Es wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung des bakteriostatischen Diamid Masarimycin vorgestellt, einer niedermolekularen Sonde, die das Wachstum von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae hemmt, indem sie auf den Abbau der Zellwand abzielt. Seine Anwendung als chemische Sonde wird in Synergie-/Antagonismus-Assays und morphologischen Studien mit B. subtilis und S. pneumoniae nachgewiesen.
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Methodenartikel
Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Peptidoglycan (PG) in der Zellwand von Bakterien ist eine einzigartige makromolekulare Struktur, die Form und Schutz vor der Umgebung verleiht. Zentral für das Verständnis des Zellwachstums und der Zellteilung ist das Wissen, wie der PG-Abbau die Biosynthese und den Zellwandaufbau beeinflusst. Kürzlich wurde über die metabolische Markierung von PG durch die Einführung von modifizierten Zuckern oder Aminosäuren berichtet. Während eine chemische Abfrage von Biosyntheseschritten mit niedermolekularen Inhibitoren möglich ist, sind chemisch-biologische Werkzeuge zur Untersuchung des PG-Abbaus durch Autolysine unterentwickelt. Bakterielle Autolysine sind eine breite Klasse von Enzymen, die am eng koordinierten Abbau von PG beteiligt sind. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer niedermolekularen Sonde, Masarimycin, einem Inhibitor von N-Acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, und des Zellwandstoffwechsels in Streptococcus pneumoniae vorgestellt. Die Herstellung des Inhibitors über mikrowellengestützte und klassische organische Synthese ist vorgesehen. Seine Anwendbarkeit als Werkzeug zur Untersuchung der grampositiven Physiologie in biologischen Assays wird vorgestellt.
Einleitung
Peptidoglycan (PG) ist ein netzartiges Polymer, das die Zellform und -struktur sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien 1,2 beschreibt. Dieses Heteropolymer ist eine Matrix von Aminozuckern, vernetzt durch kurze Peptide 3,4,5,6 mit einem Rückgrat, das aus β-(1,4)-verknüpften alternierenden N-Acetylglucosamin- (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)-Resten besteht (Abbildung 1)1. An den C-3-Lactylanteil von Mu....
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Protokoll
1. Allgemeine Methoden
HINWEIS: Alle Compounds wurden von Standardlieferanten bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet.
- Führen Sie eine Dünnschichtchromatographie (TLC) auf einer mit Kieselgel XG F254 vorbeschichteten Aluminiumplatte durch. Erkennen Sie Flecken unter einer UV-Lampe, durch Eintauchen in p-Anisaldehydflecken oder durch Aussetzen von I2-Dampf.
- Zeichnen Sie alle Kernspinresonanzspektren (NMR) auf einem 400-MHz-Spektrometer auf.
ANMERKUNG: 1 H-NMR- und 13C-NMR-Spektren wurden auf Restlösungsmittelspitzen bezogen. Kopplungskonstanten sind in [H....
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Ergebnisse
Masarimycin ist ein niedermolekularer bakteriostatischer Inhibitor von B. subtilis und S. pneumoniae und hemmt nachweislich das exo-wirkende GlcNAcase LytG in B. subtilis 35,37 und zielt in S. pneumoniae 37 auf die Zellwand ab. Masarimycin kann entweder durch die klassische oder mikrowellengestützte organische Synthese mit Ausbeuten im Bereich von 55% -70% effizient hergestellt werden. Die mikrowellenges.......
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Diskussion
Masarimycin ist ein einzelner mikromolarer bakteriostatischer Inhibitor des Wachstums von B. subtilis 35 und S. pneumoniae37. In B. subtilis wurde gezeigt, dass Masarimycin das GlcNAcase LytG35 hemmt, während das genaue molekulare Ziel in der Zellwand von S. pneumoniae nicht identifiziertwurde 37. Die Synthese von Masarimycin entweder mit dem klassischen organischen Synthese- oder Mikrowellenverfahre.......
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Offenlegungen
Reid, C. W. verfügt über geistiges Eigentum, das spezifische Anwendungen von Masarimycin betrifft.
Danksagungen
Die Forschung wurde von der National Science Foundation unter der Fördernummer 2009522 unterstützt. Die NMR-Analyse von Masarimycin wurde durch den National Science Foundation Major Research Instrumentation Program Award unter der Fördernummer 1919644 unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Jodbenzoesäure | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | ätzendes, reizendes, hellgelbes bis orangebraunes Pulver |
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | entzündliche, reizende, farblose |
| Flüssigkeit Acetonitril | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | brennbare, reizende, farblose |
| Flüssigkeit Aluminiumplatten | Sorbtech | 4434126 | Kieselgel XG F254 auf Aluminiumplatten |
| Chloroform-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | Lösungsmittel für NMR |
| Kompakt-Massenspektrometer | Advion-Interchim | Advion CMS | kompaktes Massenspektrometer ausgestattet mit APCI-Quelle und sonde für atmosphärische Feststoffe |
| Corning Costar 96 Well-Platten mit flachem Boden - steril | Fisher Chemical | 07-200-90 | für Synergie-/Antagonismus-Assays |
| Deckgläser | Fisher Chemical | 12-547 | für Mikroskopie |
| Cyclohexancarboxaldehyd | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | entzündliche, reizende, farblose bis rosafarbene Flüssigkeit |
| Cyclohexylisocyanid | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | reizende, farblose Flüssigkeit, extrem unangenehmer Geruch |
| Cyclohexylamin | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | ätzende, brennbare, reizende, farblose Flüssigkeit, sofern nicht kontaminiert |
| Ethylacetat | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | entzündlich, reizend, farblos |
| flüssige Flash-Silica-Kartusche (12 g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | Packung Flash-Silica-Säulen (12 g) zur Aufreinigung von Masarimycin-Formaldehyd |
| SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | Fixiermittel für die Mikroskopie | |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | Puffer für die Mikroskopie Fixierlösung |
| Hexan, Mischung aus Isomeren | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | umweltschädlich, brennbar, reizend, gesundheitsgefährdend, farblose Flüssigkeit |
| Hochleistungs-Kompakt-Massenspektrometer | Advion Expression | Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), niedrige Auflösung | |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge plus | Vakuum mit Hilfe von Zentrifugalkraft und Temperatur |
| Salzsäure | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | ätzende, reizende, farblose flüssige |
| Salzsäure | SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | stark saures |
| Tauchöl | Fischerchemikalie | 12-365-19 | für die Mikroskopie |
| Jod, resublimierte Kristalle | Alfa Aesar | 41955 | umweltschädlich, reizend, gesundheitsgefährdend, dunkelgraue/violette Kristalle |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | Software zur Verarbeitung von NMR-Spektren | |
| Methanol | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | brennbare, giftige, gesundheitsgefährdende, farblose Flüssigkeit |
| Methylenblau | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | Mikroskopie-Färbung zum Färben von Zellwänden |
| meuller-hinton Agarplatten + 5% Schafblut | Fischer chemisches | B21176X | Wachstumsmedium für Streptococcus pneumoniae |
| meuller-hinton Bouillon | fisher chemical | DF0757-17-6 | Wachstumsmedien für Streptococcus pneumoniae |
| Objektträger | Fisher Chemical | 22-310397 | für die |
| Mikroskopie Mikrowellensynthese Labstation | MILESTONE | START SYNTH | Gerät, das die Belüftung eines Abzugs erfordert, ausgestattet mit Synthesekarussell |
| NMR-Röhren | SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | 5mm NMR-Röhren 600 MHz |
| Kernspin (NMR) | Bruker | Ascend 400 | großer supraleitender Magnet (400 MHz) |
| Optochin | Fisher chemisches | AAB21627MC | Ethylhydrocuprein Hydrochlorid |
| Petrie Platten | Celltreat | 229695 | zur Vorbereitung von Agarplatten für das Bakterienwachstum |
| Primo Star Hellfeld-/Phasenkontrastmikroskop mit ERc5s Kamera | Zeiss | für Morphologie-Untersuchungen | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | Flash-Chromatographie-Aufreinigungssystem |
| Resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | für Synergie-/Antagonismus-Assays |
| Rotationsverdampfer | Heidolph | Hei-VAP Value "The Collegiate" | Lösungsmittelverdampfer |
| Natriumbicarbonat | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | reizend, weiß Pulver |
| Natriumchlorid | Fischerchemikalie | S271-1 | kristallin, farblos |
| Natriumchlorid | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | für die Züchtung von B.subtilis und Herstellung von LB-Medien |
| Natriumsulfat | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | wasserfreie, körnige, weiße |
| Trypton | Fischerchemikalie | BP1421-500 | für die Züchtung von B.subtilis und Vorbereitung von LB-Medien |
| Whitney DG250 Workstation Microbiology | International | DG250 | anaerobe Workstation. Verwendetes anaerobes Gasgemisch: 5 % Wasserstoff, 10 % Kohlendioxid, Reststickstoff-Hefeextrakt |
| Fischerchemikalie | BP1422-500 | für das Wachstum von B.subtilis und die Vorbereitung von LB-Medien | |
| Zen Lite (blau) Software | Zeiss | für die Aufnahme von Schliffbildern |
Referenzen
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
- Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48....
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Nachdrucke und Genehmigungen
