Methodenartikel

Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll

DOI:

10.3791/63144

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19. Oktober 2021

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1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Drosophila melanogaster erwachsene Fliegen wurden ausgiebig als Modellorganismen verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die antimikrobiellen angeborenen Immunantworten des Wirts und mikrobiellen Infektionsstrategien zugrunde liegen. Um das Larvenstadium von D. melanogaster als zusätzliches oder alternatives Modellsystem zu fördern, wird eine Larveninjektionstechnik beschrieben.

Zusammenfassung

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Die Verwendung unkonventioneller Modelle zur Untersuchung der angeborenen Immunität und der Virulenz von Krankheitserregern bietet eine wertvolle Alternative zu Säugetiermodellen, die kostspielig sein und ethische Fragen aufwerfen können. Unkonventionelle Modelle sind notorisch billig, einfach zu handhaben und zu kultivieren und nehmen nicht viel Platz in Anspruch. Sie sind genetisch zugänglich und besitzen vollständige Genomsequenzen, und ihre Verwendung wirft keine ethischen Überlegungen auf. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster zum Beispiel hat großartige Einblicke in eine Vielzahl von Verhaltens-, Entwicklungs-, Stoffwechsel- und Immunitätsforschungen gegeben. Genauer gesagt, D. melanogaster erwachsene Fliegen und Larven besitzen mehrere angeborene Abwehrreaktionen, die mit Wirbeltieren geteilt werden. Die Mechanismen, die Immunantworten regulieren, wurden hauptsächlich durch genetische und molekulare Studien im D. melanogaster-Modell aufgedeckt. Hier wird eine neuartige Larveninjektionstechnik bereitgestellt, die die Untersuchung angeborener Immunprozesse in D. melanogaster-Larven weiter vorantreiben und die Pathogenese einer Vielzahl von mikrobiellen Infektionen erforschen wird.

Einleitung

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Drosophila melanogaster wird seit mehreren Jahrzehnten in der biologischen und biomedizinischen Forschung immens eingesetzt, da sich die ausgeklügelte Palette genetischer und molekularer Werkzeuge für die Analyse einer Vielzahl von Studien1,2,3,4 stetig weiterentwickelt hat. Die evolutionär konservierten Aspekte der Entwicklung, der Homöostase und der angeborenen Immunität bei D. melanogaster haben es zu einem wertvollen Modellorganismus für die Untersuchung verschiedener menschlicher und Insektenkrankheiten gemacht5,6. Insbesondere die grundlegende Rolle des D. melanogaster-Modells für die Untersuchung der Immunität wurde weitgehend in Studien mit erwachsenen Fliegen veranschaulicht. D. melanogaster Larvenstudien haben jedoch auch zum aktuellen Wissen beigetragen und hauptsächlich zelluläre Immunantworten untersucht, insbesondere für Wespen- und Nematodeninfektionen, die durch die Insektenkutikula auftreten7,8,9,10. Drosophila melanogaster Larven besitzen drei verschiedene Arten von Blutzellen, die zusammen Hämozyten genannt werden: Plasmatozyten, Kristallzellen und Lamellozyten11,12,13. Diese Zellen können eine Reihe von Immunantworten aufbauen, wenn D. melanogaster-Larven mit Krankheitserregern wie Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten infiziert sind14,15,16. Zu den zellulären Immunantworten gehören die direkte Verschlingung (Phagozytose) von kleinen Molekülen oder Bakterien, die Melanisierung, die Verkapselung größerer Krankheitserreger wie parasitoide Eier und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Stickstoffmonoxidsynthasen (NOS)17,18,19.

Im Gegensatz dazu wurden weniger Studien über die Verwendung des D. melanogaster-Larvenmodells zur Analyse humoraler Immunantworten veröffentlicht. Dies ist hauptsächlich auf die Anwendung von Fütterungsassays für die orale Infektion von D. melanogaster-Larven und mehrere Herausforderungen im Zusammenhang mit der Mikroinjektion von Larven zurückzuführen, einschließlich der präzisen Handhabung von Larven und der ordnungsgemäßen Verwendung der Mikronadel, insbesondere während der Penetration20,21. Daher haben das begrenzte Wissen über Larveninfektionen und technische Schwierigkeiten (d.h. hohe Mortalität) das Larvenmodell von D. melanogaster häufig schwierig gemacht. Ein Larvenmodell wird das Potenzial haben, neue molekulare Mechanismen zu identifizieren, die weitere Einblicke in Wirt-Pathogen-Interaktionen und die Induktion spezifischer angeborener Immunantworten des Wirts gegen pathogene Infektionen liefern werden.

Hier wird ein einfaches und effizientes Protokoll beschrieben, mit dem D. melanogaster-Larven verschiedene Krankheitserreger, wie z.B. Bakterien, injiziert werden können. Insbesondere D. melanogaster Larven werden für Injektionen mit dem humanpathogenen Photorhabdus asymbiotica und dem nicht-pathogenen Bakterium Escherichia coli verwendet. Diese Methode kann zur Manipulation und Analyse der Immunantwort von D. melanogaster auf verschiedene mikrobielle Infektionen eingesetzt werden.

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Protokoll

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1. Fliegenaufzucht

HINWEIS: Der Lebenszyklus von D. melanogaster ist in vier Stadien unterteilt: Embryo, Larve, Puppe und Erwachsener. Die Erzeugungszeit bei optimalen Aufzuchtbedingungen im Labor (~25 °C, 60% Luftfeuchtigkeit und ausreichend Nahrung) beträgt ca. 10 Tage vom befruchteten Ei bis zum geschlossenen Erwachsenen. Weibchen legen ~ 100 Embryonen pro Tag, und die Embryogenese dauert etwa 24 h22. Die Larven durchlaufen drei Entwicklungsstadien (Instars; L1-L3) in ~4 Tagen (L1 und L2: 24 h und L3: 48 h). Die Larven des ersten Stadiums beginnen sich sofort auf der Oberfläche des Mediums zu ernähren. Larven des zweiten Stadiums graben sich in das Medium ein, während Larven im dritten Stadium das Medium verlassen und die Fläschchenwände hinaufwandern, auf der Suche nach einem Ort zum Verpuppen für 24-48 h. Die D. melanogaster-Linie , die für dieses Protokoll verwendet wird, ist Oregon R (FBsn0000276).

  1. Fügen Sie Trockenfutter mit einer Maismehl-Soja-basierten Diät zu einer schmalen Polystyrol-Durchstechflasche (25 mm x 95 mm) hinzu, um 1/5 bis 2/5 Volumen zu erhalten. Dann fügen Sie 9 ml Wasser hinzu und lassen Sie die Durchstechflasche für 1 Minute sitzen, bis die Diät vollständig hydratisiert ist.
  2. Fügen Sie etwa 10 Granulate trockener Bäckerhefe in die Durchstechflasche hinzu und legen Sie eine Mischung aus mindestens 20 neu aufgetauchten männlichen und weiblichen erwachsenen Fliegen.
  3. Inkubieren Sie die Durchstechflasche bei 25 °C in einem 12:12-stündigen photoperiodischen Licht-, Dunkelzyklus.
  4. Um den Fortschritt des Lebenszyklus zu gewährleisten, überprüfen Sie die Fliegenfläschchen täglich und zeichnen Sie die anfänglichen Entwicklungsstadien auf.

2. Larvenauswahl für Infektionen

  1. Wählen Sie Larven mit einem feinen Pinsel aus (Kamelhaar ist am besten), sobald sie am Tag der Infektion das wandernde dritte Stadium erreicht haben (Abbildung 1).
  2. Die ausgewählten Larven werden mit Ringerlösung (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) in einer kleinen Petrischale (60 mm x 15 mm) nach Entnahme aus der Originaldurchstechflasche gewaschen23.
  3. Legen Sie die Larven auf Filterpapier (150 mm Durchmesser), das mit etwa 5 ml Ringerlösung in einer Petrischale (100 mm x 15 mm) leicht angefeuchtet ist (Abbildung 2A).
  4. Geben Sie täglich ~ 1 ml Ringer-Lösung nach Bedarf in das Filterpapier, um Trockenheit und Larvenaustrocknung zu vermeiden.

3. Bakterielle Zubereitung

  1. Kultur P. asymbiotica Bakterien auf Luria Bertani (LB) Agar Medien bei 28 °C für 48 h.
  2. Verwenden Sie einen Schrank der Biosicherheitsstufe 2, um eine einzelne Kolonie von P. asymbiotica zu übertragen, um eine flüssige Kultur in 10 ml LB-Medien zu impfen.
  3. Die P. asymbiotica Flüssigkultur über Nacht bei 28 °C in einem auf 220 U/min eingestellten Rotationshaker inkubieren.
  4. Kultur E. coli Bakterien in ähnlicher Weise, aber führen das anfängliche Wachstum auf Agarmedien und Flüssigkulturinkubation bei 37 °C über Nacht durch.
  5. Zentrifugieren Sie jede Bakterienkultur über Nacht für 3 min bei 13.000 x g und 4 °C.
  6. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die resultierenden Bakterienpellets dreimal mit 10 ml sterilem PBS.
  7. Zentrifen Sie die Pellets erneut für 3 min bei 13.000 x g und 4 °C.
  8. Verdünnen Sie jedes Pellet mit sterilem PBS, um die Bakterienkonzentrationen an die optische Dichte (600 nm) von 0,25 für P. asymbiotica und 0,015 für E. coli anzupassen, die 100-300 koloniebildenden Einheiten pro Larve jeder bakteriellen Zubereitung entsprechen, wobei ein Spektralphotometer verwendet wird.

4. Vorbereitung des Injektors

  1. Bereiten Sie Kapillaren mit 3,5-Zoll-Glaskapillarröhrchen und einem Mikropipettenabzieher vor. Stellen Sie das Gerät wie folgt ein: Wärme: 580; ziehen: 143; Geschwindigkeit: 25; Verspätung: 1; Druck: 500.
  2. Verwenden Sie gerade gezackte Mittelpunktzangen, um die Glaskapillare in dem Maße zu öffnen, dass die experimentellen Behandlungen durchgeführt werden können und gleichzeitig die Larven nur minimal geschädigt werden (Abbildung 2B). Um dieses Verfahren während des Übens von Injektionen zu optimieren, verwenden Sie Trypan Blue-Lösung (verdünnen Sie den Bestand 0,4% mit PBS auf 0,2%), um Leckagen während der Injektion und das Überleben der blauen Larven leicht zu verfolgen.
  3. Füllen Sie die Kapillare mit Mineralöl mit einer Einweg-20-ml-Einwegspritze aus Kunststoff mit einer Injektionsnadel (22 G, 25 mm Länge).
  4. Stellen Sie den Nanoliter-Injektor auf und werfen Sie das Öl aus der Kapillare aus (Abbildung 2C).
  5. Füllen Sie die Kapillare mit dem gewünschten bakteriellen Präparat für die Injektion. Nehmen Sie die Lösung aus einem Tropfen (~ 20 μL), der auf Parafilm platziert wird. In diesem Protokoll wurden 50,2 nL von zwei Bakterienbrüten injiziert.

5. Larveninjektion

  1. Anästhesieren Sie D. melanogaster-Larven mit Kohlendioxid für ~ 2 Minuten vor dem Eingriff.
  2. Übertragen Sie die betäubten Larven vorsichtig auf ein Filterpapier, das in Ringers Lösung angefeuchtet ist, um sich auf die Injektion unter einem Stereomikroskop vorzubereiten. Die Larven werden an dieser Stelle lethargisch oder passiv sein.
  3. Um Larven zu injizieren, üben Sie festen Druck auf die dorsale Seite des hinteren Endes aus (die Trachealspiralen sind am hinteren Ende im Vergleich zu schwarzen Mundwerkzeugen am vorderen Ende sichtbar) mit einer Pinzette (Abbildung 2D).
  4. Führen Sie die Nadel horizontal in Richtung des hinteren Endes der Larven in der Nähe der Kutikula ein. Eine erfolgreiche Injektion führt nicht zu einem Austritt der injizierten Lösung aus den Larven (Abbildung 3).
  5. Entfernen Sie die Pinzette, mit der Druck auf den Schwanz der Larven ausgeübt wurde, bevor Sie die Nadel zurückziehen. Wenn sie nicht zuerst entfernt wird, kann die Pinzette die Hämolymphe und / oder den Darm aus den Larven von der Wundstelle verdrängen.
  6. Infizieren Sie die entsprechende Anzahl von Larven für die durchgeführte Studie. In diesem speziellen Protokoll wurden 20 Larven für jede experimentelle Bedingung injiziert.
  7. Übertragen Sie die injizierten Larven vorsichtig mit einer Pinzette auf ein separates feuchtes Filterpapier in einer Petrischale (10 Larven pro Schale) oder einer Lebensmitteldurchstechflasche (abhängig vom Zweck des Experiments), um eine Erholung zu ermöglichen.
  8. Stellen Sie die Petrischalen oder Lebensmittelfläschchen in einen Inkubator bei 25 ° C. Wenn Larven in einer Petrischale aufbewahrt werden, fügen Sie bei Bedarf Ringer-Lösung hinzu, um eine Austrocknung zu verhindern.

6. Erfassung von Überleben/Mortalität

  1. Erfassen Sie die Anzahl der toten und lebenden D. melanogaster-Larven gemäß den eingestellten experimentellen Zeitpunkten. Lebende Larven entwickeln sich weiter zu Puppen und Erwachsenen.
  2. Verwenden Sie statistische Programme wie Prism, um die rohen Überlebens- / Mortalitätsdaten einzugeben, sie mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) zu analysieren und die Ergebnisse in Zahlen darzustellen.

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Ergebnisse

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Bei richtiger Durchführung zeigen Injektionen von D. melanogaster-Larven eine bakteriumsspezifische Wirkung. Die Überlebensdaten wurden zu mehreren Zeitpunkten nach Infektionen mit P. asymbiotica (Stamm ATCC43943), E. coli (Stamm K12) und PBS (Abbildung 4) erhoben. Während D. melanogaster-Larven anfällig für P. asymbiotica sind, was das Überleben schnell beeinträchtigt, weisen Larven, denen E. coli- oder PBS-Kontrollen injiziert werden, ein verlän...

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Diskussion

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Drosophila melanogaster gehört zu den wertvollsten, experimentell manipulierten Modellen, die zur Untersuchung der angeborenen Immunität und Pathogenese verschiedener mikrobieller Infektionen verwendet werden. Dies liegt an seinem einfachen und schnellen Lebenszyklus, der einfachen Wartung in einem Labor, der gut etablierten evolutionären Genetik und der vielfältigen genetischen Toolbox. Frühere Methoden der D. melanogaster-Larveninjektion, wie die Verwendung eines hybriden mikrofluidischen Geräts oder ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

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Wir danken Mitgliedern des Department of Biological Sciences der George Washington University (GWU) für die kritische Lektüre des Manuskripts. GT wurde durch ein Harlan-Sommerstipendium der GWU unterstützt. Alle grafischen Figuren wurden mit BioRender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fly Food B (Bloomington Rezept)LabExpress7001-NVFood B, in schmalen Fläschchen, 100 Fläschchen/Tablett
100 x 15, Mono Petrischalen Voll stapelbarVWR25384-342Durchmesser 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petrischalen Voll stapelbarVWR25384-092Durchmesser 60 x 15 mm
GlaskapillarenVWR53440-186
Klasse 1 qualitatives Filterpapier Standardqualität, KreisVWR28450-150Durchmesser 150 mm
Laborkultur Klasse II Typ A2 BiosicherheitswerkbankESCOLA2-4A2-E
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB Agar Müller Pulver 500 g
LB BouillonFisher ScientificBP1426-500LB Brühe Müller Pulver 500 g
MineralölAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific31911-A1
NanoDrop 2000/2000c SpektralphotometerThermo Fisher ScientificND-2000C
Nanoject III Programmierbarer Nanoliter-InjektorDrummond3-000-207
Schmale Drosophila-Fläschchen, PolystyrolGenesee Scientific32-109
Nadeln, subkutanVWR89219-31622 G, 25 mm
Next Generation MikropipettenabzieherWorld Precision InstrumentsSU-P1000
PBSVWR97062-732Puffer PBS Tabletten Biotech Grade 200tab
PrismGraphPadVersion 8
Spritzen - Kunststoff, EinwegVWR76124-65220 mL
Trypan BlueSigma-AldrichT8154

Referenzen

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