Identifizierung der Quelle von sezernierten Proteinen in der Niere durch Brefeldin A-Injektion

Zusammenfassung

Die Identifizierung des Zelltyps, der für die Sekretion von Zytokinen verantwortlich ist, ist notwendig, um die Pathobiologie der Nierenerkrankung zu verstehen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Färbung von Nierengewebe auf Zytokine, die von Nierenepithelzellen oder interstitiellen Zellen produziert werden, unter Verwendung von Brefeldin A, einem Sekretionshemmer, und zelltypspezifischen Markern.

Zusammenfassung

Die chronische Nierenerkrankung (CKD) gehört zu den zehn häufigsten Todesursachen in den USA. Akutes Nierenversagen (AKI) ist zwar oft heilbar, prädisponiert Patienten aber für eine CNE im späteren Leben. Sowohl bei der AKI als auch bei der CKD wurden Nierenepithelzellen als wichtige Signalknoten identifiziert, wobei die Zellen durch die Sekretion von Zytokinen und anderen Proteinen den Krankheitsverlauf bestimmen können. Insbesondere bei CKD haben mehrere Beweise gezeigt, dass maladaptiv reparierte Röhrenzellen das Fortschreiten der Krankheit durch die Sekretion von transformierendem Wachstumsfaktor-beta (TGF-β), Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) und anderen profibrotischen Zytokinen vorantreiben. Die Identifizierung der Quelle und der relativen Anzahl der sezernierten Proteine aus verschiedenen Zelltypen in vivo bleibt jedoch eine Herausforderung.

In dieser Arbeit wird eine Technik beschrieben, bei der Brefeldin A (BFA) verwendet wird, um die Sekretion von Zytokinen zu verhindern, was die Färbung von Zytokinen in Nierengewebe unter Verwendung von Standard-Immunfluoreszenztechniken ermöglicht. BFA hemmt den Transport des endoplasmatischen Retikulums (ER) zum Golgi-Apparat, der für die Sekretion von Zytokinen und anderen Proteinen notwendig ist. Die Injektion von BFA 6 h vor der Tötung führt zu einem Aufbau von TGF-β, PDGF und CTGF in den proximalen Tubuluszellen (PTCs) in einem Maus-Cisplatin-Modell von AKI und TGF-β in einem Maus-Aristolochiasäure (AA)-Modell von CKD. Die Analyse ergab, dass BFA + Cisplatin oder BFA + AA das TGF-β-positive Signal im Vergleich zu BFA + Kochsalzlösung, Cisplatin oder AA allein signifikant erhöhte. Diese Daten deuten darauf hin, dass BFA verwendet werden kann, um den Zelltyp zu identifizieren, der spezifische Zytokine produziert, und die relativen Mengen und/oder verschiedene Arten von produzierten Zytokinen zu quantifizieren.

Einleitung

Es wird geschätzt, dass >10 % der Weltbevölkerung an einer Form von Nierenerkrankung^{leiden 1}. AKI zeichnet sich durch seinen schnellen Wirkungseintritt aus und ist weitgehend heilbar; Eine Episode von AKI kann jedoch Patienten prädisponieren, später im Leben eine CNE zu entwickeln ^2,3. Im Gegensatz zu AKI ist die CKD durch eine fortschreitende Fibrose und eine Verschlechterung der Nierenfunktion gekennzeichnet, was zu einer Nierenerkrankung im Endstadium führt, die eine Nierenersatztherapie erfordert. Die meisten Verletzungen der Nieren zielen auf die spezialisierten Epithelzellen ab, wie z. B. Podozyten oder proximale Tubuluszellen, aus denen das Nephron^{besteht 4,5}. Nach einer Verletzung helfen die überlebenden Epithelzellen, die Reparaturreaktion durch die Sekretion von Zytokinen und anderen Proteinen zu koordinieren. Auf diese Weise können die überlebenden Zellen die Immunantwort modulieren, den Umbau der extrazellulären Matrix steuern und die Organregeneration unterstützen.

Zytokine sind kleine, sezernierte Proteine, die für die Modulation der Reifung, des Wachstums und der Reaktionsfähigkeit mehrzelliger Organismen unerlässlich sind ^6,7. Sie fungieren als Botenstoffe zwischen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Immun- und Epithelzellen⁸. Obwohl angenommen wird, dass Zytokine hauptsächlich von Immunzellen sezerniert werden, haben langjährige Forschungen gezeigt, dass Nierenepithel- und interstitielle Zellen auch Zytokine als Signale für andere ansässige Nierenzellen wie Tubuluszellen, interstitielle Zellen und Immunzellen sezernieren ^9,10. Insbesondere PTCs spielen eine wichtige Rolle in der Initiierungs- und Erholungsphase nach AKI¹¹. Es ist jedoch bekannt, dass maladaptiv reparierte PTCs profibrotische Zytokine wie den transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), den plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor-D (PDGF-D) und den Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) sezernieren, die zur CKD-Progression beitragen¹². Daher verwenden Nierenepithelzellen sekretierte Zytokine, um Nierenschäden zu modulieren.

Es ist zwar bekannt, dass Nierenepithelzellen Zytokine sezernieren, aber die genaue Quelle und der relative Beitrag jedes Zelltyps waren aufgrund der technischen Herausforderungen bei der Untersuchung sekretierter Proteine schwer zu bestimmen¹³. Die Durchflusszytometrie, ein gängiger Ansatz zur Messung von Zytokinen, ist bei verletzten Nieren nur schwer durchzuführen, insbesondere bei stark fibrotischen Nieren. Bei der Cre-Rekombinase, die von einem Zytokin-Promotor angetrieben wird, werden Zytokin-Reportermäuse häufig verwendet, um den Zelltyp zu identifizieren, der ein bestimmtes Zytokin exprimiert. Die Verwendung von Reportermäusen ist jedoch begrenzt, da Reportermäuse in verschiedene Knockout-Hintergründe gekreuzt werden müssen, geeignete Reporter fehlen und jeweils nur ein Zytokin analysiert werden kann. Daher ist es notwendig, eine einfache, vielseitige und erschwingliche Technik zum Nachweis von Zytokin-freisetzenden Nierenzellen zu entwickeln.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Injektion von BFA, einem Sekretionsinhibitor, der den endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Transport in vivo blockiert, die Färbung von sezernierten Proteinen im Nierengewebe ermöglichen würde (Abbildung 1A,B), wie mit durchflusszytometrischen Assays^{gezeigt wurde 14,15}. Zusammen mit zelltypspezifischen Makern könnte diese Technik verwendet werden, um die Quelle und den relativen Beitrag von Zytokin-produzierenden Zellen in verletzten Nieren zu identifizieren. Im Gegensatz zu Proben für die Durchflusszytometrie können fixierte Gewebe unter Erhalt von Proteinen und Zellstrukturen langfristig aufbewahrt werden, was eine gründlichere Untersuchung der sekretorischen Zellen ermöglicht. Um diese Hypothese zu testen, wurden die Nieren von Mäusen mit einem Modell von AKI (Cisplatin) und einem Modell von CKD (Aristolochiasäure-Nephropathie (AAN)) verletzt, mit BFA injiziert und mit Standard-Immunfluoreszenztechniken gefärbt.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Tierverwendungsprotokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and User Committee des Vanderbilt University Medical Center genehmigt wurde.

1. Tiere

1. Verwenden Sie 8-12 Wochen alte männliche BALB/c-Mäuse (Körpergewicht: ca. 25 g) für Cisplatin- oder Aristolochiasäure-induzierte Nephropathie.
2. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse gesund sind und keine offensichtlichen Anzeichen von Stress oder Wunden vom Kampf aufweisen.
   HINWEIS: Wunden, insbesondere am Schwanz, könnten das hier beschriebene Protokoll beeinträchtigen. BALB/c-Mäuse wurden ausgewählt, da es bei diesen Mäusen einfacher ist, die Schwanzvene für die Injektion sichtbar zu machen. Das hier beschriebene Protokoll funktioniert auch für andere Mausstämme. Die Dosierung von Cisplatin oder Aristolochiasäure kann jedoch von Stamm zu Stamm unterschiedlich sein.

2. Cisplatin-Injektion

1. Cisplatin in steriler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen.
   HINWEIS: Cisplatin löst sich bei Raumtemperatur nicht vollständig auf. Es sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
2. Erwärmen Sie die Cisplatin-Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C und wirbeln Sie sie so lange auf, bis sich das Cisplatin vollständig aufgelöst hat.
3. Wiegen Sie die Mäuse und berechnen Sie das Volumen der Cisplatinlösung, das für die Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht (KG) benötigt wird.
4. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Abstrichen von Povidon-Jod (7,5%) und Alkohol (70%) abwechselnd jeweils 3x.
5. Injizieren Sie die Cisplatinlösung mit einer Insulinspritze mit einer 25-G-Nadel intraperitoneal.
6. Fahren Sie mit Abschnitt 4 am Tag 3 nach der Injektion fort.

3. Injektion von Aristolochiasäure (AA)

1. Aristolochiasäure-I wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml gelöst.
   HINWEIS: AA sollte in einem Abzug gehandhabt werden. AA-I sollte verwendet werden, da es die dominante Form ist, die eine Nierenschädigung hervorruft.
2. Die AA-Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C erwärmen und wiederholt vortexen, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
3. Wiegen Sie die Mäuse und berechnen Sie das Volumen der AA-Lösung, um 5 mg/kg Körpergewicht zu injizieren.
4. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Povidon-Jod (7,5%) und Alkohol (70%), tupfen Sie 3x ab.
5. Injizieren Sie die AA-Lösung mit einer Insulinspritze mit einer 25-g-Nadel intraperitoneal.
6. Injizieren Sie AA jeden zweiten Tag für insgesamt 3 Injektionen.
7. Fahren Sie mit Abschnitt 4 am Tag 42 nach der letzten Injektion fort.

4. Herstellung der BFA-Lösung

1. BFA wird in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, um eine Stammlösung herzustellen.
2. Lagern Sie die Stammlösung bei -20 °C.
3. Verdünnen Sie die BFA-Stammlösung mit sterilem PBS bei der endgültigen Arbeitskonzentration von 1,25 mg/ml
   HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal unmittelbar vor der Injektion eine frische Arbeitslösung vor.

5. Schwanzveneninjektion von BFA

1. Legen Sie den Käfig vor der Injektion 10 Minuten lang halb auf, halb ohne Heizkissen, um sicherzustellen, dass die Mäuse warm sind, um einen Abfall der Körpertemperatur zu verhindern, der zu einer Vasokonstriktion der Gefäße im Schwanz führen und die Injektion beeinträchtigen kann.
   HINWEIS: Stellen Sie den Käfig so auf die Heizkissen, dass sich die Hälfte des Käfigs auf dem Pad befindet und die andere Hälfte nicht. Auf diese Weise können die Mäuse, wenn sie sich warm fühlen, auf die andere Seite des Käfigs wechseln und umgekehrt.
2. Halten Sie die Mäuse mit handelsüblichen Rückhaltevorrichtungen geeigneter Größe fest.
3. Desinfizieren Sie den Schwanz dreimal mit einem Povidon-Jod- und Alkoholtupfer wie oben beschrieben.
4. Halten Sie den Schwanz waagerecht und visualisieren Sie die seitlichen Schwanzvenen (Abbildung 1C). Verwende eine Lichtquelle unter dem Schwanz, um die Venen sichtbar zu machen.
5. Führen Sie eine 28-G-Nadel ein und halten Sie die Nadel und die Spritze parallel zur Vene in Richtung des Kopfes.
6. Injizieren Sie 200 μl der 1,25 mg/ml BFA-Lösung (0,25 mg BFA). Warten Sie, bis die Vene frei wird, während das Blut durch die Injektionslösung ersetzt wird, was darauf hinweist, dass die Injektion erfolgreich war.
7. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie vorsichtig auf den Schwanz, bis die Blutung aufhört.
8. Setzen Sie die Mäuse wieder in den Käfig ein und überwachen Sie sie auf zusätzliche Blutungen oder Anzeichen von Stress.

6. Opferung und Entnahme der Nieren

1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer Überdosis Isofluran, gefolgt von einer Zervixluxation 6 h nach der BFA-Injektion.
   HINWEIS: Der 6-Stunden-Zeitpunkt wurde auf der Grundlage von Literatur gewählt, die zeigt, dass eine 6-stündige BFA-Behandlung in anderen Organen eine ausreichende Akkumulation von Zytokinen in den Zellen ermöglicht, um sie durch Immunfluoreszenzfärbung sichtbar zu machen¹⁶.
2. Unmittelbar nach der Tötung legen Sie den Bauch und das Herz der Maus durch einen ventralen Mittellinienschnitt frei.
3. Sammeln Sie 100-500 μl Blut für einen Blutharnstoffstickstoff-Test (BUN) durch Herzpunktion. Verwenden Sie 25-G-Nadeln mit 1-ml-Insulinspritzen, um das Blut zu entnehmen. Um eine Gerinnung zu verhindern, fügen Sie jeder Probe 5 μl Heparinlösung (100 mg/15 ml dH₂O) hinzu.
   HINWEIS: Für den BUN-Assay werden mindestens 20 μl Blut benötigt. Es können jedoch etwa 500 μl durch Herzpunktion nach Euthanasie gesammelt werden, was für andere Assays nützlich sein könnte. Sammle so viel Blut wie möglich.
4. Lagern Sie die Blutproben auf Eis, bis die Nieren in Abschnitt 7 entnommen werden.
   1. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 1.300 × g für 10 min.
   2. Isolieren Sie das Plasma vorsichtig und lagern Sie es bei -20 °C, bis es für die Durchführung des BUN-Assays in Abschnitt 17 unten bereit ist. Alternativ können Sie die Plasmaproben für Kreatinin-Assays aufbewahren.

7. Durchblutung und Entfernung der Nieren

1. Perfusionieren Sie die Maus mit 10-20 ml PBS durch den linken Ventrikel mit einer 20-ml-Spritze bei einer Flussrate von 2-4 ml/min, bis das Perfusat klar wird.
2. Entfernen Sie die Nieren, indem Sie die Nierenarterie und die Vene mit einer Pinzette nahe an der Papille halten und die Gefäße an der von der Niere abgewandten Seite durchtrennen.
3. Entfernen Sie die Nierenkapsel vorsichtig, indem Sie sie von Hand oder mit einer feinen, sterilen Pinzette abziehen.
4. Je nach Antikörper fahren Sie mit Abschnitt 8 für die Aufbereitung von fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe oder Abschnitt 10 für die Aufbereitung von fixiertem gefrorenem Gewebe fort.
   HINWEIS: Die Gewebeverarbeitung muss für jeden Antikörper, der für die Färbung verwendet werden soll, optimiert werden.

8. In Paraffin eingebettetes Gewebe für die TGF-β- und PDGF-D-Färbung

1. Halbieren Sie die Niere, indem Sie sie auf einen sauberen Glasobjektträger legen und mit einer neuen Rasierklinge horizontal schneiden. Legen Sie eine Hälfte in 10 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 24 Stunden auf einen End-over-End-Rotator mit einer Geschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Minute (U/min).
   HINWEIS: Die gesamte Niere wird für die Sektion nicht benötigt. Eine Hälfte der Niere kann gelagert oder für andere Assays verwendet werden.
2. Ersetzen Sie das PFA durch 70% Ethanol.
3. In diesem Stadium wird die Nierenhälfte zur Verarbeitung und Paraffineinbettung eingereicht, dann wird das in Paraffin eingebettete Nierengewebe bei 4 bis 6 μm mit einem Mikrotom geschnitten und auf vorgereinigte, geladene Objektträger^{montiert 17,18}.
   HINWEIS: Die Nieren wurden von der Translational Pathology Shared Resource des Vanderbilt University Medical Center verarbeitet und in Paraffin eingebettet und bei Raumtemperatur gelagert.

9. Entparaffinisierung und Rehydrierung

1. Legen Sie die Objektträger in ein Färbegestell für Objektträger und tauchen Sie sie 5 Minuten lang in eine Färbevertiefung, die D-Limonen enthält, wobei Sie darauf achten, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist. In einer Vertiefung mit frischem D-Limonen wiederholen.
2. Rehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger in serielle Verdünnungen von Ethanol zu 100 % (2x), 95 %, 90 % und 70 % für jeweils 5 Minuten tauchen.
3. Waschen Sie die Objektträger 5 Min. in fließendem dH₂O.
4. Führen Sie die Antigengewinnung durch, indem Sie die Abschnitte in Citratpuffer (pH 6,0) in einem Schnellkochtopf bei 121 °C und 15 psi für 45 Minuten inkubieren.
5. Waschen Sie die Objektträger in fließendem dH₂O für 20 min.
6. Fahren Sie mit Abschnitt 12 fort.

10. Vorbereitung des gefrorenen Gewebes für die CTGF-Färbung

1. Halbieren Sie die Niere entlang der horizontalen Achse mit einer frischen Rasierklinge.
   HINWEIS: Die gesamte Niere wird für die Sektion nicht benötigt. Eine Hälfte der Niere kann gelagert oder für andere Assays verwendet werden.
2. Legen Sie die Nierenhälfte in 10 mL 0,5 % PFA in ein 15 mL Röhrchen auf einen Rotator für 2 h bei 4 °C und einer Geschwindigkeit von 10 U/min.
3. Dekantieren Sie das PFA zur ordnungsgemäßen Entsorgung in einen Behälter und fügen Sie 10 mL 0,1 M Glycin in PBS für 1 h bei 4 °C bei einer Geschwindigkeit von 10 U/min hinzu.
4. Dekantieren Sie das Glycin, fügen Sie 10 ml 15%ige in PBS gelöste Saccharose hinzu und stellen Sie das Röhrchen über Nacht bei 4 °C und 10 U/min auf einen Rotator.
5. Die 15%ige Saccharose dekantieren und durch 10 ml 30%ige Saccharose, gelöst in PBS, für 1 h bei 4 °C und 10 U/min ersetzen.
6. Füllen Sie die Einbettungsform mit optimaler Schnitttemperaturmasse (OCT) und betten Sie die Nierenhälfte aus Schritt 10.5 mit der Schnittfläche der Niere nach unten ein.
7. Lege den Schimmelpilz mit der halben Niere und dem OCT vorsichtig in ein Becken mit flüssigem Stickstoff, um ihn einzufrieren.
   HINWEIS: Lassen Sie den flüssigen Stickstoff nicht direkt mit dem OCT in Kontakt kommen, da dies zur Blasenbildung führen kann. Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff muss geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden, z. B. Schutzbrille/Gesichtsschutz, Kryohandschuhe und Laborkittel. Es ist am besten, eine lange, ~25 cm lange Pinzette zu verwenden, um die Formen in flüssigen Stickstoff zu legen.
8. Sobald die Form fest gefroren ist, lagern Sie sie bei -80 °C.

11. Gefrorenes Trennen

1. Stellen Sie sicher, dass der Kryostat bei -20 °C ist.
2. Formen mit Proben in OCT im Kryostaten bei -20 °C für 2 h lagern, um die Temperatur auszugleichen.
3. Entfernen Sie die Form, indem Sie die Laschen festhalten und von unten drücken.
4. Legen Sie frisches OCT auf einen Probenhalter und legen Sie den gefrorenen Probenblock mit der Gewebeseite vom Probenhalter weg darauf.
5. Stellen Sie den Probenhalter und die Probe auf das Gefrierregal.
6. Platzieren Sie einen gewichteten Wärmeabzug auf dem Block, um die Oberfläche abzuflachen. Halten Sie die Kryostatabdeckung geschlossen, wenn Sie sie nicht verwenden, um Temperaturschwankungen zu vermeiden.
7. Sobald das frische OCT zwischen dem Probenblock und dem Probenhalter eingefroren ist, überprüfen Sie, ob die Verbindung sicher ist.
8. Klemmen Sie den Probenhalter auf den Kryostat-Mikrotomkopf.
9. Beginnen Sie mit dem Schnitt, bis das Gewebe im Probenblock sichtbar ist.
10. Das Nierengewebe wird bei 4-6 μm geschnitten und die Schnitte auf einen mit Raumtemperatur geladenen Objektträger¹⁹ aufgenommen.
11. Sobald das Gewebe aufgenommen ist, lagern Sie den Objektträger bei -20 °C bis -80 °C, bis er zum Färben bereit ist. Lassen Sie es nicht auftauen, bis es bereit ist, mit dem Färben zu beginnen.
12. Nehmen Sie vor dem Färben den/die Objektträger aus der Lagerung und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen.
13. Sobald Sie Raumtemperatur erreicht haben, waschen Sie die Abschnitte sofort zweimal bei Raumtemperatur 5 Minuten lang mit PBS, um die OCT-Verbindung zu entfernen.
14. Fahren Sie mit Abschnitt 12 fort.

12. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Umranden Sie die Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Barrieremarkierungsstift. Halten Sie mindestens 5 mm Abstand vom Gewebe zur hydrophoben Barrierekontur ein.
2. 50 μl Blockierungspuffer mit 3 % Eselsserum und 0,1 % Triton in 1 % Rinderserumalbumin/Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) auf den Schnitt geben und 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
3. Verdünnen Sie die Primärantikörper mit PBS in der entsprechenden Konzentration. Zum Nachweis von Zytokinen verwenden Sie 50 μl Lösungen von Primärantikörpern, die gegen TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) und CTGF (1:200) gerichtet sind. Zur Markierung von Myofibroblasten verwenden Sie 50 μl einer Lösung des primären Antikörpers, die gegen Alpha-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) gerichtet ist und mit Cy3 bei 1:200 konjugiert ist.
4. Entfernen Sie die Blockierungslösung und geben Sie die primären Antikörper in den Schnitt, um sicherzustellen, dass sie nicht aus der kreisförmigen hydrophoben Kontur austreten, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer. Tragen Sie die hydrophobe Barriere erneut auf, wenn eine Leckage auftritt.
5. 3x mit PBS 5 min waschen.
6. Verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper bei 1:200 mit PBS.
7. Inkubieren Sie die Proben mit 50 μl Sekundärantikörperlösungen für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
8. 5 Min. mit PBS waschen.
9. Verdünntes Lotus-Tetragonolobus-Lektin (LTL), konjugiert mit Fluorescein in PBS mit Ca2⁺ und Mg²⁺ in einer Konzentration von 10 μg/ml.
   HINWEIS: Ca²⁺ und Mg²⁺ sind für die LTL-Bindung erforderlich.
10. Inkubieren Sie das Gewebe mit 50 μl LTL-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
11. Mit PBS mit Ca²⁺ und Mg²⁺ 5 Min. waschen.
12. Inkubieren Sie mit 50 μl 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 5 μg/ml in Wasser), um DNA/Zellkerne 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zu färben.
13. Montieren Sie die Deckgläser, indem Sie 20 μl Antifading-Eindeckreagenz auf das Gewebe geben und das Deckglas langsam aufsetzen. Warten Sie 24 Stunden, bis sich das Antifading-Reagenz verfestigt hat, bevor Sie es aufnehmen.
    HINWEIS: Die Lektinbindung kann sich mit der Zeit verschlechtern, was zu einem Signalverlust führt. Es ist am besten, mit Lektin gefärbte Proben kurz nach dem Einrichten des Einbettreagenzes abzubilden. Wenn ein Signalverlust beobachtet wird, können Ca²⁺ und Mg²⁺ zum Einbettreagenz hinzugefügt werden, um die Färbung zu erhalten.

13. Bilderfassung

1. Schalten Sie das inverse Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit einem automatischen XY-Tisch ein.
2. Wählen Sie das Ziel "20x" aus.
3. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware (siehe Materialtabelle).
4. Klicken Sie auf Live , um das Live-View-Fenster zu öffnen.
5. Suchen Sie den Gewebeschnitt und stellen Sie sicher, dass er scharf ist.
6. Klicken Sie auf das Menü "Erfassen" und wählen Sie "Großes Bild scannen".
7. Richten Sie im Fenster "Großes Bild scannen " den zu scannenden Bereich ein, indem Sie den Tisch mit dem Joystick an den linken Teil des Gewebeschnitts verschieben und dann auf den Pfeil nach links klicken. Wiederholen Sie den Vorgang für die obersten, rechten und unteren Gewebesegmente.
8. Klicken Sie auf das Akquisitionsmenü .
9. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für großes Bild aktiviert ist.
   1. Wenn Sie Multichannel-Bilder erfassen, klicken Sie auf die Registerkarte Lambda .
   2. Klicken Sie auf jeden Kanal und stellen Sie die Belichtungszeit auf einen Wert ein, bei dem die Färbung sichtbar ist, ohne dass ein Teil des Bildes gesättigt wird.
      HINWEIS: Diese Einstellungen müssen innerhalb einer Versuchsgruppe konsistent sein. Das Ändern der Erfassungseinstellungen zwischen den Proben führt zu ungenauen Ergebnissen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 9.2 für jeden Kanal, der erfasst werden soll.
10. Klicken Sie auf Scannen.

14. Bildanalyse

1. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware.
2. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie das Bild und wählen Sie es aus.
3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bildfenster und wählen Sie polygonale Region-of-Interest (ROI).
4. Skizzieren Sie den ROI mit dem Freihand-Tool . Umreißen Sie die LTL-positiven Tubuluszellen oder α-SMA-positiven interstitiellen Zellen.
5. Klicken Sie auf die Registerkarte Messung | Schwelle.
6. Legen Sie die obere und untere Grenze des Schwellenwerts fest, indem Sie die Schieberegler auf beiden Seiten des positiven Signalbereichs einstellen.
7. Klicken Sie auf die Registerkarte ROI .
8. Klicken Sie auf das Symbol Exportieren , um die Werte zu speichern. Verwenden Sie eine Tabellenkalkulationssoftware, um den Prozentsatz des positiven Signalbereichs/ROI-Bereichs zu berechnen.

15. Alternative: Bildanalyse mit freier Software (ImageJ)

1. Öffnen Sie ImageJ.
2. Klicken Sie auf Datei | Öffnen , um ein Bild anzuzeigen.
3. Klicken Sie auf Freihandauswahl.
4. Wählen Sie den ROI aus, indem Sie mit dem Freihandwerkzeug skizzieren. Umreißen Sie die LTL-positiven Tubuluszellen oder α-SMA-positiven interstitiellen Zellen.
5. Klicken Sie auf das Menü Bearbeiten und wählen Sie Außen löschen.
6. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Messen aus, um den ROI-Bereich zu bestimmen.
7. Gehe zu Bild | Farbe | Kanäle teilen.
8. Passen Sie die obere und untere Grenze des Schwellenwerts an, um den positiven Signalbereich zu erkennen.
9. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Messen aus.
10. Speichern Sie die Daten.
11. Öffnen Sie die Daten mit einer Tabellenkalkulationssoftware und berechnen Sie das Verhältnis von positivem Signalbereich zu ROI-Bereich.

16. Optional: Bildgebung mit konfokalem Laserscanning-Mikroskop

HINWEIS: Um Bilder mit höherer Auflösung für die Veröffentlichung zu erhalten, liefert die konfokale Rastermikroskopie klarere Bilder und einen reduzierten Hintergrund im Nierengewebe.

1. Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop ein (siehe Materialtabelle).
2. Wählen Sie das 40-fach-Objektiv (siehe Materialtabelle).
3. Klicken Sie auf die Registerkarte "Lokalisieren " und suchen Sie die Taschentücher, indem Sie den Fokus anpassen.
4. Gehen Sie zur Registerkarte Erfassung , klicken Sie auf Kanäle und wählen Sie 1 AU in der Lochkamera-Einstellung.
5. Stellen Sie die Intensität der Laserverstärkung in jedem Kanal so ein, dass das positive Signal sichtbar, aber nicht gesättigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen innerhalb eines Satzes von experimentellen Stichproben konstant bleiben.
6. Klicken Sie auf Snap und speichern Sie das Bild im gewünschten Format.

17. Plasma-BUN-Spiegel

1. Die Proben bei -20 °C entnehmen und auf Eis auftauen.
2. Verdünnen Sie das Plasma mit dH₂O im Verhältnis 1:10.
3. Richten Sie für jede Probe drei separate Reaktionen in doppelter Ausführung in einer 96-Well-Platte ein.
   1. Für Probe plus Standard fügen Sie 5 μl 200 mg/dl Harnstoff und 20 μl verdünntes Plasma hinzu.
   2. Für die Probe allein sind 5 μl dH₂O und 20 μl verdünntes Plasma zuzugeben.
   3. Für die Blindprobe werden 5 μl dH₂O und 20 μl verdünntes Plasma zugegeben.
4. Mischen Sie 85 μl des Reagenzes + 1 μl Urease pro Probe, um die Arbeitslösung herzustellen.
5. Geben Sie 80 μl der Arbeitslösung in die Vertiefungen "Probe plus Standard" und "Probe allein".
6. 80 μl des Reagenzes (ohne Urease) werden in die Vertiefung "Probenblindprobe" aus Schritt 17.3 gegeben.
7. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um sie zu mischen, und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
8. Lesen Sie den OD₅₆₀ mit einem Tellerleser aus.
9. Berechnen Sie die Harnstoffkonzentration Gl (1) und rechnen Sie sie mit Gl (2) in BUN um.
   Harnstoff (mg/dl) = (Probe allein-Probe leer)/(Standard-Probe allein) x (Standard/4) x (Verdünnungsfaktor) (1)
   BUN (mg/dl) = Harnstoffkonzentration/2,14 (2)
   HINWEIS: Dieser Assay misst den Harnstoffgehalt (Molekulargewicht: 60) des Serums; BUN bezieht sich jedoch nur auf den Stickstoffgehalt von Harnstoff (Molekulargewicht: 28). Daher ist eine Korrektur von 2,14 (60/28) erforderlich, um die Harnstoffkonzentration in BUN umzurechnen.

Ergebnisse

Um die Rolle von tubulären Epithelzellen bei der Zytokinproduktion nach Cisplatin-induzierter AKI zu untersuchen, wurde Cisplatin in einer Konzentration von 20 mg/kg injiziert, gefolgt von einer intravenösen Injektion von 0,25 mg BFA am Tag 3 nach der Cisplatin-Injektion. Die Nieren wurden 6 h später entnommen. Paraffineingebettete Nieren wurden geschnitten und mit TGF-β, PDGF-D und CTGF gefärbt, repräsentativen Zytokinen, die für die Gewebereparatur bei AKI verantwortlich sind. Wie in Abbildung 2A

Diskussion

Es ist bekannt, dass Nieren-PTCs AKI und CKD durch die Sekretion von TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor sowie vielen anderen Proteinen regulieren 20,21,22,23. In ähnlicher Weise sezernieren Glomeruli, distale Tubuli und andere Nierenepithelzellen sowie interstitielle Zellen diese und/oder andere Proteine während einer Verletzung ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Insulinspritzen	BD	329654
10 mL Spritze	BD	302995
2 mL Tube	Fisher Marke	05-408-138
20 mL Spritze	BD	302830
25 G Nadeln	BD	305125
28 G Nadeln	BD	329424
96-Well-Platte	Corning	9017
Aristolochic acid-I	Sigma-Aldrich	A9461
α-SMA Antikörper konjugiert mit Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	RRID:AB_476856
Klinge für Kryostat	C.L. Sturkey. Inc	DT315R50
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B6542
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394
Zitronensäure	Sigma-Aldrich	791725
Konfokalmikroskop	ZEISS	LSM710
Konfokale Mikroskopie-Objektive	ZEISS	40x / 1.10 LD C-Apochromat WASSER
Konfokale Software	ZEISS	ZEN
Coplin Glas	Fisher Scientific	19-4
Deckglas	Marke Fisher	12545F
Kryostat	Leica	CM1850
CTGF Antikörper	Genetex	GTX124232	RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson Immunresearch	711-165-152	RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunresearch	705-175-147	RRID: AB_2340415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Einweg-Basisformen	Marke Fisher Marke	22-363-553
Eselsserum	Jackson Immunforschung	017-000-121
Ethanol	Decon Labs, Inc.	2701
Pinzette	VETUS	ESD-13
Glycin	Fisher Marke	12007-0050
Heizkissen	Kent scientific	DCT-20
Heparin-Natriumsalz	ACROS organics	41121-0010	100mg/15ml dH2O
Befeuchtete Kammer	Invitrogen	44040410	Eine mit Folie bedeckte Kunststoffbox kann als verwendet werden Alternative Befeuchtungskammer.
Insulinspritzen	BD	329461
Inverses Mikroskop	NIKON	Eclipse Ti-E2	Immunfluoreszenz
KIM-1 Antikörper	R & D	AF1817	RRID: AB_2116446
Lemozol (Histo-clear)	Nationale Diagnostik	HS-200
Lotus Tetragonolobus Lektin	Vektor	FL-13212
Objektträger	Fisher scientific	12-550-343
Mikrotom	Reichert	Jung 820 II
monochrome CMOS-Kamera	NIKON	DS-Qi-2
Maus Chirurgisches Kit	Kent scientific	INSMOUSEKIT
NIS Elements	NIKON
Objektive	NIKON	Plan Apo 20x/0.75	Bilderfassungssoftware in Verbindung mit Eclipse Ti-E2 (inverses Mikroskop)
OCT-Verbindung	Scigen	4586
Pap Pen	Vector	H-4000
PBS mit Calcium und Magnesium	Corning	21-030-CV
PBS ohne Calcium und Magnesium	Corning	21-031-CV
PDGF-D Antikörper	Thermo-Fisher scientific	40-2100
PFA	Elektronenmikroskopie Science	15710	RRID: AB_2533455
Platten-Reader	Promega	GloMax® Entdecken Sie den Microplate Reader	4 % PFA wird von 16 % in PBS verdünnt.
Povidon-Jod (Betadin)	Avrio Health L.P.	NDC 67618-151-17
Schnellkochtopf	Tristar 8	Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Antifade Reagenz	Invitrogen	P36930
Quantichrom Harnstoff (BUN) Assay Kit II	BioAssay Systems	DUR2-100
Einschneidige Rasierklinge für die Nierendissektion (.009", 0.23 mm)	IDL-Werkzeuge	521013
Objektträgerwärmer	Lab Scientific Inc.,	XH-2001
Software	NIKON	NIS-Elemente
Saccharose	RPI	S24060
TGF-b1 Anitkörper	Sigma-Aldrich	SAB4502954
Tris EDTA Puffer	Corning	46-009-CM	RRID: AB_10747473
Trinatriumcitrat-Dihydrat	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
Trinatriumcitrat-Dihydrat	Sigma-Aldrich
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Geladener Objektträger aus weißem Glas, Größe 25 x 75 mm, geschliffene Kanten, blauer mattierter	Globus Scientific	1358D