Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.
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Methodenartikel
Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Verschiedene Bakterienarten sezernieren ~20-300 nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Glykanen und anderen Molekülen bestehen, die von den Elternzellen stammen. EVs fungieren als intra- und interspezielle Kommunikationsvektoren und tragen gleichzeitig zur Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsorganismen im Kontext von Infektion und Besiedlung bei. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die EVs in Gesundheit und Krankheit zugeschrieben werden, besteht ein wachsendes Interesse daran, EVs für In-vitro- und In-vivo-Studien zu isolieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Trennung von EVs basierend auf physikalischen Eigenschaften, nämlich der Größe, die Isolierung von Vesikeln aus verschiedenen Bakterienkulturen erleichtern würde.
Der Isolationsworkflow besteht aus Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Isolierung von EVs aus Bakterienkulturen. Ein pumpengetriebener Tangential-Flow-Filtrationsschritt (TFF) wurde integriert, um die Skalierbarkeit zu verbessern und die Isolierung von Material aus Litern Ausgangszellkultur zu ermöglichen. Escherichia coli wurde als Modellsystem verwendet, das EV-assoziierte Nanoluciferase und nicht-EV-assoziierte mCherry als Reporterproteine exprimiert. Die Nanoluciferase wurde gezielt auf die EVs gerichtet, indem ihr N-Terminus mit Cytolysin A fusioniert wurde. Frühe Chromatographiefraktionen, die 20-100 nm EVs mit assoziiertem Cytolysin A - nanoLuc enthielten, unterschieden sich von den späteren Fraktionen, die die freien Proteine enthielten. Das Vorhandensein von EV-assoziierter Nanoluciferase wurde durch Immunogold-Markierung und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Dieser EV-Isolations-Workflow ist auf andere gramnegative und grampositive Bakterienarten anwendbar, die mit dem menschlichen Darm assoziiert sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration/TFF und SEC eine skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterienarten ermöglicht. Die Verwendung eines standardisierten Isolationsworkflows wird vergleichende Studien mikrobieller Elektrofahrzeuge über Spezies hinweg erleichtern.
Einleitung
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanometergroße, liposomenähnliche Strukturen, die aus Lipiden, Proteinen, Glykanen und Nukleinsäuren bestehen und sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Zellen abgesondert werden1. Seit den frühen Studien, die die Freisetzung von EVs aus gramnegativen Bakterien visualisierten2, hat die Anzahl der biologischen Funktionen, die bakteriellen EVs (20-300 nm Durchmesser) zugeschrieben werden, in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen. Zu ihren Funktionen gehören die Übertragung von Antibiotikaresistenz3, Biofilmbildung4, Quorum....
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Protokoll
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Arbeiten mit Bakterien und rekombinanter DNA den besten Praktiken für die biologische Sicherheitseindämmung entsprechen, die der biologischen Sicherheitsrisikostufe jedes Stammes entsprechen. Die Arbeit sollte in Übereinstimmung mit lokalen, nationalen und internationalen Biosicherheitsvorschriften erfolgen.
1. Bakterienstämme und Kulturbedingungen
HINWEIS: In dieser Studie verwendete Bakterienstämme waren Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ....
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Ergebnisse
Um zu beurteilen, welche SEC-Chromatographiefraktionen für EVs angereichert waren, wurde die SEC-Säule mit 2 ml E. coli MP1-konditioniertem Kulturmedium beladen, das 1.000-fach durch TFF konzentriert worden war, und sequentielle Fraktionen wurden gesammelt. Unter Verwendung von MRPS wurde festgestellt, dass die Fraktionen 1-6 die meisten EVs enthielten (Abbildung 2A). Nachfolgende Fraktionen enthielten sehr wenige EVs, die anstelle von EV-freien Proteinen bestanden (
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Diskussion
Im obigen Protokoll wird eine Methode beschrieben, die skalierbar ist und EVs zuverlässig von verschiedenen gramnegativen/positiven und aeroben/anaeroben Bakterien isoliert. Es hat mehrere potenzielle Haltepunkte während des gesamten Verfahrens, obwohl es besser ist, nicht länger als 48 Stunden zu benötigen, um EVs aus konditionierten Bakterienkulturmedien zu isolieren.
Erstens besteht es aus der Kultivierung von Bakterien, um ein konditioniertes Bakterienkulturmedium zu erzeugen. Es wurde fes.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Die oben beschriebene Forschung wurde durch NIH TL1 TR002549-03 Training Grant unterstützt. Wir danken Dr. John C. Tilton und Dr. Zachary Troyer (Case Western Reserve University) für die Erleichterung des Zugangs zum Partikelgrößenanalysegerät; Lew Brown (Spectradyne) für technische Unterstützung bei der Analyse der Partikelgrößenverteilungsdaten; Dr. David Putnam von der Cornell University für die Bereitstellung von pClyA-GFP-Plasmid14; und Dr. Mark Goulian von der University of Pennsylvania für die Bereitstellung des E. coli MP113.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5 mL dünnwandige PCR-Röhrchen mit flachem Deckel | Thermo Scientific | 3430 | Es ist wichtig, dünnwandige PCR-Röhrchen zu verwenden, um genaue Messwerte mit Qubit |
| 16 % Paraformaldehyd (Formaldehyd) wässriger Lösung | Elektronenmikroskopie sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite Zentrifugenflaschen aus Polypropylen | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite Zentrifugenflaschen aus Polypropylen | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Adapter für Polypropylen-Flaschen mit rundem Boden/konischem | Boden Beckman Coulter | 392077 | Ermöglicht den Einbau von Vivacell in Rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC BAA-835 | ||
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI Zentrifuge | Beckman Schar | Nicht mehr verkauft von Beckman. Die Avanti J-26XP ist das nächstgelegene zeitgenössische Modell. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Gehirn Herz Infusion (BHI) Bouillon | Himedia | M2101 | Nach dem Autoklavieren wurden sowohl BHI-Bouillon als auch Agar in die anaerobe Kammer eingebracht, ergänzt mit Menadion (1 & micro; g/L), Hämatin (1,2 &μ; g/L) und L-Cysteinhydrochlorid (0,05 %). Sie wurden dann mindestens 24 Stunden unter anaeroben Bedingungen inkubiert, bevor sie mit den anaeroben Bakterienstämmen inokuliert wurden. |
| C-300 Mikrofluidik-Kartusche | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Elektronenmikroskop | FEI Firma | Tecnai G2 SpiritBT | |
| Escherichia coli HST08 (Steller kompetente Zellen) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (Geschenk) | kommensale Bakterien aus dem Darm der Maus | |
| Fiberlite 500 mL auf 250 mL ThermoFisher | 010-0151-05 | in Verbindung mit dem Fiberlite-Rotor, um die Verwendung von 250-ml-Flaschen für kleinere Startbakterienkulturen zu ermöglichen | |
| Fiberlite Zentrifugenrotor mit festem Winkel | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | passt für 6 x 500 mL Flaschen |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Kupfer | Elektronenmikroskopie FCF-400-CU | ||
| Glutaraldehyd (EM-Qualität, 10 % wässrige Lösung) | Elektronenmikroskopie | 16100 | |
| Hämatin | ChemCruz | 207729B | Stammlösung wurde hergestellt in 0,2 M L-Histidin-Lösung als 1,2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Mikroplatten-Reader | Tecan | Dieses Gerät wurde zur Messung der mCherry-Fluoreszenz-In-Fusion | |
| nbsp; HD Cloning Plus | Takara | 638909 | Zum Klonieren der PCR-Fragmente in die PCR-lineraisierten Vektoren |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) Brühe, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cystein Hydrochlorid | J.T. Baker | 2071-05 | Es sollte gewogen und direkt zu den autoklavierten BHI-Medien im anaeroben |
| Kammer Masterflex Fitting, Polypropylen, gerade, weiblich Luer auf Schlauchtülle Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - spezielle | HV-30800-08 | Anschlussadapter für Filtrationsschlauchkreislauf |
| Masterflex Fitting, Polypropylen, gerade, männlich Luer auf Schlauchtülle Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - spezielle | HV-30800-24 | Anschlussadapter für Filtrationsschlauchkreislauf |
| Masterflex L/S Analoger Konsolenantrieb mit variabler Drehzahl, 20 bis 600 U/min | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load-Kopf für Präzisionsschläuche, 4 Rollen, PARA-Gehäuse, SS-Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Präzisions-Pumpenschlauch, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | Schlauch mit geringer Bindung/geringer Auslaugung |
| Menadion (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stammlösung wurde in Ethanol hergestellt als 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41,5 CM 100K MPES 0,5 MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF-Gerät, das wir verwendet haben, um bis zu 2 L E. coli-Kulturüberstand |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | zu filtrieren Dieses Assay-Kit wurde verwendet, um die Lumineszenz des nluc-Reporterproteins |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antikörper zu messen, Klonen 965808 | R& D | Systems MAB10026 | |
| nCS1 Mikrofluidik resistives Pulsmessgerät | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysesoftware für die Partikelgrößenverteilung | |
| OneTaq 2x Master Mix mit Standardpuffer | NEB | M0482 | DNA-Polymerase-Mastermix zur Durchführung von Routine-PCR-Reaktionen zur Koloniekontrolle |
| Protein LoBind, 2,0 mL, PCR Saubere Röhrchen | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA-Polymerase-Mastermix zur Durchführung der PCR-Reaktionen, die für die Klonierung von |
| qEV original benötigt werden, 35 nm | Izon | maximales Beladungsvolumen von 0,5 mL | |
| qEV Rack | Izon | zur Verwendung mit den qEV-original SEC Säulen | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximales Ladevolumen von 2 mL | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Artikel nicht mehr lieferbar. Das nächstgelegene verfügbare Produkt ist das Qubit 4.0 Fluorometer (Kat. Nein. Q33238) | |
| Qubit Protein Assay Kit | ThermoFisher | Q33211 | Kit bei Raumtemperatur lagern. Normen werden bei 4 °C gelagert. |
| Sorvall Lynx 4000 Zentrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Mikroplatten-Reader | Molekulare Geräte | Dieses Gerät wurde zur Messung der Nanoluziferase-Biolumineszenz | |
| verwendet Stericup Quick-release-GP Steriles Vakuumfiltrationssystem (150, 250 oder 500 ml) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE | Ein oder mehrere Filter können verwendet werden, um das Arbeitsvolumen aufzunehmen. Unserer Erfahrung nach können Sie das Doppelte des auf der Produktgröße angegebenen Volumens filtern. |
| Uranylacetat | Elektronenmikroskopie Sciences | 22400 | |
| Anaerobe Vinylkammer | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100.000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus Spritzenvorsatzfilter (0,02 Mikron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | zum Filtern von MRPS-Verdünnungsmittel |
Referenzen
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
- Chatterjee, S. N., Das, J. Electron micro....
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Nachdrucke und Genehmigungen
