Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.
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Methodenartikel
Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Nachfrage nach dendritischen Zellen (DCs) steigt allmählich mit fortschreitender immunbiologischer Forschung. DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode zur Isolierung von DCs beinhaltet in erster Linie die Induktion der Knochenmarkdifferenzierung (BM) in DCs durch Injektion großer Dosen (>10 ng / ml) von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor / Interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), was das Verfahren komplex und teuer macht. In diesem Protokoll wurden unter Verwendung aller BM-Zellen, die in 10 ng / mL GM-CSF / IL-4-Medium kultiviert wurden, nach 3-4 Halbkulturaustausch bis zu 2,7 x 10 7 CD11c + -Zellen (DCs) pro Maus (zwei Oberschenkelknochen) mit einer Reinheit von 80% -95% geerntet. Nach 10 Tagen in Kultur nahm die Expression von CD11c, CD80 und MHC II zu, während die Anzahl der Zellen abnahm. Die Anzahl der Zellen erreichte nach 7 Tagen Kultur ihren Höhepunkt. Darüber hinaus dauerte diese Methode nur 10 Minuten, um alle Knochenmarkzellen zu ernten, und eine hohe Anzahl von DCs wurde nach 1 Woche Kultur erhalten.
Einleitung
Dendritische Zellen (DCs) sind die stärksten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zur Aktivierung naiver T-Zellen und zur Induktion spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) gegen Infektionskrankheiten, Allergieerkrankungen und Tumorzellen 1,2,3. DCs sind das primäre Bindeglied zwischen angeborener Immunität und adaptiver Immunität und spielen eine wesentliche Rolle bei der immunologischen Abwehr und der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz. In den letzten 40 Jahren haben viele Forscher versucht, die Untergruppen von DCs und ihre Funktionen bei Entzündungen un....
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Protokoll
Alle Verfahren wurden vom Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Isolierung des Knochenmarks und Präparation der BM-Zellen
- Opfern Sie C57BL/6-Mäuse (18-22 g, 6-8 Wochen alt) durch CO2 -Erstickung. Korrigieren Sie die Maus auf dem Operationstisch der Maus. Desinfizieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie die Haut des Beins ab, um die Muskeln und die Oberschenkelarterie freizulegen. Klemmen und reißen Sie die Oberschenkelarterie mit zwei Pinzetten ab und ziehen Sie dann das proximale Ende in Richtung Bauch.
HINWEIS: Schneiden Sie die Oberschenke....
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Ergebnisse
Die 1 x 10 7-1,7 x 107 Zellen wurden aus zwei Oberschenkelknochen extrahiert und in 24 ml Medium resuspendiert, bevor sie in eine 6-Well-Platte gepflanzt wurden (Abbildung 1A). Nach 2 Tagen wurden nicht adhärente Zellen durch vollständigen Wechsel des Kulturmediums entfernt. Vor dem Wechsel des Mediums wurde eine signifikante Anzahl von suspendierten Zellen beobachtet (Abbildung 1B). Nach 3 Tagen Kultur begannen sich kleinzellige Kolonien z.......
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Diskussion
Menschen und Mäuse haben unterschiedliche DC-Untergruppen, einschließlich klassischer DCs (cDCs, einschließlich cDC1s und cDC2s), plasmazytoider DCs (pDCs) und Monozyten-abgeleiteter DCs (MoDCs) 9,10,11. Es ist allgemein anerkannt, dass cDC1s zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) auf intrazelluläre Krankheitserreger und Krebs und cDC2s Immunantworten auf extrazelluläre Krankheitserreger, Parasiten und Allergene regulieren<.......
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Offenlegungen
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben und dass sie nichts offenzulegen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Programm des Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 und TJWJ202021QN034) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-Well-Platte | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Rekombinante Maus GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Rekombinante Maus IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (Anti-Maus CD16/32) Antikörper | Biolegend | 156603 |
Referenzen
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
