Methodenartikel

Ein Kontrast von drei Impftechniken, die verwendet werden, um die Rasse von unbekanntem Fusarium oxysporum f.sp. Niveum Isoliert

DOI:

10.3791/63181

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28. Oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Behandlung der Fusariumwelke der Wassermelone erfordert die Kenntnis der vorhandenen Erregerrassen. Hier beschreiben wir die Root-Dip-, befallenen Kernaussaat- und modifizierten Tray-Dip-Impfmethoden, um ihre Wirksamkeit bei der Rassentypisierung des pathogenen Pilzes Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon) nachzuweisen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fusariumwelke der Wassermelone (Citrullus lanatus), verursacht durch Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ist im Südosten der USA, insbesondere in Florida, wieder zu einem wichtigen Produktionsdruck geworden. Der Einsatz integrierter Schädlingsbekämpfungsstrategien, wie z. B. rassenspezifische resistente Sorten, erfordert Informationen über die Vielfalt und Populationsdichte des Erregers auf den Feldern der Erzeuger. Trotz einiger Fortschritte bei der Entwicklung molekulardiagnostischer Instrumente zur Identifizierung von Pathogenisolaten erfordert die Rassenbestimmung häufig Bioassay-Ansätze.

Die Rassentypisierung wurde durch Wurzel-Dip-Impfung, befallene Kernaussaatmethode und die modifizierte Tray-Dip-Methode mit jedem der vier Wassermelonendifferentiale (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR) durchgeführt. Isolate erhalten durch Berechnung der Krankheitsinzidenz fünf Wochen nach der Impfung eine Rassenbezeichnung. Wenn weniger als 33% der Pflanzen für eine bestimmte Sorte symptomatisch waren, wurden sie als resistent eingestuft. Diejenigen Sorten mit einer Inzidenz von mehr als 33% wurden als anfällig angesehen. Dieses Papier beschreibt drei verschiedene Methoden der Impfung zur Bestimmung von Rasse, Wurzel-Dip, befallenem Kern und modifizierter Tray-Dip-Impfung, deren Anwendungen je nach experimentellem Design variieren.

Einleitung

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Die bodenbürtigen Pilze, aus denen der Fusarium oxysporum species complex (FOSC) besteht, sind wirkungsvolle hemibiotrophe Pflanzenpathogene, die bei einer Vielzahl von Kulturen schwere Krankheiten und Ertragsverluste verursachen können1. Die durch F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) verursachte Fusariumwelke der Wassermelone hat in den letzten Jahrzehnten weltweit an Umfang, Häufigkeit und Schweregrad zugenommen 2,3. Bei Sämlingen ähneln die Symptome der Fusariumwelke oft einer Dämpfung. Bei älteren Pflanzen wird das Laub grau, chlorotisch und nekrotisch. Schließlich schreitet das Welken der Pflanzen zum vollständigen Zusammenbruch der Pflanze und zum Todfort 4. Direkter Ertragsverlust tritt aufgrund der Symptome und des Pflanzentodes auf, während indirekter Ertragsverlust aufgrund von Sonnenschäden auftreten kann, die durch die Beseitigung des Blattdaches verursachtwerden 5. Sexuelle Fortpflanzung und damit verbundene Fortpflanzungsstrukturen wurden bei F. oxysporum nie beobachtet. Der Erreger produziert jedoch zwei Arten von asexuellen Sporen, Mikro- und Makrokonidien, sowie größere, langfristige Überlebensstrukturen, die als Chlamydosporen bezeichnet werden und viele Jahre im Boden überleben können6.

Das FOSC wird basierend auf beobachteten Wirtsbereichen in Formae speciales eingeteilt, die normalerweise auf eine oder wenige Wirtsartenbeschränkt sind 1. Obwohl jüngste Forschungen darauf hindeuten, dass dieser Artenkomplex eine Zusammensetzung von 15 verschiedenen Arten sein könnte, sind die besonderen Arten, die Wassermelonen infizieren, derzeit unbekannt7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) ist der Name für die Gruppen von Stämmen, die ausschließlich Citrullus lanatus oder die domestizierte Wassermelone 8,9 befallen. F. oxysporum-Stämme innerhalb der meisten pathogenen Formae speciales weisen ein gewisses Maß an Diversität in Bezug auf ihre genetischen Komponenten und ihre Virulenz gegenüber einer Wirtsart auf. Zum Beispiel kann ein Stamm alle Sorten eines Wirts infizieren, während ein anderer nur die anfälligeren Sorten infizieren kann. Um eine solche Variation zu berücksichtigen, werden diese Gruppen informell in Rassen eingeteilt, die auf evolutionären Beziehungen oder gemeinsamen phänotypischen Merkmalen basieren. Innerhalb von Fon wurden vier Rassen (0, 1, 2 und 3) basierend auf ihrer Pathogenität gegen eine Reihe ausgewählter Wassermelonensorten charakterisiert, wobei die Entdeckung von Rasse 3 kürzlich10 stattfand.

Trotz dieser scheinbaren Vielfalt sind die Morphologien von Sporen oder Hyphen zwischen den Rassen der Fon-Rassen nicht unterscheidbar, was bedeutet, dass molekulare oder phänotypische Assays benötigt werden, um die einzigartige Rasse eines Isolatszu identifizieren 11. Die molekulare Forschung hat einige genetische Unterschiede identifiziert. Zum Beispiel wurde die Rolle von Secreted in Xylem (SIX) -Effektoren seit Jahren in F. oxysporum untersucht, und einige dieser Effektoren wurden auf den Chromosomen lokalisiert, die während des horizontalen Gentransfers ausgetauschtwurden 12. Zum Beispiel ist SIX6 in den Fon-Rennen 0 und 1 zu finden, aber nicht in Rennen 213. SIX Effektoren wurden mit der Pathogenität von F. oxysporum f. sp. lycopersici und F. oxysporum f. sp. cubense in Verbindung gebracht, die Fusariumwelke auf Tomaten bzw.Bananen verursachen 14,15,16,17. Die Analyse von SIX-Effektorprofilen unter Stämmen von F. oxysporum f. sp. spiniciae, dem Fusarium-Welkeserreger auf Spinat, hat eine Klassifizierung ermöglicht, die die genetische und phänotypische Vielfalt genau widerspiegelt18. Die Unterschiede zwischen den Virulenzmechanismen von Fon-Rassen sind jedoch derzeit nicht vollständig verstanden, und molekulare Assays, die bei ihrer Verwendung entwickelt wurden, haben inkonsistente und ungenaue Ergebnissegezeigt 19. Daher sind phänotypische Ergebnisse von Infektionsassays derzeit der beste Weg, um Isolate zu klassifizieren.

F. oxysporum infiziert zunächst Wirte durch die Wurzeln, bevor es sich auf den Weg zum Xylem20 macht. Dies macht die direkte Inokulation der Wurzeln einer bestimmten Wirtssorte zu einer effektiven Möglichkeit, eine Rassentypisierung durchzuführen, und ist die Grundlage der Wurzel-Dip- und Tray-Dip-Impfmethoden21. Wenn ein Wirt nicht infiziert wird, befindet sich F. oxysporum im Boden und kann jahrelang inaktiv bleiben. Der Anbau anfälliger Wassermelonensorten im Boden aus einem Interessengebiet ist eine Möglichkeit, auf das Vorhandensein von Fon zu testen. Die Erweiterung dieser Methode auf Sorten mit unterschiedlichen bekannten Widerstandsniveaus in Böden, die absichtlich mit Fon befallen sind, ist auch eine gute Möglichkeit, eine Rassentypisierung durchzuführen (Tabelle 1) und ist die Grundlage der befallenen Kernaussaatmethode. Die modifizierte Tray-Dip-Methode ist eine Variation der ursprünglichen Tray-Dip-Methode, die eine Hochdurchsatz-Renntypisierung ermöglicht, bei der viele Pflanzen und Feldisolate schnell untersucht werdenkönnen 22. Zu den wichtigen Faktoren eines schnellen und erfolgreichen rassentypisierenden Bioassays gehören die Verwendung von Sorten, die Unterschiede in der Resistenz gegen die verschiedenen Erregerrassen aufweisen, die Sicherstellung, dass das Inokulum während der Infektion sowohl biologisch aktiv als auch reichlich vorhanden ist, die Aufrechterhaltung einer Umgebung, die sowohl für den Erreger als auch für den Host förderlich ist, und die Verwendung eines konsistenten Bewertungssystems für die Schwere oder Inzidenz der Erkrankung. Dieses Papier beschreibt die Root-Dip23,24, die befallene Kernaussaat 25,26 und modifizierte Tray-Dip 22-Methoden für die phänotypische Rassentypisierung basierend auf den oben beschriebenen Prinzipien.

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Protokoll

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1. Bestimmung der Rasse durch Root-Dip-Methode (RDM)

  1. Vorbereitung der Versuchsumgebung
    1. Da die Symptomexpression stark von den Umweltbedingungen abhängt, halten Sie Pflanzen in einem kontrollierten Bereich. Überwachen Sie die relative Luftfeuchtigkeit, Temperatur, Photoperiode und Lichtintensität (Abbildung 1).
      1. Stellen Sie die Temperatur auf 26-28 ° C, die relative Luftfeuchtigkeit auf 50-75% ein und stellen Sie eine Photoperiode von 16 Stunden ein, um ein angemessenes Pflanzenwachstum und eine angemessene Pflanzengesundheit zu gewährleisten.
        HINWEIS: Um Hypoxie, Welken des Sämlings und / oder Samenfäule zu verhindern, überwässern Sie nicht und lassen Sie kein stehendes Wasser um die Sämlinge herum.
      2. Verwenden Sie zwei Leuchtstoffröhrenleuchten mit jeweils mindestens 1850 Lumen Licht und einer Farbtemperatur von 2.800 K pro Lichtbank, um das photosynthetische Wachstum zu unterstützen.
      3. Halten Sie den Bereich sauber und wenden Sie hygienische Praktiken an, einschließlich der Entfernung von Bodenabfällen und Pflanzenresten, um Schädlingsschäden und zufällige Infektionen zu vermeiden.
    2. Pflanzbedingungen
      1. Füllen Sie 8 x 16 Zellen (25 cm Breite x 50 cm Länge) beginnend mit Pflanzmittel und tippen Sie auf den Boden, um den Boden leicht zu komprimieren (Abbildung 2).
      2. Erhalten Sie Samen der vier unterschiedlichen Sorten: Black Diamond / Sugar Baby, Charleston Grey / Allsweet / Dixielee, Calhoun Grey und PI-296341-FR.
      3. Säen Sie Samen mit ihrem Scheitelpunkt (spitzem Ende), der nach oben zeigt, bis zu einer Tiefe, die ihrer Länge entspricht. Nachdem die Samen gesät wurden, bedecken Sie das Medium, das die vergrabenen Samen enthält, mit 100% Fuller's Earth oder einem anderen Bentonitton bis zu einer Tiefe von 0,3175-0,635 cm.
      4. Besprühen Sie die Wohnungen, um das Medium zu dämpfen, ohne stehendes oder Poolwasser zu erzeugen. Halten Sie anschließend die Medien feucht, indem Sie alle 180 Minuten 20 s besprühen oder einmal täglich von Hand gießen, bis die Samen etwa 5 Tage lang keimen. Nach der Keimung einmal täglich und nach Bedarf gießen, um das Wachstum der Sämlinge zu unterstützen.
    3. Medienvorbereitung
      HINWEIS: Beide Medien werden mit extra granuliertem Agar fest gemacht, um die Sporenernte durch Abkratzen der Oberfläche zu ermöglichen.
      1. Geklärtes V8-Saftmedium (V8)
        1. Bereiten Sie 500 ml geklärtes V8-Saftmedium (V8) 27 vor, indem Sie 100 ml geklärten V8-Original-100% Gemüsesaft mit 1% CaCO 3 bis 400 ml destilliertem Wasser hinzufügen.
        2. 7,5 g granuliertes Agar hinzufügen.
        3. Die Zutaten gut vermischen, autoklavieren und auf 50 °C abkühlen lassen, bevor sie in sterile Petrischalen gießen.
      2. Viertelstarke Kartoffeldextrose-Agar-Medien (qPDA)
        1. Bereiten Sie qPDA-Medium vor, indem Sie 4,5 g granuliertes Agar zu 500 ml destilliertem Wasser hinzufügen, fügen Sie 3,8 g Kartoffeldextrose-Agar hinzu.
        2. Die Zutaten gut vermischen, autoklavieren und auf 50 °C abkühlen lassen, bevor 12-15 ml in sterile Petrischalen gegossen werden.
  2. Vorbereitung von experimentellen Behandlungen
    1. Bereiten Sie das Inokulum vor.
      1. Fünf Tage nach dem Pflanzen (dpp) werden infiltrierte Papierscheiben (1-1,25 cm Durchmesser), die das bevorzugte F. oxysporum-Isolat enthalten, auf eine V8- und eine qPDA-Platte gelegt und in einem Inkubator (~ 28 °C) für acht Tage28 gelagert (Abbildung 3A).
      2. Am achten Tag des Pilzwachstums und am Tag vor der Impfung (siehe Abschnitt 1.3.2) werden die V8- und qPDA-Platten vom Inkubator in eine Biosicherheitskabine überführt.
      3. Geben Sie für jedes Isolat 6 ml sterilisiertes deionisiertes Wasser auf jede V8- und qPDA-Kulturplatte.
      4. Lösen Sie Konidien, indem Sie einen sterilen Zellstreuer über die mittlere Oberfläche kratzen (Abbildung 3B). Poolen Sie die flüssige konidielle Suspension und geben Sie sie in ein steriles 50-ml-Kulturröhrchen (Abbildung 3C).
      5. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte flüssige konidimale Suspensionsvolumen im 50-ml-Kulturröhrchen ungefähr 12 ml beträgt.
      6. Bevor Sie mit einem anderen Isolat fortfahren, sterilisieren Sie den Arbeitsbereich und den Zellstreuer mit Alkohol. Sterilisieren Sie den Zellstreuer, indem Sie ihn durch einen Bunsenbrenner führen, nachdem Sie ihn in ≥70% Ethanol getaucht haben.
      7. Sobald die flüssigen konidiellen Suspensionen für alle Isolate in Kulturröhrchen überführt wurden, quantifizieren Sie die Sporenzahl. Zuerst einen Wirbel eines einzelnen 50-ml-Kulturröhrchens und dosieren Sie 10 μL in jede Kammer eines Hämacytometers. Berechnen Sie dann die Anzahl der Sporen im Hämacytometer wie zuvor beschrieben29.
      8. Bereiten Sie die endgültige Inokulumlösung vor, indem Sie das berechnete Volumen für 106 + 10% auf ein anderes steriles Kulturröhrchen übertragen und das Gesamtvolumen durch Zugabe von sterilem entionisiertem Wasser auf 30 ml bringen.
      9. Lagern Sie diese Kulturröhrchen über Nacht bei 8 ± 1 °C.
        HINWEIS: Dies kann ohne Verlust der konidiellen Lebensfähigkeit erfolgen, wie aus unveröffentlichten Daten hervorgeht.
  3. Impfung
    1. Bereiten Sie die Impfung vor.
      1. Gießen Sie vor dem Tag der Impfung dreizehn Tage alte Sämlinge robust bis zur Bodentragfähigkeit.
      2. Beschriften Sie die Pfähle mit relevanten Informationen, einschließlich des zu testenden Isolats, der Wassermelonensorte und des Impfdatums.
      3. Platzieren Sie 6 x 12-zellige (20 cm breite x 40 cm lange) Styroporplatten, die zuvor mit 10% Bleichmittel desinfiziert und gut gespült wurden, um die geimpften Pflanzen aufzunehmen.
      4. Alle benötigten Materialien vorpositionieren (siehe Materialtabelle).
    2. Beimpfen Sie die Pflanzenwurzeln.
      1. Gießen Sie die Pflanzen einige Stunden vor Beginn der Impfung robust. Entfernen Sie die Pflänzchen mindestens 2 Stunden nach dem Gießen aus den 8 x 16-Zellen-Styropor-Flats und spülen Sie ihre Wurzeln ab, um anhaftende Pflanzgutpartikel zu entfernen.
      2. Lagern Sie die gespülten Pflanzen bis zur Verwendung vorübergehend in sauberen Behältern mit Leitungswasser und halten Sie die Sorten voneinander getrennt (Abbildung 4A). Trennen Sie die Pflänzchen in Gruppen von sechs Individuen und halten Sie die Sämlingsgruppen in nasse Papiertücher gewickelt auf einem Labortablett, um Austrocknung zu verhindern.
      3. Legen Sie 25-30 cm3 Erde in den Boden jeder Zelle der 6 x 12 Array-Styroporschale und verwenden Sie eine Spritzflasche, um den Boden zu benetzen, bis er sichtbar feucht ist.
      4. Beimpfen Sie die Pflanzen und pflanzen Sie sie entsprechend der Sorte um, so dass Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey und dann PI 296341 01 FR von links nach rechts gepflanzt werden.
      5. Beginnend mit der gesunden Kontrolle, legen Sie eine Gruppe von sechs unbeschädigten Sämlingen derselben Sorte in die 50 ml Röhren, die das Inokulum enthalten. Verwenden Sie im Falle der gesunden Kontrolle Leitungswasser anstelle einer Sporensuspension. Beimpfen Sie die Pflanzen zuletzt mit der Positivkontrolle (Fon race 3).
      6. Sobald Sie sich in der Röhre befinden, stellen Sie sicher, dass die Pflanzenwurzeln das Inokulum (Leitungswasser) erreichen und ausgesetzt sind.
      7. Wirbeln Sie die Röhren mit den Pflänzchen 30 s lang ein (Abbildung 4B). Legen Sie nach dem Vortexing ein einzelnes Pflänzchen pro Zelle in die 6 x 12 Styroporwohnungen. Legen Sie die Pflanzen der gleichen Sorte in die gleiche Spalte in der Schale.
      8. Nach dem Einsetzen desinfizieren Sie die behandschuhten Hände, indem Sie sie 30 s in Eimern mit 0,7% verfügbarer Chlorlösung halten, gefolgt von einer Leitungswasserspülung für 1 min.
      9. Danach die platzierten Pflänzchen mit Pflanzmedium bedecken und vorsichtig einstellen. Gießen Sie die Pflänzchen mit einer Spritze oder Pipette vorsichtig mit 20 ml pro Pflänzchen und vermeiden Sie dabei das Spritzen.
      10. Bevor Sie mit der nächsten Reihe von Pflanzen fortfahren, desinfizieren Sie die behandschuhten Hände erneut mit Chlorlösung und einer Leitungswasserspülung.
      11. Nachdem alle Pflänzchen wieder eingepflanzt wurden, gießen Sie sie wieder minimal, um einen Inokulumabfluss zu verhindern.
      12. Halten Sie die Pflänzchen über Nacht in einer geschlossenen, dunklen Umgebung mit einer Durchschnittstemperatur von 27 ° C. Am nächsten Tag bringen Sie die Pflanzen in das Gewächshaus und halten die Durchschnittstemperatur bei 27 ° C.
  4. Pflege und Pflege von geimpften Pflanzen
    1. Um einen Überlauf von überschüssigem Wasser zu verhindern, gießen Sie die Ebenen dreimal täglich für 4-5 Tage leicht, bis sich die Pflanzen stabilisiert haben.
    2. Überprüfen Sie die Tabletts 2-3 mal täglich für mindestens drei Tage, um eine ausreichende und gleichmäßige Abdeckung der Bewässerung zu gewährleisten.
    3. Vermeiden Sie das Austrocknen aufgrund von Sonnenlicht oder Beschattung, indem Sie die Ebenen drehen und / oder bei Bedarf eine zusätzliche Beschattung / Bewässerung bereitstellen.
    4. Düngen Sie die Pflanzen bei 3 dpp mit einem 20-20-20-Schnelldünger (10 g / 3,78 l) mit einer Rate von 3-6 ml pro Liter Wasser.
    5. 3-4 Wochen wöchentlich düngen.
    6. Halten Sie während dieses Schritts die gleichen Licht- und Umgebungsbedingungen aufrecht.

2. Bestimmen der Rasse durch die Infested Kernel-Methode (IKM)

  1. Befall der Kerne
    1. Bereiten Sie das Inokulum vor.
      1. Entweder aus einer gelagerten oder neu gesammelten Probe, isolieren und kultivieren Sie einen F. oxysporum f. sp. niveum-Stamm von Interesse auf einer Platte von qPDA bis zu dem Punkt, dass sein Wachstum die Hälfte der Platte bedeckt.
        HINWEIS: Dies zeigt, dass es aktiv und lebensfähig ist, was für einen erheblichen Befall des Getreides in späteren Schritten notwendig ist.
    2. Bereiten Sie die Kernel vor.
      1. Messen Sie auf einer Waage 200 g Roggenbeeren (Secale spp.) (oder Maxie var. Weizen (Triticum spp.) Kerne) in einem ausreichend großen Behälter ab und gießen Sie sie in einen oder mehrere 1 L Glas Erlenmeyerkolben. Geben Sie steriles Leitungswasser in die Kolben, um die Körner bis zu mindestens 5 cm vollständig abzudecken (Abbildung 5A).
      2. Die Kerne bei Raumtemperatur (~24 °C) für 2 h einweichen. das Wasser aus den Kolben ableiten; Schließen Sie die Öffnung mit einem Stück Baumwollrolle an, das in ein Käsetuch eingewickelt ist. und bedecken Sie die Öffnung mit Aluminiumfolienfolie (Abbildung 5B).
    3. Dekontaminieren Sie die Kerne. Sobald das Getreide Wasser aufgenommen hat, autoklavieren Sie es zweimal auf zwei verschiedene Arten, um andere unerwünschte Mikroben vor der Impfung abzutöten.
      1. Während der ersten Zeit das Korn in den vorbereiteten Kolben in einem Schwerkraftzyklus (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) für 1 h mit 5 min Trocknungszeit autoklavieren. Lassen Sie die Flaschen auf Raumtemperatur abkühlen.
      2. Bevor Sie das zweite Mal autoklavieren, geben Sie die Körner in einen kleinen Pilzzuchtbeutel mit einem 0,5-μm-Filter um. Entfernen Sie die Luft aus dem Beutel und falten Sie dann das überschüssige Plastik um den Beutel.
      3. Legen Sie die Tasche in einen autoklavensicheren Kunststoffbehälter. Decken Sie den Behälter mit Aluminiumfolienfolie ab (Abbildung 5C).
        HINWEIS: Verwenden Sie keinen Metallbehälter, wenn Sie die Körner in den Beuteln autoklavieren, da dies dazu führen kann, dass die Beutel schmelzen.
      4. Autoklavieren Sie den Behälter in einem Schwerkraftzyklus für 1 h mit 5 Minuten Trocknungszeit, dem gleichen Zyklus wie zuvor.
        HINWEIS: Autoklavieren Sie den Beutel nur beim zweiten Mal, nicht beim ersten, da der Filter und der Anschluss beeinträchtigt werden können, wenn die Beutel zweimal autoklaviert werden. Verhindern Sie Kondensation auf dem Filter, indem Sie die Beutel langsam und vollständig abkühlen lassen, bevor Sie sie aus dem Autoklaven entfernen, da der Wachstumsbeutelfilter beeinträchtigt wird, wenn er nass wird.
    4. Impfen Sie die Kerne.
      1. Arbeiten Sie mit der Kulturplatte und dem Beutel in einer Biosicherheitswerkbank und schneiden Sie Agarscheiben mit einem Durchmesser von 6 mm aus der Zone des aktiven Wachstums auf der Kulturplatte mit einer sterilen Korkbohrung der Größe #4. Klappen Sie die Tasche auf. Legen Sie mit einer strengen sterilen Technik 5 Agarscheiben in den Beutel. Verwenden Sie einen sterilen 50-ml-Messzylinder, um 35 ml steriles Leitungswasser zu messen und in den Beutel zu geben.
      2. Rollen Sie die Öffnung des Beutels etwas und besprühen Sie dann die Außenseite mit 70% Ethanol, um sie an der Oberfläche zu sterilisieren.
        HINWEIS: Besprühen Sie den Filter nicht, da diese Feuchtigkeit ihn ebenfalls beeinträchtigt.
      3. Schließen Sie den Beutel, indem Sie die Ecken zur Mitte und dann über zweimal über den Filter falten. Sichern Sie die Tasche mit Taschenklemmen und durchsichtigen Vinylschläuchen, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt werden.
        HINWEIS: Die Klemmen sind wiederverwendbar.
      4. Entfernen Sie den Beutel aus der Biosicherheitswerkbank.
    5. Lagern Sie den Erreger für das Wachstum.
      1. Bewahren Sie die Tasche aufrecht auf. Stellen Sie sicher, dass der Filter von der gegenüberliegenden Seite des Beutels weggezogen wird, um einen maximalen Gasaustausch zu ermöglichen (Abbildung 5D).
      2. Inkubieren Sie die Materialien bei Raumtemperatur für etwa drei Wochen. Verteilen Sie die Körner regelmäßig, um ein gleichmäßiges Wachstum des Erregers zu gewährleisten.
        HINWEIS: Die Taschen sind nicht wiederverwendbar.
  2. Infektion von Wassermelonensämlingen mit befallenem Getreide
    1. Quelle Wassermelonensamen wie zuvor beschrieben.
    2. Bestimmen Sie die experimentellen Gruppen.
      HINWEIS: Die einzigen Stämme des Erregers, die benötigt werden, sind die Isolate, die zur Identifizierung der Rasse getestet werden. Negativ- und Positivkontrollen werden jedoch dazu beitragen, Vergleiche mit Pflanzen ohne Infektion oder mit einem bestimmten Infektionsgrad anzustellen.
      1. Um eine Negativkontrolle vorzubereiten, verwenden Sie Weizenkerne, die nach der zuvor genannten Methode, jedoch ohne Impfung, sterilisiert wurden.
      2. Um eine Positivkontrolle vorzubereiten, verwenden Sie Weizenkerne, die mit einem bereits klassifizierten Stamm beimpft sind, zum Vergleich mit dem unbekannten Isolat.
    3. Kombinieren Sie Erde und Getreide.
      1. Messen Sie 14 Körner befallener Kerne in einer großen Plastiktüte (Abbildung 5E). Füllen Sie Kunststofftöpfe (15 cm Durchmesser x 10 cm Höhe) mit Vergussmischung, um die benötigte Mischungsmenge zu messen. Entleeren Sie die Mischung in den Beutel. Erstellen Sie ein Luftkissen in der Tasche und drehen oder verschließen Sie es.
      2. Mischen Sie die Kerne und den Boden, indem Sie den Beutel mehrmals umkehren. Für eine Negativkontrolle führen Sie den gleichen Prozess in einem anderen Beutel mit sauberen Kernen durch. Für eine Positivkontrolle führen Sie den gleichen Prozess in einem anderen Beutel mit Kernen durch, die von der Vergleichssorte befallen sind.
      3. Füllen Sie vier oberflächensterilisierte Töpfe mit der befallenen Bodenmischung. Für eine Negativkontrolle topfen Sie diese Mischung ein, bevor Sie mit Fon-kontaminiertem Boden umgehen.
    4. Säen Sie die Wassermelonensamen.
      1. Säen Sie sechs Samen in jeden Topf. Stellen Sie sicher, dass jeder Topf nur Samen von einer Sorte enthält. Positionieren Sie die Samen mit dem Spitzenende des Samens nach oben, um ein ordnungsgemäßes Wachstum während des Auflaufens zu ermöglichen (Abbildung 6A).
      2. Befeuchten Sie mit einer Sprühflasche die oberen 0,3-0,6 cm Erde mit Wasser. Stellen Sie eine durchsichtige Kunststoffschale (15 cm Durchmesser) unter und über jeden Topf, um eine feuchte Umgebung für die Samenkeimung zu schaffen (Abbildung 6B).
    5. Schaffen Sie Wachstumsbedingungen.
      1. Gießen Sie die Töpfe dreimal täglich mit einer Sprühflasche, um die Trübung ohne Abfluss aufrechtzuerhalten, bis die Samen gekeimt sind (ca. 5 Tage).
        HINWEIS: Die Menge des verwendeten Wassers nimmt mit der Pflanzengröße und der Topfgröße zu.
      2. Sobald die Samen gekeimt sind, bewegen Sie die obere Schale auf die Unterseite des Topfes.
      3. Gießen Sie die Pflanzen täglich nach Bedarf für ein optimales Pflanzenwachstum. Setzen Sie die Pflanzen einer Photoperiode von 16 h unter ähnlichen Lichtverhältnissen wie den zuvor beschriebenen und einer Temperatur von 27 °C (± 1 °C) aus.

3. Bestimmung des Rennens durch modifizierte Tray-Dip-Methode (MTDM)

  1. Vorbereitung der Materialien für Impfungen
    1. Legen Sie die Pflanzbedingungen fest.
      1. Füllen Sie 48-Zellen (3,68 cm Breite x 5,98 cm Länge x 4,69 cm Tiefe) Einsätze mit dampfpasteurisiertem Sand: Torf: Vermiculit (4:1:1) und klopfen Sie nach unten, um den Boden leicht zu komprimieren. Legen Sie die Einsätze in Kunststoffschalen (27,9 cm Breite x 53,3 cm Länge x 5,1 cm Tiefe).
      2. Säen Sie die Samen mit ihrem Scheitelpunkt (proximales Ende), der nach oben zeigt, bis zu einer Tiefe, die ihrer Länge entspricht.
      3. Beziehen Sie die Samen wie zuvor beschrieben.
      4. Danach halten Sie die Medien feucht, indem Sie alle 180 Minuten für 20 s besprühen oder einmal täglich von Hand gießen.
      5. Nach der Keimung (ca. 5 Tage) einmal täglich und nach Bedarf gießen, um das Wachstum der Sämlinge zu unterstützen.
    2. Bereiten Sie die Medien vor.
      1. Bereiten Sie qPDA-Medium vor, indem Sie 5,625 g granuliertes Agar zu 500 ml destilliertem Wasser hinzufügen; 4.875 g Kartoffel-Dextrose-Agar hinzufügen. Die Zutaten gut vermischen, autoklavieren und vor dem Einfüllen in sterile Petrischalen auf 50 °C abkühlen lassen. Die Petrischalen mit Parafilm verschließen und die Teller bis zur Verwendung im Kühlschrank (4 °C) aufbewahren.
      2. Um Brühe medium zuzubereiten, wiegen Sie und geben Sie 24 g Kartoffeldextrose in eine 1 L Flasche. Bringen Sie die Mischung auf 1000 ml, indem Sie destilliertes Wasser in die Flasche geben, und legen Sie die Flasche auf eine heiße Platte und rühren Sie, bis sie sich aufgelöst hat. Geben Sie 100 ml der Brühe in 250 mL Erlenmeyerkolben. Verwenden Sie ein Käsetuch, um die Flaschen und den Autoklaven zu versiegeln.
    3. Bereiten Sie das Inokulum vor.
      1. Beimpfen Sie sieben Tage vor dem Pflanzen fünf qPDA-Platten mit infiltriertem Papier28 und lagern Sie sie acht Tage lang in einem 14 h / 10 h Dunkelzyklus22 in einem inkubierten Bereich.
      2. Am siebten Tag zwei 1 cm2 Agar Stecker in je 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 mL Kartoffeldextrose geben. Legen Sie die Erlenmeyerkolben 7 Tage lang bei 200 U / min in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h / 10 h auf einen Tischschüttler.
      3. Ernten Sie am Tag der Impfung (14 Tage nach der Aussaat) die Sporen, indem Sie das Inokulum durch vier Schichten steriles Käsetuch filtern.
      4. Bestimmen Sie die mikrokonidielle Konzentration in den Kolben mit einem Hämozytometer, wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie eine 7-L-Inokulumsuspension in einer Kunststoffwanne (40,6 cm Breite x 67,3 cm Länge x 16,8 cm Tiefe) vor, indem Sie das richtige Volumen der Sporensuspension in steriles Wasser für eine endgültige Sporenkonzentration von 1 × 106 ml−1 überführen (Abbildung 7A).
  2. Impfung
    1. Vierzehn Tage nach der Aussaat (mindestens erstes echtes Blattstadium) die Zelleinsätze mit den Sämlingen in Schwimmbandschalen (26,9 cm Breite x 53,7 cm Länge x 6,28 cm Tiefe) geben. Legen Sie die Schwimmhäute mit den Sämlingen vorsichtig in eine Kunststoffwanne, die die 7 L Inokulumsuspension enthält. Beimpfen Sie jedes Tablett nacheinander (Abbildung 7B).
    2. Lassen Sie die Sämlinge 15 Minuten lang ungestört im Inokulum verweilen. Nach 15 Minuten die Zelleinsätze mit den beimpften Keimlingen vorsichtig in lochlose Schalen (27,9 cm Breite x 53,3 cm Länge x 5,1 cm Tiefe) geben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Fach.
    3. Stellen Sie die lochlosen Tabletts auf die Gewächshausbank und gießen Sie sie nach Bedarf. Halten Sie die gleichen Licht- und Umgebungsbedingungen wie für den Root-Dip-Bioassay ein.

4. Bewertung der Krankheit

  1. Wählen Sie Zeitintervalle für die Bewertung aus.
    1. Für die Wurzel-Dip- und modifizierten Tray-Dip-Methoden beginnen Sie eine Woche nach der Beimpfung der Pflänzchen mit der Bewertung und fahren Sie weitere vier Wochen wöchentlich fort.
      HINWEIS: Der kombinierte Datensatz wird fünf Sätze von Beobachtungen während dieses Zeitraums enthalten.
    2. Wenn Sie die Kernel-Methode verwenden, beginnen Sie erst mit der Bewertung, sobald die Sämlinge auftauchen, und setzen Sie sie wöchentlich für insgesamt sechs Bewertungen fort.
  2. Beobachten und berechnen Sie die Inzidenz.
    1. Machen Sie während jeder Bewertung digitale Bilder, um den Krankheitsverlauf zu dokumentieren.
    2. Melden Sie die Häufigkeit von Welke und Pflanzentod. Berechnen Sie die Inzidenz, indem Sie die Summe der symptomatischen Pflanzen im Vergleich zur gesunden Kontrolle und die Anzahl der toten Pflanzen als Anteil an der Gesamtzahl der Pflanzen in dieser Sorte nehmen.
  3. Analysieren Sie die Ergebnisse. Vergleichen Sie die Infektionsmuster zwischen den Sorten und zwischen den Experimentgruppen, wenn Kontrollen verwendet wurden.

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Ergebnisse

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Diese Experimente helfen, die relative Resistenz von häufig angebauten Sorten zu definieren (Tabelle 1). Diese Informationen können dann verwendet werden, um Managementempfehlungen basierend auf lokalen Fon-Populationen zu leiten. Mit anderen Worten, wenn bekannt ist, dass Rasse 0 oder 1 in einem kommerziellen Feld vorhanden ist, kann der Landwirt geneigt sein, eine "resistente" Sorte wie Calhoun Gray, Sunsugar oder gleichwertig anzubauen. Die Ergebnisse der Bioassays unter Verwendung aller Methoden zeig...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drei Methoden der Rassentypisierung wurden vorgestellt. Jede dieser Methoden eignet sich am besten für bestimmte Fragestellungen und experimentelle Bedingungen. Die befallene Kernimpfmethode (Bodenbefall) ist vielleicht einfacher und unkomplizierter, was sie besonders nützlich für die Beurteilung der Pathogenitätmacht 30. Die Verwendung dieser Methode für einfaches Renntypisieren ist sehr effektiv. Die Anwendung der Methode zur Bestimmung der Resistenz einer bestimmten Sorte könnte jedoch eine Her...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten Dr. Ali und dem Plant Molecular Diagnostic Laboratory sowie Dr. Pingsheng Ji von der University of Georgia danken, deren Leitung und Unterstützung zur Etablierung unseres Fon-Programms beigetragen haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100% Fuller" s ErdeSigma-AldrichF200-5KG
1 L Glas ErlenmeyerkolbenPYREX4980-1L
15 mL FalkenröhrchenFisher Scientific14-959-49B
50 mL MesszylinderLaborsicherheitsversorgung41121805
50 mL Eppendorf Konische RöhrchenFisher Scientific05-413-921
AluminiumfolienverpackungReynolds Wrap720
BleachWalmart587192290
BunsenbrennerFisher Scientific03-391-301
CaCO3sigma-Aldrich239216
ZellaufstreuerFisher Scientific08-100-11
CheeseclothLions Services, Inc8305-01-125-0725
Klare KunststoffschalenVisions Wave999RP6CLSS~15 cm Durchmesser
Klare Vinylschläuche für PilzbeutelklemmenPilzzubehör6" für kleine Tasche, 8" für mittlere Tasche, 10" für große
Tasche WattebällchenFisherbrand22-456-885Steriles
EthanolFisher ChemicalA4094100%, dann mit Wasser kombinieren, um 70% für den Gebrauch herzustellen
LeuchtstoffröhrenleuchtenMaxLumeModell T52800 K Farbtemperatur, 24'' oder 48'' langer
granulierter AgarVWR International90000-786
HandsprühflascheFähigkeit Ein24122002~ 0,95 L
HämazytometerFisher Scientific02-671-55AZweikammer-Hämazytometer
LabortablettsFisher Scientific15-236-2A
Große, verschließbare PlastiktütenZiploc43080538 cm x 38 cm
Mister / GießkanneBar5FB10H22
Pilzbeutel ClampPilzzubehör6" für kleine Tasche, 8" für mittlere Tasche, 10" für große
Tasche NitrilhandschuheFisher Scientific19-130-1597D
Organic Rye BerriesShroom Versorgung0,5 Gallonen oder 25 lb Beutel
P1000 Pipette und SpitzenFisher Scientific14-388-100
PetrischalenFisherbrandFB0875713Rund, 100 mm Durchmesser, 15 mm Höhe
PflanzsubstratJolly GardenerPro-Line C/B
KunststoffkrugBrandTechUX06008501 L oder größer
Pflanztöpfe aus KunststoffNeo/SCI01-1177~15 cm Durchmesser und ~10 cm Höhe
Autoklavensicherer KunststoffbehälterThermoScientific UX06010223 L
Kartoffel-Dextrose-Agar-Medium mit viertelfester StärkeCole-ParmerUX1420028Verwenden Sie Pulver in Kombination mit der Rezeptur für die QPDA
Scientific Waage, gemessen in gOhaus30208458Jede präzise Waage, die 200 g aufnehmen und messen kann, funktioniert Größe
#4 KorkbohrungCole-ParmerNC9585352
kleiner PilzzuchtbeutelPilzzubehör0,5 Mikron Filter, kommt auch in mittleren und großen Größen
ErdkelleWalmart563876946
Styroporplatten (6 x 12 Zellen)SpeedlingModell TR72A
Styroporplatten (8 x 16 Zellen)SpeedlingModel TR128A
Spritze (5 oder 10 mL)Fisher Scientific14-829-19C
TimerWalmartTM-01
V8 Original 100% GemüsesaftWalmart564638212
VortexFisher Scientific02-215-418
Wassermelonenkern - Black DiamondWillhite Seed Inc17
Wassermelonensamen - Calhoun GrayHolmes Seed Company4440
Wassermelonensamen - Charleston GrayBonnie Plants7.15339E+11
Wassermelonensamen - PI 296341-FRKontakt AutorenKontaktieren Sie die Autoren
Weizenkerne (Maxie var.) (optional)Alachua County Feed & Samen

Referenzen

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Fusarium WelkeWassermelonenkrankheitRassenbestimmungWurzeltauchmethodebefallene KernmethodeTabletttauchmethodePathogenisolatKrankheitsinzidenzresistente Kultursorten

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