Summary
このプロトコルは、インビボでSARS-CoV-2感染を研究するために必要な二次的アプローチの必要性を克服するために、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるルシフェラーゼおよび蛍光発現組換え(r)SARS-CoV-2およびインビボイメージングシステム(IVIS)を用いたウイルス感染のダイナミクスを記述している。
Abstract
コロナウイルス病2019(COVID-19)のパンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされました。現在までに、SARS-CoV-2は世界中で2億4,200万人以上の感染と490万人以上の死亡の原因となっています。他のウイルスと同様に、SARS-CoV-2の研究には、感染細胞および/または動物モデルにおけるウイルスの存在を検出するための実験方法の使用が必要である。この制限を克服するために、我々は、生物発光(ナノルシフェラーゼ、Nluc)または蛍光(金星)タンパク質を発現する複製有能な組換え(r)SARS-CoV-2を作製した。これらのレポーター発現rSARS-CoV-2は、NlucおよびVenusレポーター遺伝子の発現に基づいて 、インビトロ および インビボでの ウイルス感染の追跡を可能にする。ここでの研究は、前述のK18ヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)トランスジェニックマウス感染モデルにおけるSARS-CoV-2感染を検出および追跡するためのrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusの使用を 、in vivo イメージングシステム(IVIS)を用いて説明する。このrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは 、生体内でrSARS-CoV-2/WT様の病原性およびウイルス複製を示す。重要なことに、NlucとVenusの発現により、感染したマウスのインビボ およびエクスビボでのウイルス感染を直接追跡することができます。これらのrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは、 生体内でSARS-CoV-2の生物学を研究し、ウイルス感染および関連するCOVID-19疾患を理解し、SARS-CoV-2感染と戦うための効果的な予防的および/または治療的治療法を特定するための優れた選択肢です。
Introduction
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、コロナウイルス科1のベータコロナウイルス系統に属するエンベロープ、ポジティブセンス、一本鎖RNAウイルスです。このウイルスファミリーは、アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタコロナウイルス1に分けられます。アルファコロナウイルスとベータコロナウイルスは主に哺乳類に感染しますが、ガンマコロナウイルスとデルタコロナウイルスはほぼ独占的に鳥類に感染します2。現在までに、7つのコロナウイルス(CoV)が種の障壁を越え、ヒトコロナウイルス(HCoV)として出現しました:2つのα-CoV(HCoV-229EおよびHCoV-NL63)と5つのβ-CoV(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、中東呼吸器症候群コロナウイルス[MERS-CoV]、およびSARS-CoV-2)3、4、5、6。SARS-CoV、MERS-CoV、およびSARS-CoV-2は高病原性であり、重度の下気道感染症を引き起こす7。SARS-CoV-2の出現に先立ち、CoVsによって引き起こされる2つの流行性アウトブレイクがありました:2002年から2003年にかけて、中国の広東省プロビデンスにおけるSARS-CoV、症例致死率(CFR)は約9.7%でした。2012年から現在までの中東のMERS-CoVは、CFRが約34%です7,8。SARS-CoV-2の全体的なCFRは3.4%〜49%で、基礎となる条件がより高いCFR 8,9に寄与しています。2019年12月に中国の武漢で発見されて以来、SARS-CoV-2は世界中で2億4,200万人以上のヒト感染と490万人以上の死亡の原因となっています7,10,11,12。特に、2020年後半以降、新しいSARS-CoV-2変異型(VoC)および関心のある変異型(VoI)は、感染および抗原性9,13、ならびにCOVID-19パンデミックの全体的な方向性を含むウイルス特性に影響を与えました。SARS-CoV-2感染症の治療のために、現在1つの米国(米国)しかありません。食品医薬品局(FDA)の治療用抗ウイルス薬(レムデシビル)および1種の緊急使用許可(EUA)薬(バリシチニブ、レムデシビルと組み合わせて投与される)14。また、6つの承認されたEUAモノクローナル抗体がある:REGEN-COV(カシリビマブおよびイムデビマブ、一緒に投与)、ソトロビマブ、トシリズマブ、およびバムラニビマブおよびエテセビマブを一緒に投与する15、16、17、18、19。現在、FDAが承認した予防ワクチンはファイザー・バイオNTechの1つしかなく、他の2つの予防ワクチン(モデルナとヤンセン)はEUAの承認を受けています20,21,22,23,24。しかし、制御不能な感染率とVoCとVoIの出現により、SARS-CoV-2は依然として人間の健康に脅威をもたらします。したがって、SARS-CoV-2感染と現在進行中のCOVID-19パンデミックを制御するための効率的な予防薬および治療法を特定するための新しいアプローチが緊急に必要とされています。
SARS-CoV-2を研究するには、感染細胞および/または感染の検証済み動物モデルにおけるウイルスの存在を特定するための面倒な技術および二次的アプローチが必要である。逆遺伝学の使用は、組換えウイルスの生成がウイルス感染の生物学における重要な質問に答えることを可能にした。例えば、リバースジェネティクス技術は、ウイルス感染、病因、および疾患のメカニズムを明らかにし、理解する手段を提供してきた。同様に、リバースジェネティクスのアプローチは、ウイルスの病因におけるそれらの寄与を理解するために、ウイルスタンパク質を欠く組換えウイルスを設計する道を開いた。さらに、ウイルス感染の治療のための予防的および/または治療的アプローチの同定を含む、in vitroおよびin vivo用途のためのレポーター遺伝子を発現する組換えウイルスを生成するために、リバースジェネティクス技術が使用されてきた。蛍光タンパク質および生物発光タンパク質は、その感度、安定性、および新技術の改善に基づく容易な検出のために、最も一般的に使用されるレポーター遺伝子である25,26。インビトロでは、蛍光タンパク質は感染細胞におけるウイルスの局在化のためのより良い選択肢として役立つことが示されているが、ルシフェラーゼは定量化研究にとってより便利である27、28、29。インビボでは、ルシフェラーゼは、全動物イメージングのための蛍光タンパク質よりも好ましいが、蛍光タンパク質は、感染細胞の同定またはエキソビボイメージング30、31、32のために好ましい。レポーター発現組換えウイルスの使用は、とりわけ、フラビウイルス、エンテロウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、アレナウイルス、およびインフルエンザウイルスを含む多くのファミリーにおけるウイルスの研究のための強力なツールとして役立ってきた28、33、34、35、36。
SARS-CoV-2を研究し、 生体内でのリアルタイムSARS-CoV-2感染を特徴付けるための二次的アプローチの必要性を克服するために、我々は、 大腸菌 において単一のコピーとして維持される前述の細菌人工染色体(BAC)ベースの逆遺伝学を使用して、生物発光(ナノルシフェラーゼ、Nluc)または蛍光(金星)タンパク質を発現する複製能を有する組換え(r)SARS-CoV-2を生成した。 細菌におけるその増殖中のウイルス配列の毒性を最小限に抑えるために37、38。特に、rSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは 、生体内でrSARS-CoV-2/WT様の病原性を示した。rSARS-CoV-2/Venusからの高レベルの金星発現により、 in vivo イメージングシステム(IVIS)を用いて、感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの肺におけるウイルス感染を検出することができました39。金星発現のレベルは、肺で検出されたウイルス力価とよく相関し、SARS-CoV-2感染の有効な代理として金星発現を使用することの実現可能性を実証した。rSARS-CoV-2/Nlucを用いて、我々はウイルス感染のダイナミクスをリアルタイムで追跡し、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおける同じIVISアプローチを用いて 、インビボでの SARS-CoV-2感染を縦断的に評価することができた。
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Protocol
K18 hACE2トランスジェニックマウスを含むプロトコルは、テキサス生物医学研究所(TBRI)の施設バイオセーフティ委員会(IBC)および施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。すべての実験は、National Research Council40の実験動物の世話と使用のためのガイドの勧告に従います。マウスを操作するときは、適切な個人用保護具(PPE)が必要です。
1. K18 hACE2トランスジェニックマウスの使用
- 4~6週齢の雌 B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/Jマウス(K18 hACE2トランスジェニックマウス)を購入し、特定の病原体のない条件下でバイオセーフティレベル(BSL)-2動物飼育施設で維持する。
- BSL2施設に到着した後、動物を7日間順応させ、感染やその他の実験手順のためにBSL-3動物施設に移します。
- IACUCプロトコルに従って、ケージあたり4匹のマウスを配置する。動物が死亡していることを確認するために、マウスがrSARS-CoV-2および インビボ イメージングに感染した後、致死量のFatal-Plus(>100mg / kg)で動物を安楽死させる。
2. バイオセーフティ
注:この原稿では、rSARS-CoV-2は、前述のように、SARS-CoV-2 USA-WA1/2020株のBACベースの逆遺伝システムを使用して生成されています37。rSARS-CoV-2/NlucまたはrSARS-CoV-2/Venus感染を含むすべての インビボ 処置は、BSL-3条件下で生物学的安全キャビネット内で行わなければならない。
- バイオセーフティキャビネットを2%ウェキシサイドと70%エタノール消毒剤で順番に洗浄し、この記事に記載されているすべての実験手順を実行する前と後に清掃します。
- 使用前後にすべての解剖材料(はさみ、解剖鉗子など)とホモジナイザーを滅菌してください。
- 各使用前後に、製造元の指示に従って、隔離チャンバーを清掃し、MB10錠を使用して消毒してください。
- IBCおよびIACUCガイドラインに従った手順で生成されたすべての生物学的材料を廃棄します。
3. rSARS-CoV-2の インビボ 特性評価
- マウス感染症
- 雌の4〜6週齢のK18 hACE2トランスジェニックマウスを標識ケージに入れ、イヤーパンチコードを用いて各ケージ内のマウスを特定し、ケージあたり4匹のマウスを配置する。体重および生存のためにマウスの群を使用し、ウイルス滴定および画像化のために別の群の動物を使用する。
- 感染前に、生物発光シグナルを促進するために、胸乳首から鼠径乳首領域までの腹側のマウス胸部を剃る。
- 滅菌1xリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)を用いて、50μL の総容量で滅菌条件下で10個の5プラーク形成単位(PFU)/マウスを含むrSARS-CoV-2接種剤を調製する。
注:ウイルス希釈に使用するrSARS-CoV-2の量を、式で計算します:ウイルス必要=(マウスあたり105PFU /50μL)×最終容量)/ストックウイルス力価。 - ウイルス接種物を氷上で冷やしてください。
- 模擬感染マウス(PBS1倍)およびrSARS-CoV-2/WT感染マウスを内部対照として使用してください。偽感染マウスをrSARS-CoV-2感染マウスとは別のケージに入れる。
- 麻酔チャンバ内で5%イソフルランガス状鎮静を用いてマウスを麻酔し、3%イソフルランで維持する。
- 姿勢反応と右折反射が確認されたら、マウスを背側臥位に置きます。
- 人差し指と親指の間にマウスの首をしゃがみ込み、ピンキーの指で尾を手のひらに押し付けて動物を背側の位置に保持します。
- 50 μLのウイルス接種剤を含むピペットチップを鼻孔に入れ、溶液をゆっくりと排出する。ウイルス接種物が吸入され、接種物滴が消えるのを観察して逆流がないことを確認してください。
- rSARS-CoV-2/Nlucに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの生物発光モニタリング(図1 および 図2)
メモ: この実験は、回路図に従っており、 図 1 に示すウイルスを使用します。イソフルラン麻酔付着は、 インビボ イメージングシステム(IVIS)に必要である。必要な機器とシステムの詳細については、 材料表 を参照してください。- イメージングソフトウェアを起動してパラメータを設定し、画像モードをクリックして 生物発光にし、フィルターを開き、露出時間を自動に設定します。
- IVISマシンを初期化したら、バイオセーフティキャビネット内にマウスを隔離チャンバに入れます。マウスに5%濃度のイソフルランを誘導する。姿勢反応および右反射の喪失が確認されたら、3%イソフルランで維持する。
- マウスを麻酔したら、隔離チャンバーからマウスを取り出し、1x PBS(最終容量100μL/マウス)で1:10に希釈したルシフェラーゼ基質を25G針で後眼窩的に投与する。
- ルシフェラーゼ基質投与後、マウスを胸を上向きにし、鼻腔をマニホールドコーンの内側にして隔離チャンバに戻し、イメージング手順中に動物を麻酔し続けます。
- 絶縁チャンバをIVISマシンに移し、IVISイメージャのドアを閉じた後、ソフトウェアプログラムで [集録 ]を選択して初期化します(図2A)。
- 取得した生物発光画像を解析するには、ソフトウェアの ROI (関心領域)ツールを使用して正確な信号を指定し、磁束を測定します(図2B)。
- [測定]をクリックし、システムが光子の生物発光の評価を開始して、さまざまなパラメータによって提供される出力測定値に匹敵する絶対光子発光を提供するようにします。
- 感染後1日、2日、4日、6日後のマウスを画像化します。
- イメージング後、マウスをケージに戻す。
- rSARS-CoV-2/Venusに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスにおける蛍光解析(図3 および 図4)
注:この実験は、図3に示す回路 図およびrSARS-CoV-2に従う。必要な機器とシステムの詳細については、 材料表 を参照してください。- イメージングソフトウェアを起動してパラメータを設定し、励起(500nm)と発光フィルタ(530nm)を設定し、画像モードを 蛍光 にクリックし、露光時間を自動に設定します。
- 致死量のFatal-Plus(>100mg/kg)を用いてマウスを腹腔内に安楽死させる。安楽死後、切開部位を70%エタノールで消毒する。
- ピンセットを使用して、皮膚を引っ張り、胸骨から腹部まで切開し、はさみで側面から切開部を切開する。肺の血液量を最小限に抑え、イメージング中に高いバックグラウンド信号を避けるために肝静脈を切断します。
- はさみを使用して、胸骨を切断し、胸郭を開きます。次に、気管の端をハサミで切り取り、ピンセットで肺を取り除きます。
- 切除した肺を2mLの1x PBSを含む6ウェルプレートに入れ、すすぎ洗いして余分な血液を除去した。70%エタノールを使用してサンプル間の手術器具を消毒および洗浄することにより、サンプル間の汚染の可能性を最小限に抑えます。
- IVISマシンを初期化した後、肺を黒いトレイに入れ、組織を互いに分離する。
- トレイをバイオセーフティキャビネット内の隔離チャンバ内に置き、隔離チャンバをIVISに移します。ドアを閉じ、 Acquire をクリックしてイメージングシステムを開始します(図4A)。
- 蛍光を分析するには、ROIツールを利用し、個々の肺の周囲に ROI を描画します。各ROIを手動で測定し、与えられた平均放射効率値を使用し、模擬感染マウスの測定値から差し引いた(図4B)。
- イメージングが完了したら、組織を氷の上に置き、同日分析を行うか、ドライアイス凍結用のクライオチューブに入れて、後で処理するために -80 °C で保存します。
- rSARS-CoV-2/Nluc(図2A-C)およびrSARS-CoV-2/Venusに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの肺明視野イメージングおよび病理スコアリング(図4A-C)
- rSARS-CoV-2/Nluc、rSARS-CoV-2/WT、および模擬感染に感染したマウスの生物発光を画像化した後、マウスをケージに戻す。安楽死およびマウス肺の エクスビボ 明視野画像化を進める(図2A)。
- 感染マウスの肺の エクスビボ 蛍光を画像化した後、肺の明視野画像を撮影する(図4A)。
- ImageJを用いて肺表面の肉眼病変を分析する(図2C および 4C)。
- ImageJで解析する肺画像を開きます。
- ピクセルとcmの比率を計算し、 ストレート ツールを使用して、画像の実際の長さを測定します。
- 選択したら、[ >測定の分析] をクリックして、長さのピクセルの長さを計算します。
- [ 分析]>[スケールの設定] をクリックし、前のステップから計算した数値を入力します。
- フリーハンド選択ツールを使用して、肺表面全体を選択します。「分析>測定」をクリックして、総肺面積を測定します。
- 「 >選択を編集」>「反転」 をクリックして肺領域の残りの部分を選択し、Delete キーまたは Backspace キーを押して背景を削除します。
- 選択した領域を削除し、[ 画像]をクリックして[色のしきい値>調整]>します。
- 病的病変領域を選択するには、存在する鬱血および出血のレベルに応じて、 明るさ を最小(1〜50)および最大(50〜200)に調整する。
- 病理学的病変が選択されたら、閾値カラーパネルの下部にある 選択 をクリックし、次に病理学的領域を測定するために 分析>測定 をクリックする。
- 病理学的領域の%=(病理学的領域/総肺表面の測定)×100の式で肉眼的病変の割合を計算する。
- ウイルス滴定(図2Dおよび図4D)
- イメージング時に、マウスの安楽死を完了し、肺、脳、および鼻粘膜を採取する。
- 肺、脳、および鼻粘膜を別々の滅菌組織ホモジナイザーに入れ、1mLの冷たい1x PBSを加える。
- 21,500 x g で10分間遠心分離してサンプルを均質化し、細胞破片をペレット化します。上清を集めて新しい滅菌チューブに移し、ペレットを捨てます。
- ウイルス滴定が同日行われる場合は、上清を4°Cで保存する。 あるいは、ホモジナイズしたサンプルの上清を、後で評価されるまで-80°Cで凍結する。
- 組織ホモジネートから得られた上清を利用して10倍の段階希釈を行い、上清の各希釈液1mLでVero E6細胞のコンフルエント単層に感染させる(6ウェルプレート形式、1.2×106 細胞/ウェル、3連)。
- 加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで1時間ウイルスを吸着させます。
- ウイルス吸着後、1mLの1x PBSで細胞を洗浄し、加湿した5%CO2インキュベーター内で1%寒天を含む2mL の感染後培地中で37°Cで72時間インキュベートする。
- インキュベーション後、プレートを10%中性緩衝ホルマリン中で4°Cで24時間不活性化し、プレート全体が水没していることを確認する。
- BSL3からプレートを取り出し、1mLの1x PBSで細胞を3回洗浄し、1mLの0.5%Triton X-100で室温(RT)で10分間透過処理します。
- 1 mL の 2.5% ウシ血清アルブミン (BSA) を 1x PBS で 37°C で 1 時間ブロックし、続いて 1 mL の SARS-CoV ヌクレオカプシド (N) タンパク質交差反応性モノクローナル抗体 (1C7C7) を 1 mL の SARS-CoV ヌクレオカプシド (N) タンパク質交差反応性モノクローナル抗体 (1C7C7) で 1 mL インキュベートし、2.5% BSA で希釈して 37°C で 1 時間培養します。
- 1 mL の 1x PBS で細胞を 3 回洗浄し、ABC キットと DAB ペルオキシダーゼ基質キットを使用して、メーカーの指示に従ってプラークを発生させます。
- ウイルス力価をPFU/mLとして計算します。
注: PFU/mL = 希釈係数 x プラーク数 x (1 mL/接種剤量) の式で計算します。
- rSARS-CoV-2/Nlucに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの組織におけるNluc活性(図2E)
- メーカーの指示に従ってルシフェラーゼアッセイを使用して、mock、rSARS-CoV-2/WT、およびrSARS-CoV-2/Nluc感染K18 hACE2トランスジェニックマウスからの臓器ホモジネート中のNlucの存在を定量化します。
- 罹患率および死亡率の評価(図2F、Gおよび図4E、F)
- セクション3.1に記載されているように、4〜6週齢の雌K18 hACE2トランスジェニックマウスに、rSARS-CoV-2/WT、rSARS-CoV-2/Venus、rSARS-CoV-2/Nluc、または偽感染の105PFU を鼻腔内感染させる。
- 同時に12日間にわたってマウスをモニターおよび計量し、食物摂取による体重変動を最小限に抑えます。人道的なエンドポイントに到達してから初期体重の25%を失ったマウスを安楽死させ、これらのマウスがウイルス感染に屈したことに注意する。
- 12日後、ウイルス感染を生き延びたマウスを安楽死させ、体重変化および生存率の%を計算する。
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Representative Results
K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2/Nluc感染(図1 および図2)
図1Aは、インビボでの感染を評価するために使用されるrSARS-CoV-2/WT(上)およびrSARS-CoV-2/Nluc(下)の概略図を示す。図1Bは、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2/Nluc感染動態を評価するために適用された概略フローチャートを示す。生後4~6週齢の雌性K18 hACE2トランスジェニックマウス(N = 4)は、1x PBSに偽感染したか、または105PFUのrSARS-COV-2/WTまたはrSARS-CoV-2/Nlucに鼻腔内に感染させた。感染後1日目、2日目、4日目および6日目に、マウスを隔離チャンバを用いて鎮静し、次いでNluc基質を後眼窩的に注射した。単離チャンバを直ちにIVISおよびDuluc中に入れ、イメージングソフトウェアを用いてインビボで評価した。Nlucの発現は、rSARS-CoV-2/Nlucに感染したマウスでは容易に検出されたが、rSARS-CoV-2/WTに感染したマウス、または偽感染したマウスでは検出されなかった(図2A)。定量分析は、感染後の異なる日におけるNluc強度を示した(図2B)。rSARS-CoV-2/Nlucに感染したマウスの肺表面の肉眼病変は、rSARS-CoV-2/WT感染群の病変に匹敵するものであった(図2C)。最後に、マウスの臓器(肺、鼻のタービン酸塩、脳)をホモジナイズし、プラークアッセイ(PFU/mL)によってウイルス力価を決定し、Nluc活性を製造業者の指示に従ってルシフェラーゼアッセイを用いて測定した。プラークは、交差反応性SARS-CoV Nモノクローナル抗体1C7C7を用いた免疫染色により評価した。rSARS-CoV-2/Nluc感染マウスで検出されたウイルス力価は、感染後の異なる日にすべての臓器でrSARS-CoV-2/WTに感染したものと同等であった(図2D)。Nluc活性は、rSARS-CoV-2/Nluc感染マウスの臓器でのみ検出された(図2E)。偽感染マウスおよびウイルス感染マウスの別の群を、体重の変化(図2F)および生存率(図2G)について12日間モニターした。rSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/WTに感染したマウスは、体重の最大25%を失い、感染後7〜8日の間にすべてウイルス感染に屈した(図2F-G)。
K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2/金星感染(図3および図4)
図3Aは、エクスビボでの感染を評価するために使用されるrSARS−CoV−2/WT(上)およびrSARS−CoV−2/Nluc(下)の概略図を示す。図3Bは、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2/Venusダイナミクスを評価するために適用された概略フローチャートを示す。生後4~6週の雌性K18 hACE2トランスジェニックマウス(N=4/群)は、1x PBSに偽感染したか、またはrSARS-COV-2/WTまたはrSARS-CoV-2/金星の105PFUに鼻腔内に感染した。感染後1日目、2日目、4日目および6日目に、マウスを安楽死させ、それらの肺を切除し、IVISを用いてエクスビボで画像化した。金星発現は、rSARS-CoV-2/Venusに感染したマウスのすべての肺で容易に検出されたが、rSARS-CoV-2/WTに感染したマウス、または偽感染したマウスでは検出されなかった(図4A)。定量分析により、金星強度は感染後2日目にピークに達し、感染マウスの肺における感染の過程で減少することが示された(図4B)。肺表面の画像から、rSARS-CoV-2/Venusに感染したマウスの肉眼的病変がrSARS-CoV-2/WT感染マウスの病変に匹敵することが明らかになった(図4C)。最後に、マウスの臓器(肺、鼻嵌鉢酸塩、および脳)をホモジナイズし、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定し、SARS−CoV Nタンパク質交差反応性モノクローナル抗体1C7C7を用いた免疫染色によって評価した。rSARS-CoV-2/Venusの感染は、すべての臓器においてrSARS-CoV-2/WTに感染したマウスで観察されたものと同等のウイルス力価をもたらした(図4D)。偽感染マウスおよびウイルス感染マウスの別の群を、体重の変化(図4E)および生存率(図4F)について12日間モニターした。rSARS-CoV-2/VenusおよびrSARS-CoV-2/WTに感染したマウスは、体重の最大25%を失い、感染後9日目までにウイルス感染に屈し、生存率はなかった(図4E-4F)。
図1:K18 hACE2トランスジェニックマウスを用いた インビボでの rSARS-CoV-2/Nluc感染の評価。 (A) rSARS-CoV-2/WT(上)とrSARS-CoV-2/Nluc(下)の模式図。(b) インビボでのrSARS-CoV-2/Nlucの評価のための概略フローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2Nluc発現。 (A-B)4〜6週齢の雌性K18 hACE2トランスジェニックマウスは、1匹あたり105PFUを用いて、偽感染(N=4)またはrSARS-CoV-2/WT(N=4)またはrSARS-CoV-2/Nluc(N=4)に感染した。マウスを、感染後1日目、2日目、4日目および6日目に麻酔し、Nluc基質を眼窩後注射した後に麻酔した。(a)Naluc発現をin vivoイメージングシステム下で決定し、偽感染および感染マウスから肺を摘出し、感染後1日目、2日目、4日目および6日目に写真撮影した。(B)Nnuc強度を画像解析ソフトにより定量解析し、(C)肺表面の肉眼病変をImageJ(C)**P<0.01により定量解析した。(d)rSARS-CoV-2/WTおよびrSARS-CoV-2/Nlucに感染させたマウスの鼻甲介酸塩(左)、肺(中央)、および脳(右)におけるウイルス力価をプラークアッセイにより決定した。(e)鼻甲介類(左)、肺(中央)および脳(右)におけるNluc活性を、ルシフェラーゼマルチプレートリーダー下で測定した。ns、重要ではありません。模擬およびウイルス感染マウスを、(F)体重および(G)生存率の変化について12日間モニターした。すべてのデータは、各グループの平均±SDとして提示され、SPSS13.0(IBM)によって分析されます。0.05未満のP値(P<0.05)は統計的に有意であると考えられた。この図はYe C. et al.41から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:K18 hACE2トランスジェニックマウスを用いたインビボでのrSARS-CoV-2/Venus感染の評価(A)rSARS-CoV-2/WT(上)およびrSARS-CoV-2/Venus(下)の模式図。(B)生体内におけるrSARS-CoV-2/Venusの評価のための概略フローチャート。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:感染K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2/Venus発現。 (A-B)生後4~6週齢の雌性K18 hACE2トランスジェニックマウスは、rSARS-CoV-2/WT(N = 4)またはrSARS-CoV-2/Venus(N = 4)に偽感染(N = 4)または感染(105 PFU/マウス)した。肺は感染後1、2、4、および6日目に切除し、肺の画像は感染後1日目、2日目、4日目および6日目に撮影した。(A)静脈発現をIVIS下で評価し、(B)蛍光強度を画像解析ソフトにより定量的に解析し、(C)肺表面の肉眼病変をImageJにより定量解析した。**P < 0.01。(d)rSARS-CoV-2/WTおよびrSARS-CoV-2/Venusに感染したマウスの鼻甲介酸(左)、肺(中央)および脳(右)におけるウイルス力価をプラークアッセイにより決定した。ns、重要ではありません。モックおよびSARS-CoV-2感染マウスを、(E)体重減少および(F)生存について12日間モニターした。すべてのデータは、各グループの平均±SDとして提示され、SPSS13.0(IBM)によって分析されます。0.05未満のP値(P<0.05)は統計的に有意であると考えられた。この図はYe C. et al.41から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコールは、これらのrSARS-CoV-2発現レポーター遺伝子を使用して 、インビボでのウイルス感染を監視することの実現可能性を実証する。両方のレポーター発現組換えウイルスは、 インビボでSARS-CoV-2感染を研究するための優れたツールを提供する。記載された エクス ビボ(rSARS-CoV-2/Venus)および インビボ (rSARS-CoV-2/Nluc)イメージングシステムは、SARS-CoV-2感染のダイナミクス、ウイルス病因を理解し、ウイルス感染後の異なる時間に感染した細胞/臓器を同定するための優れた選択肢です。 エクス ビボ(rSARS-CoV-2/Venus)および インビボ (rSARS-CoV-2/Nluc)研究を実施するためには、正確で再現性のある感染症とrSARS-CoV-2/Nlucの適切な接種が顕著です。
rSARS-CoV-2/Nlucを用いてin vivo感染を研究する場合、IVIS下でのNlucの可視化を容易にするためにマウスを剃毛すべきである。また、Nlucの可視化のためにNluc基質を接種する必要もある。これには、高いNlucシグナルを保証するためにNluc基質の濃度および体積を決定するための実験的試験が必要な場合がある。rSARS-CoV-2/Venusを用いてエクスビボ感染を研究する場合、およびIVISを使用してマウス全体から直接金星を検出することには限界があるため、肺のエクスビボイメージングのみが金星発現の検出を可能にする。これは、異なる時間に安楽死させられるマウスのグループを有することを必要とする。これは、rSARS-CoV-2/Venusに必要な感染後の各時間で安楽死を必要とせずに、同じマウス群を感染後異なる日に画像化できるため、rSARS-CoV-2/Nlucに感染したマウスの状況に反している。rSARS-CoV-2/Nlucに対するrSARS-CoV-2/Venusの利点は、フローサイトメトリーとともに使用して、インフルエンザ(REF)で以前に説明したように、感染していない細胞から感染細胞を選別するだけで、SARS-CoV-2に感染している細胞の種類を特定できることです。我々のrSARS-CoV-2/VenusおよびrSARS-CoV-2/Nlucの重要な側面の1つは、いずれも弱毒化の徴候を示さずにインビトロおよびインビボでWT様増殖特性を示したことであり、感染マウス(rSARS-CoV-2/Venus)の肺におけるウイルス感染エクスビボおよびマウス全体におけるウイルス複製の動態(rSARS-CoV-2/Nluc)を非侵襲的縦断的in vivoイメージングを用いてモニタリングすることができる。
重要なことに、これらのレポーター発現rSARS-CoV-2/VenusおよびrSARS-CoV-2/Nlucは、SARS-CoV-2感染の治療のための鉛予防薬および/または治療薬の同定のための優れた選択肢を表す41。使用される異なる蛍光タンパク質(例えば、金星およびmCherry)を発現するレポーター発現rSARS-CoV-2の使用により、それらを二重蛍光アッセイにおいて組み合わせて、治療薬が2つのウイルスの感染を同時に、インビトロおよびまたはインビボで効率的に阻害できるかどうかを同定し、ウイルス感染、および病因を追跡することができる39。
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Disclosures
著者らは、この研究が、記載された研究に関連する商業的、財政的および非財政的、または個人的な利益相反がない場合に行われたことを宣言する。
Acknowledgments
私たちの研究所(テキサス生物医学研究所)のメンバーには、COVID-19パンデミックの間、私たちの施設を完全に運営し、安全に保つための努力に感謝したいと思います。また、制度バイオセーフティ委員会(IBC)とスペル(IACUC)が、時間効率の良い方法でプロトコルを見直してくれたことに感謝します。シナイ山のアイカーン医科大学のトーマス・モラン博士が、SARS-CoV交差反応性1C7C7ヌクレオカプシド(N)タンパク質モノクローナル抗体を提供してくれたことに感謝します。マルティネス・ソブリドの研究室におけるSARS-CoV-2の研究は現在、NIAID/NIH助成金RO1AI161363-01、RO1AI161175-01A1、およびR43AI165089-01によって支援されています。国防総省(DoD)はW81XWH2110095およびW81XWH2110103を付与します。精密治療のためのサンアントニオパートナーシップ;テキサス生物医学研究所フォーラム;サンアントニオのテキサス大学健康科学センター。サンアントニオ医療財団;NIAIDが資金提供するインフルエンザ研究・対応センター(CEIRR、契約番号75N93021C00014)であるインフルエンザ病因・伝播研究センター(CRIPT)による。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
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