Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.
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Methodenartikel
Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die frühe Entwicklung hängt von einem Pool mütterlicher Faktoren ab, die während der Oogenese in die reife Eizelle eingebaut werden und alle für die Entwicklung notwendigen zellulären Funktionen bis zur Aktivierung des zygotischen Genoms erfüllen. Typischerweise erfordert das genetische Targeting dieser mütterlichen Faktoren eine zusätzliche Generation, um Phänotypen mit mütterlichem Effekt zu identifizieren, was die Fähigkeit behindert, die Rolle von maternal exprimierten Genen während der Entwicklung zu bestimmen. Die Entdeckung der biallelischen Editierfähigkeiten von CRISPR-Cas9 hat das Screening embryonaler Phänotypen in somatischen Geweben injizierter Embryonen oder "Crispants" ermöglicht und das Verständnis der Rolle zygotisch exprimierter Gene in Entwicklungsprogrammen erweitert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das eine Erweiterung der Crispant-Methode darstellt. Bei dieser Methode ermöglicht die biallelische Bearbeitung von Keimzellen die Isolierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation oder "mütterlichen Crispants". Multiplexing-Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel fördert die effiziente Produktion von mütterlichen Crispants, während die Sequenzanalyse von mütterlichen Crispant-Haploiden eine einfache Methode zur Bestätigung genetischer Läsionen bietet, die einen mütterlichen Phänotyp erzeugen. Die Verwendung von mütterlichen Crispants unterstützt die schnelle Identifizierung essentieller maternal exprimierter Gene und erleichtert so das Verständnis der frühen Entwicklung.
Einleitung
Ein Pool von mütterlich abgelagerten Produkten (z. B. RNAs, Proteine und andere Biomoleküle) ist für alle frühen zellulären Prozesse notwendig, bis das zygotische Genom des Embryos aktiviert ist1. Die vorzeitige Erschöpfung dieser Produkte aus der Eizelle ist typischerweise embryonal tödlich. Trotz der Bedeutung dieser Gene für die Entwicklung ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene derzeit unbekannt. Fortschritte in der Gen-Editing-Technologie bei Zebrafischen, wie CRISPR-Cas9, ermöglichen das Targeting von maternal exprimierten Genen 2,3,4. Die Identifizierung eines mütterlichen Phänotyps erfordert jedoch eine zusätzliche Generation im Vergleich zu einem zygotischen Phänotyp und erfordert daher mehr Ressourcen. Vor kurzem wurde die biallelische Bearbeitungsfähigkeit von CRISPR-Cas9 genutzt, um nach embryonalen Phänotypen in somatischen Geweben injizierter (F0) Embryonen, bekannt als "Crispants"5,6,7,8,9,10, zu suchen. Die Crispant-Technik ermöglicht ein ressourceneffizientes Screening von Kandidatengenen in somatischen Zellen und erleichtert so das Verständnis spezifischer Aspekte in der Entwicklung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von mütterlichen Effekt-Phänotypen oder "maternalen Crispants" in einer einzigen Generation11. Dieses Schema ist erreichbar, indem Guide-RNAs auf ein einzelnes Gen gemultiplext und biallelische Editierereignisse in der Keimbahn gefördert werden. Diese mütterlichen Crispant-Embryonen können durch grobe morphologische Phänotypen identifiziert werden und einer primären Charakterisierung unterzogen werden, wie z. B. Markierung für Zellgrenzen und DNA-Musterung11. Die kombinierte Analyse des beobachtbaren Phänotyps und die grundlegende molekulare Charakterisierung der induzierten INDELs ermöglichen die Vorhersage der Rolle des Zielgens in der frühen Entwicklung.
Im Zebrafisch entwickelt sich während der ersten 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) eine kleine Gruppe von Zellen zu den primordialen Keimzellen, einem Vorläufer der Keimbahn12,13,14,15. In Gelege von F0-Weibchen hängt der Anteil der gewonnenen mütterlichen Crispant-Embryonen davon ab, wie viele Keimzellen ein biallelisches Editierungsereignis im Zielgen enthalten. Im Allgemeinen gilt: Je früher das Bearbeitungsereignis im Embryo auftritt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass CRISPR-Cas9-Mutationen in der Keimbahn beobachtet werden. In den meisten Fällen stammen die Phänotypen mütterlicher Crispant-Embryonen aus dem Funktionsverlust der beiden mütterlichen Allele, die in der sich entwickelnden Eizelle vorhanden sind. Wenn die Eizelle die Meiose beendet, wird eines der mütterlichen Allele über den Polkörper aus dem Embryo extrudiert, während das andere Allel in den mütterlichen Vorkern eingebaut wird. Die Sequenzierung mehrerer mütterlicher Crispant-Haploide stellt eine Mischung der in der Keimbahn vorhandenen Mutationen (Insertionen und/oder Deletionen (INDELs)) dar, die zum Phänotyp11 beitragen.
Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Erzeugung von CRISPR-Cas9-Mutationen in maternalen Effektgenen und zur Identifizierung des entsprechenden Phänotyps mit einem mütterlichen Crispant-Ansatz (Abbildung 1). Abschnitt eins wird erklären, wie man Guide-RNAs effektiv entwirft und erstellt, während die Abschnitte zwei und drei kritische Schritte zur Herstellung mütterlicher Crispants durch Mikroinjektion enthalten. Nach der Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung werden die injizierten Embryonen mittels PCR auf somatische Schnitte untersucht (Abschnitt vier). Sobald sich die injizierten F0-Embryonen entwickeln und die Geschlechtsreife erreichen, werden die F0-Weibchen mit Wildtyp-Männchen gekreuzt, und ihre Nachkommen werden auf mütterliche Phänotypen untersucht (Abschnitt fünf). Abschnitt sechs enthält Anweisungen zur Herstellung mütterlicher Crispant-Haploide, die mit der Sanger-Sequenzierung kombiniert werden können, um die CRISPR-Cas9-induzierten INDELs zu identifizieren. Darüber hinaus enthält die Diskussion Änderungen, die am Protokoll vorgenommen werden können, um die Empfindlichkeit und Leistungsfähigkeit dieser Methode zu erhöhen.
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Protokoll
In Studien, die zur Entwicklung dieses Protokolls führten, wurden alle Zebrafischhaltungen und Experimente vom University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2) genehmigt.
1. Synthese von Guide-RNAs
HINWEIS: Zygotische Crispants wurden unter Verwendung einer einzigen Guide-RNA oder des Multiplexens mehrerer Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel 5,6,7,8,9,10 hergestellt. Das Multiplexing von Guide-RNAs erhöht den Prozentsatz der Embryonen mit einem zygotischen crispant-Phänotyp10. Aufgrund dieser erhöhten Häufigkeit von Embryonen, die einen Phänotyp aufweisen, werden mütterliche Crispants erzeugt, indem vier Guide-RNAs zu einem einzigen Gen gemultiplext werden. Ein detaillierteres Protokoll über die Verwendung von CHOPCHOP zum Design von Guide-RNAs und eine Annealing-Methode zur Synthese von Guide-RNAs für Zebrafische finden Sie an anderer Stelle 16,17,18,19,20.
- Um ein mütterlich exprimiertes Gen zu identifizieren, das anvisiert werden soll, bestimmen Sie die mRNA-Transkriptspiegel während der Entwicklung über eine RNA-Sequenzdatenbank, die Transkriptominformationen von Zygote bis 5 Tage21 liefert. Im Allgemeinen werden maternspezifische Gene im frühen Embryo stark exprimiert und nach Aktivierung des zygotischen Genoms abgebaut22.
- Sobald ein mütterlich exprimiertes Zielgen identifiziert wurde, bestimmen Sie die erste vorhergesagte Proteindomäne mithilfe des Abschnitts "Domänen und Merkmale", der im Ensembl-Genombrowser23 verfügbar ist. Verwenden Sie diese Domäne als Zielregion für die vier Guide-RNAs.
- Verwenden Sie das Guide-RNA-Auswahlprogramm CHOPCHOP, um vier Guide-RNA-Zielstellen in der ersten aktiven Domäne zu identifizieren. Entwerfen Sie genspezifische Oligonukleotide, wie unten für jede Zielstelle gezeigt. Im genspezifischen Oligonukleotid entspricht derN20-Abschnitt der Zielsequenz abzüglich der PAM-Stelle (NGG) von CHOPCHOP. Ordnen Sie diese genspezifischen Oligonukleotide und das konstante Oligonukleotid mittels Standard-Entsalzungsreinigung (siehe Materialtabelle).
Genspezifisches Oligonukleotid:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Um eine Leit-RNA-Vorlage für jedes genspezifische Oligonukleotid zu erstellen, glühen Sie es auf das konstante Oligonukleotid und füllen Sie die Überhänge mit T4-DNA-Polymerase, wie zuvor beschrieben16. Nachdem die vier Guide-RNA-Templates zusammengesetzt sind, reinigen und konzentrieren Sie sie zusammen mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
- Synthetisieren Sie die sgRNA-Mischung aus der gepoolten Guide-RNA-Vorlage unter Verwendung eines In-vitro-T7-Transkriptionskits (siehe Materialtabelle). Führen Sie die In-vitro-Transkription gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Die Verwendung von Halbreaktionen des T7-Transkriptionskits kann die Kosten pro Reaktion senken.
- Nach der RNA-Synthese wird der resultierende Pool von sgRNAs unter Verwendung eines Ethanol/Ammoniumacetat-Protokolls gereinigt, wie zuvor beschrieben 16,20,24. Nachdem die RNA isoliert wurde, resuspendieren Sie sie in 20 μL nukleasefreiem Wasser. Wenn Halbreaktionen des T7-Transkriptionskits verwendet wurden, um den Pool von sgRNAs zu transkribieren, resuspendieren Sie die gereinigte RNA in 10-15 μL nukleasefreies Wasser.
- Quantifizieren Sie die Menge der gepoolten sgRNAs, die mit einem Spektralphotometer erzeugt wurden. Verdünnen Sie den Pool von sgRNAs in nukleasefreiem Wasser auf eine Verdünnung von 1500 ng / μL ± 500 ng / μL. Typischerweise liegt das Endvolumen der Arbeitsverdünnung zwischen 30 und 50 μL.
- Nachdem Sie die Konzentration des Pools von sgRNAs bestimmt haben, überprüfen Sie die Integrität der sgRNAs auf einem 1% igen Agarosegel.
- Gießen Sie ein 1% Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/FSME-Gel. Sobald das Gel erstarrt ist, legen Sie es in den FSME-Laufpuffer.
- Mischen Sie 1 μL der sgRNA-Mischung und 1 μL RNA-Gel-Ladepuffer (siehe Materialtabelle). Laden Sie diese Probe in das Gel und lassen Sie das Gel bei 100 V für 5 min laufen.
- Visualisieren Sie die Bänder mit ultraviolettem (UV) Licht. Der Pool der sgRNAs sollte als eine einzige Bande erscheinen. Wenn ein Abstrich beobachtet wird, ist wahrscheinlich ein RNA-Abbau aufgetreten.
- Lagern Sie den Pool der sgRNAs in 1 μL Aliquots zur einmaligen Verwendung in nukleasefreien PCR-Streifenröhrchen im -80 °C Gefrierschrank. Bei großen Mengen an sgRNAs-Gemischen (30 μL oder mehr) aliquot die Hälfte des Volumens in die nukleasefreien PCR-Streifenröhrchen und speichern Sie die andere Hälfte als größeres Volumen in einem nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen. Auftauen und bei Bedarf aliquot.
- Um einen RNA-Abbau zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Proben im Mikrozentrifugenröhrchen nicht mehr als zwei Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen.
2. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für die Mikroinjektion
HINWEIS: Im Zebrafisch kann die Injektion von Cas9 mRNA zygotische Crispants erzeugen. Studien haben jedoch gezeigt, dass Cas9-Protein effizienter bei der Erzeugung von INDELs in injizierten Embryonenist 16,25. Dieses Protokoll verwendet Cas9-Protein, um mütterliche Crispants zu erzeugen, da dieses Protein nicht die gleiche Verzögerung in der Aktivität erfährt wie injizierte Cas9-mRNA. Theoretisch sollte dies die Wahrscheinlichkeit einer biallelischen Mutation früh in der Entwicklung erhöhen, was zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit führt, dass ein ausgedehnterer Abschnitt der Keimbahn betroffen ist. Andere Protokolle und Ressourcen, die detailliert beschreiben, wie man sich auf Mikroinjektionen vorbereitet, finden Sie an anderer Stelle24,26.
- Cas9-Protein kaufen oder erzeugen (siehe Materialtabelle). Resuspendieren Sie das Cas9-Protein in nukleasefreiem Wasser, um eine 2 mg/ml-Lösung herzustellen, und aliquot 1 μL in RNase-freie Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie diese als Einwegröhrchen bei -80 °C.
- Verwenden Sie am Nachmittag vor der Injektion einen Mikropipettenzieher, um eine Glaskapillare zu ziehen und eine Injektionsnadel herzustellen. Bewahren Sie die ungebrochene Nadel bis zum Morgen der Mikroinjektionen in einem geschlossenen Nadelhalter auf.
- Um eine Injektionsplatte herzustellen, gießen Sie 20 ml 1,5% Agarose/sterilesH2O, um die Hälfte einer 100 mm x 15 mm großen Petrischale zu füllen, und warten Sie, bis sie sich verfestigt hat. Sobald die Agaroselösung fest ist, geben Sie 20 ml 1,5% Agarose/sterilesH2Oin die Petrischale und legen Sie die Kunststoffform (siehe Materialtabelle) in die flüssige Agarose und lassen Sie sie aushärten.
- Nachdem die Agarose ausgehärtet ist, entfernen Sie die Kunststoffform und lagern Sie die Spritzplatte kopfüber in einem Kühlschrank bis zum Morgen der Injektionen. Eine einzelne Platte kann für mehrere Injektionen verwendet werden, solange die Vertiefungen ihre Integrität beibehalten.
3. Mikroinjektion des CRISPR-Cas9-Cocktails in einen einzelligen Zebrafischembryo zur Erzeugung mütterlicher Crispants
HINWEIS: Weitere Ressourcen für die Mikroinjektion in Zebrafischembryonen finden Sie an anderer Stelle24,26,27. Die Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung in die sich entwickelnde Blastodisc von einzelligen Embryonen kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, mütterliche Crispants zu erzeugen. Die Mischung kann auch bis zum 2-Zell-Stadium in den Dottersack injiziert werden. Mischungen, die in das Eigelb injiziert werden, hängen jedoch von oplasmatischem Strömen ab, um die Blastoscheibe zu erreichen, so dass CRISPR-Cas9, das in das Eigelb injiziert wird, die Schneideffizienz des CRISPR-Cas928 verringern könnte.
- Stellen Sie am Nachmittag vor den Mikroinjektionen Wildtyp-Kreuzungen in Zebrafisch-Paarungsboxen auf. Halten Sie sowohl den männlichen als auch den weiblichen Fisch im selben Tank, aber trennen Sie sie mit einem Paarungskastenteiler oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz.
- Nehmen Sie am Morgen des Experiments ein 2 mg/ml Aliquot Cas9-Protein und ein Aliquot aus dem Pool der sgRNAs heraus. In der RNase-freien Polypropylen-Mikrozentrifugenröhre, die das Cas9-Protein enthält, wird eine 5-μL-Injektionsmischung zusammengestellt, die den Pool von sgRNAs, 1 μL 0,5% ige Phenolrotlösung und nukleasefreies Wasser enthält. Ziel ist eine Endkonzentration von 400 ng/μL Cas9-Protein und 200 ng/μL der gepoolten sgRNAs in RNase-freiem Wasser oder ein 2:1-Verhältnis von Cas9-Protein zu sgRNAs im injizierten Embryo. Diese Injektionsmischung kann für den Morgen der Injektion auf Eis gelagert werden.
- Nehmen Sie eine Injektionsplatte aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie mindestens 20 Minuten auf Raumtemperatur (RT) erwärmen.
- Nachdem der Injektionscocktail zusammengesetzt ist, lassen Sie das Männchen und das Weibchen paaren, z. B. indem Sie den Trennwand der Steckbox entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen.
- Nachdem die Fische gelegt haben, aber bevor die Embryonen gesammelt wurden, schneiden Sie die Spitze einer ungebrochenen Nadel mit einer neuen Rasierklinge oder einer feinen Pinzette ab, um eine Nadel zu schaffen, deren Bohrung klein genug ist, um Embryoschäden zu vermeiden, aber breit genug ist, damit sie nicht mit Injektionsmischung verstopft wird. Nachdem die Nadel geschnitten wurde, beladen Sie die Nadel mit der Injektionsmischung unter Verwendung einer Mikroladerpipettenspitze, die in das hintere Ende der Kapillare eingeführt wird (siehe Materialtabellen).
- Nachdem die Nadel gefüllt ist, inkubieren Sie die Nadel für 5 min bei RT, um Cas9-sgRNA-Komplexe zusammenzusetzen.
- Schalten Sie den Mikroinjektor ein und führen Sie die Nadel in den Mikromanipulator ein. Legen Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerobjektträger und kalibrieren Sie die Nadel durch Einstellen des Einspritzdrucks, bis die Nadel einen 1 nL Bolus in das Mineralöl ausstößt.
HINWEIS: Bei der Injektion in das Mineralöl hat ein 1-nL-Bolus einen Durchmesser von ca. 0,125 mm (oder einen Radius von 0,062 mm), gemessen mit dem Mikrometerobjektträger. - Um die Embryonen zu synchronisieren, sammeln Sie sie nach 10 min mit einem Kunststoffsieb und spülen Sie sie mit 1x E3-Medien (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4) in eine Petrischale und spülen Sie sie mit 1 l 1x E3 in eine Petrischale ein. Entfernen Sie 10-15 Embryonen und legen Sie sie in eine separate Petrischale, um sie als nicht injizierte Kontrollen zu behalten.
- Übertragen Sie den Rest der sich entwickelnden Embryonen in die Vertiefungen der Injektionsplatte.
- Injizieren Sie 1 nL Lösung (insgesamt 400 pg Cas9-Protein und 200 pg sgRNAs) in die sich entwickelnde Blastodisc eines einzelligen Embryos. Wenn die Spitze der Nadel verstopft, verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze zurückzubrechen und die Nadel neu zu kalibrieren, um einen 1-nL-Bolus auszustoßen. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen während der ersten 40 Minuten der Entwicklung nach der Befruchtung injiziert werden.
- Nach Abschluss der Injektion geben Sie die injizierten Embryonen in eine markierte Petrischale zurück, die 1x E3-Medien enthält, und lassen Sie sie den ganzen Tag über entwickeln. Entfernen Sie alle Embryonen, die unbefruchtet sind oder sich nicht normal gemäß der Zebrafisch-Staging-Serie29 entwickeln.
4. Screening auf somatische INDELs in injizierten F0-Embryonen
HINWEIS: Andere Methoden zur Identifizierung von INDELs, wie der T7-Endonuklease-I-Test oder die hochauflösende Schmelzanalyse, können verwendet werden, um festzustellen, ob die Embryonen somatische INDELs 30 enthalten.
- Am nächsten Tag nach den Injektionen entfernen Sie defekte und lysierte Embryonen aus der Petrischale und ersetzen Sie die 1x E3-Medien, um die Gesundheit des Embryos zu erhalten.
- Nachdem Sie die Schale gereinigt haben, sammeln Sie sechs gesunde injizierte Embryonen und zwei Kontrollembryonen von der nicht injizierten Platte. Legen Sie jeden Embryo einzeln in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens und beschriften Sie die Oberseite der Röhrchen.
- Um die genomische DNA einzelner Embryonen zu extrahieren, entfernen Sie die überschüssigen E3-Medien aus den Vertiefungen des Streifenrohrs und fügen Sie 100 μL 50 mM NaOH pro Vertiefung hinzu.
- Inkubieren Sie die Embryonen bei 95 °C für 20 min. Dann kühlen Sie die Proben auf 4 °C ab, fügen Sie 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) hinzu und wirbeln Sie sie für 5 bis 10 s. Diese extrahierte DNA kann bei -20 °C für mindestens 6 Monate ohne signifikanten DNA-Abbau gelagert werden.
- Entwerfen Sie einzigartige Screening-Primer für jede Guide-Site, um ein 100-110 bp DNA-Fragment zu amplifizieren, das die CRISPR-Cas9-Zielstelle enthält. Wenn möglich, platzieren Sie die Zielstelle in der Mitte des amplifizierten Fragments, um die Identifizierung größerer Deletionen zu ermöglichen.
- Richten Sie für jede der vier Leitzielstellen acht 25-μL-PCR-Reaktionen unter Verwendung von 5 μL der vorbereiteten genomischen DNA eines einzelnen Embryos, eines PCR-Mixes und der leitfadenspezifischen Screening-Primer ein, um somatische Mutationen in der Zielstelle zu identifizieren (Tabelle 1).
- Gießen Sie ein 2,5% Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/FSME-Gel mit Kämmen, die etwa 0,625 cm breite Vertiefungen erzeugen. Dieser breite Kamm ermöglicht eine bessere Auflösung bei der Erkennung von Größenänderungen der genomischen Sequenz. Nachdem das Gel erstarrt ist, legen Sie es in eine Elektrophoresekammer, die FSME-Laufpuffer enthält.
- Fügen Sie 5 μL 6x Ladenfarbstoff zum PCR-Produkt hinzu und laden Sie 25 μL dieser Mischung in das Gel. Stellen Sie sicher, dass die injizierten und die Kontrollproben in derselben Reihe des Gels ausgeführt werden. Nachdem alle Proben geladen sind, fügen Sie 5 μL Ethidiumbromid pro 1 L FSME-Laufpuffer zum positiven Ende der Gelbox hinzu.
- Lassen Sie das Gel bei 120 V laufen, bis sich die DNA-Banden auflösen oder die DNA sich dem Ende der Spur genähert hat. Wenn das Cas9 INDELs an der Zielstelle erzeugt, wird typischerweise ein Abstrich in injizierten Proben beobachtet, nicht jedoch in den Kontrollen.
- Wenn Abstriche an mindestens drei der vier Führungsstellen bei Embryonen beobachtet werden, denen vier Leit-RNAs injiziert wurden, wachsen die injizierten Geschwisterembryonen auf.
- Wenn die injizierten Proben keine Abstriche in der erforderlichen Anzahl von Führungsstellen enthalten, entwerfen Sie neue Guide-RNAs, um diejenigen zu ersetzen, die nicht funktioniert haben, und erstellen Sie einen neuen Pool von Guide-RNAs, der die funktionierten und die neu entworfenen enthält. Injizieren und testen Sie den neuen Pool für somatische INDELs wie oben beschrieben.
5. Identifizierung maternaler Effekt-Phänotypen in maternalen Crispant-Embryonen
HINWEIS: Sobald die injizierten F0-Weibchen die Geschlechtsreife erreicht haben, haben ihre Keimbahnzellen das Potenzial, eine Mischung aus mütterlichen Crispant- und Wildtyp-Embryonen zu erzeugen. Obwohl diese Mischung interne Kontrollen für die Befruchtung und das Entwicklungstiming ermöglicht, ist es dennoch vorteilhaft, eine Wildtyp-Kreuzung als externe Kontrolle einzurichten, falls ein Gelege von F0-Weibchen nur mütterliche knusprige Embryonen enthält.
- Am Nachmittag vor dem Experiment stellten die F0-injizierten Weibchen gegen Wildtyp-Männchen auf und kontrollierten Wildtyp-Kreuzungen in Standard-Zebrafisch-Paarungsboxen. Setzen Sie sowohl den männlichen als auch den weiblichen Fisch in dasselbe Becken, trennen Sie sie jedoch mit einem Paarungskastenteiler oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz.
- Lassen Sie das Männchen und das Weibchen am Morgen des Experiments mit der Paarung beginnen, z. B. indem Sie den Trennkasten entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen.
- Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten, indem Sie den Eiablageeinsatz in einen neuen Boden des Paarungsbeckens bewegen, der frisches Systemwasser enthält, und den Tank mit einem Etikett versehen, das das einzelne F0-Weibchen identifiziert. Nehmen Sie das alte Paarungsbecken und gießen Sie das Wasser durch ein Teesieb, um die Embryonen aus einem einzelnen 10-minütigen Gelege zu sammeln.
- Nachdem die Embryonen eines einzigen 10-minütigen Geleges im Sieb gesammelt wurden, werden sie in eine Petrischale mit 1x E3-Medien überführt. Beschriften Sie die Petrischale mit dem Zeitpunkt der Entnahme und den Fischinformationen.
- Beobachten Sie unter einem Seziermikroskop mit einer Durchlichtquelle die Entwicklung der Embryonen jede Stunde für die ersten 6-8 h und täglich für die nächsten 5 Tage.
- Identifizierung potenzieller mütterlicher Crispant-Embryonen durch grobe morphologische Veränderungen in ihrer Entwicklung im Vergleich zu zeitangepassten Wildtyp-Kontrollen29.
- Bringen Sie die potenziellen mütterlichen Crispant-Embryonen in eine Petrischale, die 1x E3-Medien und Assay für den morphologischen Phänotyp bei 24 hpf und die Lebensfähigkeit (z. B. Schwimmblaseninflation) 5 Tage nach der Befruchtung enthält.
6. Sequenzierung von Allelen in mütterlichen Crispant-Haploiden
HINWEIS: Maternale Crispant-Haploide enthalten ein einzelnes Allel im Ziellocus, was die Identifizierung von INDELs im Zielgen mittels Sanger-Sequenzierung ermöglicht. Mütterliche Crispant-Haploide-Embryonen können auch mit Next-Generation-Sequenzierungsassays analysiert werden. Es wird erwartet, dass Embryonen, die einen mütterlichen Crispant-Phänotyp aufweisen, eine Läsion an mindestens einer der vier Zielstellen tragen (siehe Diskussion).
- Am Nachmittag vor dem Experiment wurden Paarungspaare von F0-Weibchen aufgestellt, von denen bekannt ist, dass sie mütterliche Crispant-Embryonen produzieren, die mit Wildtyp-Männchen gekreuzt wurden. Halten Sie die Wildtyp-Männchen physisch von den Weibchen mit einem Paarungskastenteiler getrennt oder legen Sie das Weibchen in den Eiablageeinsatz.
- Entfernen Sie am Morgen des Experiments die physische Trennwand oder legen Sie sowohl die Männchen als auch die Weibchen in den Eiablageeinsatz, um die Paarung einzuleiten. Bei den ersten Anzeichen einer Eiablage unterbrechen Sie die Brut, indem Sie das Männchen und das F0-Weibchen trennen. Bewahren Sie jedes getrennte F0-Weibchen in einzelnen Steckboxen auf.
- Bereiten Sie UV-behandelte Spermienlösung unter Verwendung von Hoden eines Wildtyp-Männchens für jeweils 100 μL Hank-Lösung vor (Tabelle 2), die ausreicht, um extrudierte Eier von einem Weibchen zu befruchten, wie zuvor beschrieben31.
- Extrudieren Sie manuell reife Eier von den vorausgewählten F0-Weibchen und führen Sie eine In-vitro-Fertilisation (IVF) mit den UV-behandelten Spermiendurch 31.
- Lassen Sie nach der In-vitro-Fertilisation die haploiden Embryonen sich entwickeln, bis der mütterliche Crispant-Phänotyp beobachtet ist, und legen Sie diese Embryonen in eine andere Petrischale.
- Sobald die mütterlichen haploiden Crispant-Embryonen identifiziert wurden, lassen Sie sie mindestens 6 Stunden nach der Befruchtung entwickeln.
- Um die genomische DNA aus mindestens zehn mütterlichen haploiden Crispant-Embryonen zu extrahieren, legen Sie einen einzelnen haploiden Embryo in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens, entfernen Sie überschüssige E3-Medien aus der Vertiefung und fügen Sie 50 μL 50 mM NaOH hinzu.
- Inkubieren Sie die Embryonen bei 95 °C für 20 min. Dann kühlen Sie die Proben auf 4 °C ab, fügen Sie 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) hinzu und wirbeln Sie für 5-10 s. Die extrahierte DNA kann bei -20 °C bis zu 6 Monate gelagert werden.
- Um zu identifizieren, welche Leitstellen INDELs enthalten, entwerfen Sie Sequenzierungsprimer, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das alle vier CRISPR-Cas9-Zielstellen enthält. Diese Sequenzierungsprimer ermöglichen die Identifizierung von INDELs, die sich über mehrere Führungsstellen erstrecken.
- Richten Sie zwei 25-μL-PCR-Reaktionen pro Embryo unter Verwendung von 5 μL der vorbereiteten genomischen DNA und der Sequenzierungsprimer ein.
- Nachdem die PCR abgeschlossen ist, reinigen und konzentrieren Sie die beiden Proben mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit (siehe Materialtabelle). Dann reichen Sie das DNA-Fragment an die Sanger-Sequenzierung mit den Vorwärts- und Rückwärtssequenzierungsprimern ein.
- Nachdem das haploide mütterliche Crispant-Fragment sequenziert wurde, richten Sie es an die Wildtyp-Sequenz aus und identifizieren Sie INDELs an den Zielstellen mit einem Sequenz-Alignment-Programm.
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Ergebnisse
Der in diesem Protokoll beschriebene experimentelle Ansatz ermöglicht die schnelle und ressourcenschonende Identifizierung mütterlicher Effektphänotypen (Abbildung 1).
Erzeugung von mütterlichen Knuspern:
Bei der Entwicklung der vier Guide-RNAs für ein einzelnes Kandidaten-Gen mit mütterlichem Effekt sollte besonders berücksichtigt werden, wo die Guide-RNAs an DNA binden. Im Allgemeinen sollten sie alle zusammen mit minimalen bis keinen überlap...
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Diskussion
Das in diesem Manuskript vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und primäre molekulare Charakterisierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation anstelle der mehreren Generationen, die für vorwärts- und rückwärtsgenetische Techniken erforderlich sind. Derzeit ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene unbekannt. Dieser Mangel an Wissen ist zum Teil auf die zusätzliche Generation zurückzuführen, die erforderlich ist, um einen Phänotyp bei der Identifizierung von Genen mit mütterlich...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Wir danken ehemaligen und aktuellen Mitarbeitern der Tierhaltung des Pelegri Labors für ihre Pflege der Wasseranlage. Wir sind auch dankbar für die Kommentare und Einblicke in das Manuskript von Ryan Trevena und Diane Hanson. Die Finanzierung erfolgte durch NIH-Zuschuss an F.P. (GM065303)
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 8,4) | Invirogen | 15568025 | Für PCR-Mix |
| 1,5 mL Eppendorf Röhrchen | Jeder Hersteller | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthese von gRNA |
| 100 BP-Leiter | Jeder Hersteller | Für die Gelelektrophorese | |
| 100 % RNAse freies Ethanol | Jeder Hersteller | ||
| 100 % RNAse freies Ethanol | BeAny Maker | ||
| 100ml Becher | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Gefunden im MEGAshortscript T7 Transkriptionskit | Synthese von gRNA |
| 70% Ethanol | Synthese von gRNA (70 mL Ethanol + 30 mL Nukleasefreies Wasser) | ||
| Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | für Mikroinjektion |
| Bulk Pharma Natriumbicarbonat 35 Pfund | Bulk Reef Supply | 255 | Fischzubehör |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein mit NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Konstantes Oligonukleotid | Integrierte DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC | |
| Depression Glasplatte | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | Für IVF |
| Präparierzange | Dumont | SS | Für IVF |
| Präparierschere | Fine Science Tools | 14091-09 | Für IVF |
| Präparier-Steroskop (mit Durchlichtquelle) | Jeder Hersteller | für IVF-DNA | |
| Reinigen & Konzentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthese von gRNA |
| DNA Gel Loading Farbstoff (6x) | Jeder Hersteller | Für die Gelelektrophorese | |
| EconoTaq DNA-Polymerase | Lucigen | 30032-1 | Für PCR-Mix |
| Elektropherese Stromversorgung | Jeder Hersteller | Für Gelelektrophorese | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips für Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | für Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nukleasefrei) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | für Microinjection |
| Fischnetz | Any Maker | Fischzubehör | |
| Gefrorene Salzlake Garnelen | Salzlake Garnelen Direkt | Fischvorräte | |
| Allgemein Allzweck Agarose | Jeder Hersteller | Für die Gelelektrophorese | |
| Genspezifisches Oligonukleotid | Integrierte DNA-Technologien (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Handschuhe | Jeder Hersteller | ||
| Eiskübel | Jeder Hersteller | ||
| Instant Ocean Salt | Jeder Hersteller | Fischzubehör | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Männlich & Weiblicher Zebrafisch | |||
| MEGAshortscript T7 Transkriptionskit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthese von gRNA |
| Methylenblau | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | für E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | Für PCR-Mix |
| MgSO2· 7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Mikrospritzguss-Kunststoffform | World Precision Instruments | Z-Molds | für Mikroinjektion |
| Mikromanipulator | Jeder Hersteller | für | |
| Mikroinjektion Mikropipetten | Jeder Hersteller | ||
| Mikropipettenabzieher | Sutter | P-87 | für Mikroinjektion |
| Mikropipettenspitzen mit Filtern (alle Größen) | Any Maker | ||
| Mikropipetterspitzen ohne Filter (alle Größen) | Any Maker | ||
| Mikrowelle | Any Maker | ||
| Mineralöl | MiliporeSigma | m5904-5ml | für Mikroinjektion |
| MS-222 ( Tricain-D) | Any Maker | FDA-zugelassen | |
| Na2 HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Antihaftbeschichtete, RNasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 mL | Ambion | AM12450 | Synthese von |
| Wasser | Any Maker | ||
| Papierhandtuch | Any Maker | ||
| Pastro Pipetten | Any Maker | ||
| PCR-Streifenröhrchen Any | Maker | ||
| Petriplatten mit 100 mm Durchmesser | Any Maker | ||
| Phenolrot-Lösung | MiliporeSigma | P0290 | für Mikroinjektion |
| Kunststoff Schädlinge | VWR | 47747-358 | Für IVF |
| Kunststofflöffel | Beliebiger Hersteller | Für IVF | |
| Premium Grade Saline Garnelen Eier | Saline Garnelen Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | gefunden in MEGAshortscript T7 Transkriptionskit | Für Gelelektrophorese | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatel | Beliebiger Hersteller | ||
| Steril H2O | Beliebiger Hersteller | Für PCR-Mischung | |
| T4 DNA-Polymerase | NEB | M0203 | Synthese von gRNA-Band |
| Beliebiger Hersteller | |||
| TBE (Tris-Borat-EDTA) 10x | Beliebiger Hersteller | Für Gelelektrophorese | |
| Teefärber | Amazon | IMU-71133W | Fischzubehör |
| Thermo Scientific Owl 12-Zahn-Kamm, 1,0/1,5 mm dick, doppelseitig für B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | Für Gelelektrophorese |
| Thermo Scientific Eule EasyCast B2 Mini Gelelektrophorese-Systeme | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | Für Gelelektrophorese-Thermocycler |
| Jeder Hersteller | |||
| Thermocycler | Jeder Hersteller | ||
| Transilluminator | Jeder Hersteller | ||
| UV-Lampe | UVP | Modell XX-15 (Kat.-Nr. UVP18006201) | Für IVF |
| UV-Schutzbrillen | Jeder Maker | für IVF | |
| Waschflasche | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fischzubehör |
| Zebrafisch-Paarungsboxen | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fischzubehör |
| 1,5 ml Eppendorf Röhrchen | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 molare dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP Leiter | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse freies Ethanol | beliebiger Hersteller | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml Ethanol | ||
| Zubehör für Horizontale Gelbox | Fisher Scientific | 0,625 mm | |
| Agarose | beliebiger Hersteller | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, Dihydrat | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Kapillarschlauch | Cole-Parmer | UX-03010-68 | für Injektionsnadeln |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | jeder Hersteller | ||
| Präparierrezepte | jeder Hersteller | ||
| Präpariermikroskop | jeder Hersteller | ||
| Präparierschere | jeder Hersteller | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Farbstoff (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA-Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 Mikroliter |
| Ethanol (200 proof, nukleasefrei) | jeder Hersteller | ||
| Ethidiumbromid | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fischnetz | jeder Hersteller | feinmaschig | |
| Gefrorene Salzgarnele | LiveAquaria | CD-12018 | Fischfutter |
| Gel Kamm (0.625mm) | jeder Hersteller | ||
| Gel Elektropherese System | jeder Hersteller | ||
| Genspezifisches Oligonukleotid | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glas-Kapililarnadel | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds |
| Glasgeschirr | beliebiger Hersteller | ||
| Handschuhe | beliebiger Hersteller | ||
| Hank's Final Working Solution | Kombinieren Sie 9,9 ml Hank's Premix mit 0,1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | Kombinieren Sie folgendes in der angegebenen Reihenfolge: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Lagern Sie alle HS Solotions bei 4C | ||
| Hanks Lösung | |||
| Hank's Solution | |||
| https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization Hank's Stock Solution #1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0,358 g Na2HPO4 wasserfrei; 0,60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stammlösung #4 | 0,72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stammlösung #5 | 1,23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stammlösung #6 | 0,35g NaHCO3 in 10,0 ml ddH20; frisch machen Tag des Gebrauchs | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Eiskübel | jeder Maker | ||
| Instant Ocean Salt | Any Maker | für Fischwasser | |
| In-Vitro Transkriptionskit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure&Handel; DNase/RNase-freies destilliertes Wasser | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Männlicher und weiblicher Zebrafisch | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Methylenblau | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Mikromikromanipulator | |||
| Mikrospritzguss Kunststoffform | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Mikroinjektor | |||
| Mikronadel Schlitten | |||
| Mikropipette (1-10) mit Spitzen, | Hersteller | benötigt gefilterte p10-Spitzen | |
| Mikropipette (20-200) mit Spitzen | jeder Hersteller | ||
| Mikropipetter (100-1000) mit Spitzen | jeder Hersteller | ||
| Mikroplastik-Objektträger | |||
| Mikrowelle | jeder Hersteller | ||
| MiliQ Wasser | alle Hersteller | ||
| Mineralöl | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Schmaler Spatel | beliebig | Hersteller | |
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Papiertuch | beliebiger Hersteller | ||
| Pastro Pipetten | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR Primer flankierende Führungsstelle | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR Primer flankierende Führungsstelle RNA Schnittstelle | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard entsalzt | |
| PCR-Streifenröhrchen | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petrischalen | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm Durchmesser 100 mm x 15 mm |
| Phenolrot | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipettenspitzen | beliebig 10 | ul, 200 ul und 1000 ul Spitzen | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit (in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse freie Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse freies Wasser | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Natriumbicarbonat (Zelle | Sigma | S5761 | Fischwasser |
| Natriumbromid Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software für die Sequenzierung von Analysen | |||
| Sterlie | |||
| H2O | jede Marke | ||
| T4 DNA-Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Klebeband | jeder Marke | ||
| TBE (Tris-Borat-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | erhältlich in den meisten Küchengeschäften |
| Thermocycler | |||
| Transferpipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | Fisher Scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC | |
| UV-Lampe | UVP UV-Schutzbrille | ||
| jeder Hersteller | |||
| Waschflasche | Fischer wissenschaftlich | S39015 | |
| Zebrafisch-Paarungsboxen | jeder Hersteller | ||
| PCR Puffer Rezept | Fügen Sie 171,12 ml steriles H20 hinzu; 0,393 mL 1M MgCl2; 2,616 mL 1 M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8,4) 13.092mL 1M KCl; 0,262 mL 1% Gelatine. 20 Minuten autoklavieren lassen, dann die Solotion auf Eis abkühlen lassen. Fügen Sie als nächstes 3,468 ml 100 mg/ml BSA hinzu; 0,262 mL dATP (100 mM), 0,262 mL dCTP (100 mM); 0,262 mL dGTP (100 mM); 0,262 mL dTTP (100 mL). Alliquote in sterile Eppendorf-Röhrchen |
Referenzen
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