( c), чтобы исключить дублеты. Выберите соответствующие фильтры, такие как FL1 или FL2, и используйте график FL1-A против FSC-A (d) или график FL2-A против FSC-A для рисования положительных событий при запуске незапятнанных ячеек. (D) Установите те же параметры, просмотрите, запустите окрашенные образцы и сохраните фотографию. Также см. дополнительную таблицу S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица S1: Рецепты сред и растворов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица S2: Установка для проточного цитометрического окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлены протоколы для генерации нейронов и астроцитов, полученных из iPSC, и оценки нескольких аспектов функции митохондрий с использованием проточной цитометрии. Эти протоколы позволяют эффективно преобразовывать человеческие ИПСК как в нейроны, так и в глиальные астроциты и детально характеризовать митохондриальную функцию, в основном в живых клетках. Протоколы также обеспечивают стратегию совместного окрашивания проточной цитометрии для получения и анализа нескольких митохондриальных функций, включая объемные, MMP и митохондриальные уровни АФК в живых клетках и комплексах MRC и TFAM в фиксированных клетках. В частности, эти протоколы позволяют оценивать как общие, так и конкретные уровни на митохондриальный объем. Хотя эта стратегия обнаруживает митохондриальную дисфункцию при известном митохондриальном заболевании (POLG) в нейронах DA и астроцитах, эти методы применимы к любому типу клеток и заболеваний. Кроме того, протокол является надежным и воспроизводимым. Несколько предыдущих исследований успешно применяли этот протокол для анализа митохондриальных изменений в фибробластах, иПСК, НСК, нейронах DA и астроцитах 2,3,13,17.
Есть несколько критических моментов, которые следует учитывать при выполнении этого протокола. Для обеспечения последовательной и высокоэффективной дифференцировки крайне важно инициировать конверсию с помощью высококачественных ИПСК (клеток, содержащих <5% дифференцированных клеток). Хотя другие коммерчески доступные определенные среды могут быть действительными альтернативами, в этом исследовании не рассматривались альтернативы. Поскольку состав среды и клональные различия линий iPSC могут влиять как на пролиферацию исходной популяции клеток, так и на эффективность дифференцировки, адаптация этого протокола к другим поддерживающим средам, вероятно, потребует оптимизации.
Взаимосвязь между флуоресценцией MTG и MMP была изучена ранее3. Это важно, поскольку флуоресценция MTG, как сообщается, не зависит от18 и чувствительна к MMP19,20. В предыдущих исследованиях, в которых иПСК титровали с различными концентрациями TMRE и окрашивали 150 нМ МТГ, уровень МТГ оставался неизменным при более низких концентрациях TMRE (5-100 нМ), тогда как снижение сигнала МТГ наблюдалось для более высоких концентраций TMRE (более 100 нМ). Поэтому для измерения конкретного MMP были выбраны 100 нМ TMRE и 150 нМ MTG. Поскольку эта связь может быть специфичной для клетки, корреляция между флуоресценцией MTG и MMP должна быть оценена перед использованием двойного окрашивания MTG и TMRE для измерения MMP.
Плотность клеток также может влиять на функцию митохондрий и клеточный метаболизм. В этом исследовании наблюдались клеточно-зависимые изменения в MMP, что также было показано в других исследованиях21. Поэтому важно выбрать одинаковую плотность клеток во всех образцах - не слишком высокую или низкую - чтобы свести к минимуму вариации при создании протокола совместного окрашивания для разных типов клеток. По сравнению с другими анализами на основе микроскопии, проточная цитометрия имеет преимущества скорости и воспроизводимости при анализе большого количества клеток. При анализе микроскопических изображений предвзятость исследователей в определенной степени исказит результаты, что не является проблемой при использовании проточной цитометрии. Кроме того, анализ проточной цитометрии требует менее одного миллиона клеток, а анализ одного образца занимает всего несколько минут, а это значит, что десятки образцов могут быть проанализированы за 1-2 часа. Этот метод также может быть применен к широкому спектру типов клеток, в том числе от других нейродегенеративных заболеваний, и поэтому должен быть полезен для понимания механизмов и тестирования потенциальных терапевтических средств при различных нейродегенеративных заболеваниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы любезно благодарим Центр молекулярной визуализации и Центр проточной цитометрии в Университете Бергена в Норвегии. Эта работа была поддержана финансированием Норвежского исследовательского совета (номер гранта: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat и Китайского стипендиального совета (номер проекта: 201906220275).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers - SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
References
- Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
- Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
- Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583 (2019).
- Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
- Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
- Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
- Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
- Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
- Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
- Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
- Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
- Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
- Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
- Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).
