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Methodenartikel

Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers

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DOI:

10.3791/63195

⸱

8. Oktober 2021

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, 2Institute of Plant Protection, Wuhan Institute of Landscape Architecture, 3McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um ein axenisches Insekt zu erhalten, wird seine Eioberfläche sterilisiert, und die geschlüpfte Larve wird anschließend mit axenischen Blättern aufgezogen. Diese Methode bietet eine effiziente Möglichkeit für die axenische Insektenvorbereitung, ohne Antibiotika zu verabreichen oder eine künstliche Diät zu entwickeln, die auch auf andere blattfressende Insekten angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Insektendärme werden von verschiedenen Bakterien besiedelt, die die physiologischen Merkmale des Wirts tiefgreifend beeinflussen können. Die Einführung eines bestimmten Bakterienstamms in ein axenisches Insekt ist eine leistungsstarke Methode, um die mikrobielle Funktion des Darms zu überprüfen und die Mechanismen aufzuklären, die den Interaktionen zwischen Darmmikrobe und Wirt zugrunde liegen. Die Verabreichung von Antibiotika oder die Sterilisation von Eioberflächen sind zwei häufig verwendete Methoden, um Darmbakterien von Insekten zu entfernen. Zusätzlich zu den möglichen nachteiligen Auswirkungen von Antibiotika auf Insekten zeigten frühere Studien, dass die Fütterung von Antibiotika Darmbakterien nicht eliminieren konnte. Daher werden keimfreie künstliche Diäten im Allgemeinen verwendet, um axenische Insekten zu erhalten, was ein langwieriger und arbeitsintensiver Prozess ist, der den Nährstoffkomponenten in natürlichen Lebensmitteln nicht vollständig ähneln kann. Beschrieben wird hier ein effizientes und einfaches Protokoll zur Vorbereitung und Pflege axenischer Larven eines Blattkäfers (Plagiodera versicolora). Insbesondere wurden Oberflächen der Käfereier sterilisiert, woraufhin keimfreie Pappelblätter zur Aufzucht axenischer Larven verwendet wurden. Der axenische Status der Insekten wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays weiter bestätigt. Durch die Kombination von Eierdesinfektion und keimfreier Kultivierung wurde gemeinsam eine effiziente und bequeme Methode entwickelt, um axenische P. versicolora zu erhalten, die ein leicht übertragbares Werkzeug für andere blattfressende Insekten darstellt.

Einleitung

Ähnlich wie bei Säugetieren ist der Verdauungstrakt von Insekten eine Höhle für die Nahrungsverdauung und -absorption. Die meisten Insekten beherbergen verschiedene kommensale Bakterien, die in ihren Eingeweiden gedeihen und von der Ernährung leben, die von Wirten1 geliefert wird. Die kommensale Darmgemeinschaft hat einen tiefgreifenden Einfluss auf mehrere physiologische Prozesse bei Insekten, einschließlich Nahrungsverdauung und Entgiftung 2,3,4, Ernährung und Entwicklung 5,6,7, Abwehr von Krankheitserregern und Parasiten 8,9,10,11, chemische Kommunikation 12,13 und Verhalten 14 ,15. Interessanterweise können einige Darmmikrobiota fakultativ pathogen sein oder durch eindringende Krankheitserreger manipuliert werden, um die Infektion zu verschlimmern, was darauf hindeutet, dass Darmbakterien in einigen Fällen schädlich sein können16,17,18. Darmbakterien können auch als mikrobielle Ressource für biotechnische Anwendungen und die Schädlingsbekämpfung dienen. Zum Beispiel wurden lignocelluloseverdauende Bakterien aus phytophagen und xylophagen Insekten verwendet, um Pflanzenzellen für die Entwicklung von Biokraftstoffen zu verdauen19. Die Ausbreitung von technisch hergestellten Darmsymbionten, die bioaktive Moleküle exprimieren, ist eine neuartige und vielversprechende Taktik zur Bekämpfung von land- und forstwirtschaftlichen Schädlingen und Moskitos, die Infektionskrankheiten übertragen 19,20,21, die auch zur Verbesserung der Fitness von Nützlingen eingesetzt werden können 22. Die Veranschaulichung, wie sich ein Darmbakterium in vivo verhält, wird daher als Priorität angesehen, um seine Funktion voll auszuschöpfen und für verschiedene Anwendungen weiter zu nutzen.

Tiere können 1 bis >1000 symbiotische mikrobielle Arten im Darm1 beherbergen. Infolgedessen ist es schwierig, genau zu überprüfen, wie sich einzelne bakterielle Taxa oder ihre Ansammlung in einem Tier verhalten und ob der Wirt oder seine mikrobiellen Partner eine bestimmte Funktion ausüben. Daher ist die Vorbereitung axenischer Larven zur Gewinnung von gnotobiotischen Insekten durch Mono- oder Multispezies-Kolonisation notwendig, um die bakterielle Funktion und Interaktion mit Insektenzu untersuchen 23. Gegenwärtig sind die Verabreichung von Antibiotika-Cocktails und die Sterilisation der Oberfläche von Insekteneiern gängige Methoden, um Darmbakterien zu entfernen 14,24,25,26. Antibiotika-Diäten können Darmbakterien jedoch nicht vollständig eliminieren und wirken sich negativ auf die Insektenphysiologie des Wirtsaus 27,28. Folglich kann die Verwendung von mit Antibiotika behandelten Insekten die wahren Fähigkeiten einiger Darmbakterien verschleiern. Glücklicherweise kann die Oberflächensterilisation von Eiern dieses Problemaufheben 23,29, das keine oder nur zu vernachlässigende Auswirkungen auf experimentelle Insekten hat. Darüber hinaus können künstliche Diäten der natürlichen Insektennahrung nicht vollständig ähneln, und die Entwicklung einer künstlichen Ernährung ist ein kostspieliger und arbeitsintensiver Prozess30,31.

Der Weidenblattkäfer, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), ist ein weit verbreiteter blattfressender Schädling, der sich hauptsächlich von salicaceous Bäumen wie Weiden (Salix) und Pappeln (Populus L.) ernährt. 32,33 Hier wurde der Weidenblattkäfer als repräsentatives blattfressendes Insekt verwendet, um ein Protokoll zur Vorbereitung und Aufzucht eines keimfreien Insekts zu entwickeln. Wir nutzten die pflanzliche Gewebekultur, um keimfreie Pappelblätter zu erhalten, um P. versicolora axenische Larven aus sterilisierten Eiern zu züchten. Der axenische Status von P. versicolora-Larven wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays verifiziert. Dieses Protokoll kann axenische Insekten aufrechterhalten, die den Wildzustand besser nachahmen als Insektenaufzucht mit einer künstlichen Diät. Noch wichtiger ist, dass diese Methode zu sehr niedrigen Kosten geeignet ist, was die Machbarkeit der Gewinnung axenischer Insekten für zukünftige Insekten-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien erhöht, insbesondere für Nicht-Modellinsekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten.

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Protokoll

1. Insektenaufzucht

  1. Halten Sie die P. versicolora-Population in einer Wachstumskammer bei 27 °C und 70 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel. Legen Sie sie in perforierte Kunststoffboxen mit gefliestem, nass absorbierendem Papier und füttern Sie sie mit frischen Pappelzweigen. Sprühen Sie sauberes Wasser auf das absorbierende Papier, um die Feuchtigkeit zu erhalten und die Zweige alle zwei Tage zu wechseln.
  2. Isolieren Sie Erwachsene für die Eiablage nach der Verpuppung. Füttere sie mit zarten Blättern, um mehr Eier zu erhalten.
  3. Sammeln Sie neu gelegte Eier (innerhalb von 24 Stunden). Legen Sie die Eier 60 h lang auf feuchtes, absorbierendes Papier, um axenische Larven vorzubereiten.
    HINWEIS: Neu gelegte Eier schlüpfen nach ~72 h. Die beste Zeit, um Eioberflächen zu sterilisieren, ist der Tag vor dem Schlüpfen; Andernfalls nimmt die Anzahl der erfolgreich geschlüpften Eier ab.

2. Keimfreier Pappelanbau

  1. Bereiten Sie Murashige und Skoog (MS) -Medium und 1 mg/ml α-Naphthalin-Essigsäure (NAA) Stammlösungen vor (siehe Materialtabelle).
  2. In einer Biosicherheitshaube 50 μL 1 mg/ml NAA-Stammlösung zu 500 ml MS-Medium hinzufügen, gut schütteln, gut mischen, ~ 50 ml pro Gewebekulturbehälter gießen und auf die Erstarrung warten.
  3. Bereiten Sie Skalpelle, Alkohollampe und Pinzette vor; Sterilisieren Sie die Skalpelle und Pinzetten in der Alkohollampenflamme in der Biosicherheitshaube.
  4. Schneiden Sie 3-4 cm Stielsegmente mit apikalen Knospen oder lateralen Knospen aus Pappelsämlingen bei ~ 1 Wachstumsmonat (keimfreie, gewebekultivierte Sämlinge) und legen Sie sie in das Kulturmedium, ein oder zwei Stängelsegmente pro Behälter.
  5. Inkubieren Sie diese Stammsegmente in einer Wachstumskammer bei 25 °C und 50 ± 10 cd Lichtintensität mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel für ca. 30 Tage. Verwenden Sie die keimfreien Blätter, um die axenischen Larven zu füttern.

3. Sterilisation der Eioberfläche und Aufzucht axenischer Larven

  1. Autoklav Petrischale, Pinsel, Filterpapier, destilliertes Wasser und eine Petrischale mit LB (Luria-Bertani) Agarmedium.
  2. Blätter mit anhaftenden Eiern in eine Petrischale legen, die Eier vorsichtig mit einer Pinzette von den Blättern entfernen und in eine andere Petrischale geben.
    HINWEIS: Dieser Schritt sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden, da die Eier an den Blättern haften.
  3. Waschen Sie diese Eier mit 75% Ethanol für 8 min und wiederholen Sie die Wäsche viermal mit sterilem Wasser.
  4. Übertragen Sie die Eier auf LB-Agarmedium, um Feuchtigkeit für das Schlüpfen zu erhalten.
    HINWEIS: Die Verwendung von LB-Agar-Medium kann helfen, zu überprüfen, ob das desinfizierte Ei keimfrei ist.
  5. Legen Sie die Petrischale in eine Wachstumskammer und warten Sie, bis die Eier innerhalb von 24 Stunden geschlüpft sind.
  6. In einer Biosicherheitshaube drei Stücke Nassfilterpapier in einer Petrischale kacheln, keimfreie Pappelblätter auf das Papier legen, die Larven sammeln und auf die Blätter legen, die Petrischale mit Parafilm verschließen und in einer Wachstumskammer bei 27 °C und 70 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel inkubieren.
    HINWEIS: Die gewebekultivierten Blätter sind empfindlich und können schnell Wasser verlieren. Daher ist die Verwendung von feuchtem Filterpapier notwendig, wenn die Blätter in die Petrischale überführt werden.
  7. Wechseln Sie die Blätter alle zwei Tage.
  8. Für die konventionell aufgezogenen Gruppen die Eier von den Blättern in eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier geben und diese Larven mit keimfreien Pappelblättern füttern.

4. Nachweis axenischer Larven mit kulturabhängigen Assays

  1. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Larven des 1., 2. und3. Stadiums aus den keimfreien und konventionell aufgezogenen Gruppenaus.
  2. Sezieren Sie die Larven des 3. Stadium mit steriler Schere und Pinzette unter einem Stereomikroskop und sammeln Sie ihre Eingeweide in Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie intakte 1. und 2. Instarlarven in Röhren.
    HINWEIS: Sammeln Sie ganze Larven des 1. und 2. Stadiums, da sie zu klein sind, um sie zu sezieren, und halten Sie ihre Eingeweide intakt.
  3. Fügen Sie 100 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung und drei Stahlkugeln zu 1,5 ml-Rohren hinzu und mahlen Sie die Gewebe mit einem Perlen-schlagenden Homogenisator zu Homogenaten.
  4. 100 μL des Homogenats mit einem sterilen Glasstreustab in LB-Agarmedium und -platte geben.
  5. Platzieren Sie die Platten 24 h lang bei 37 °C und beobachten Sie die Bakterienkolonien.

5. Verifizierung axenischer Individuen mit kulturunabhängigen Assays

  1. Extrahieren Sie die gesamte DNA des Gewebes (erhalten in Abschnitt 4) mit einem DNA-Extraktionskit.
  2. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer bei 260 nm.
  3. Amplifizieren Sie das bakterielle 16S rRNA-Gen mit universellen 16S rRNA-Primern mit PCR. Richten Sie das Reaktionssystem mit 18 μL 1,1-facher PCR-Mastermischung (siehe Materialtabelle), 0,5 μL 27F-Primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL 1495R-Primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') und 100 ng-Template-DNA ein. Stellen Sie die PCR-Bedingungen für 3 min auf 95 °C ein; 28 Zyklen von 95 °C für 30 s, 55 °C für 1 min und 72 °C für 1 min; gefolgt von 72 °C für 10 min. Lagern Sie die PCR-Produkte bis zur weiteren Analyse bei 4 °C.
  4. Mischen Sie die PCR-Produkte mit Nukleinsäurefarbstoff und analysieren Sie sie mittels Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel in 1x TAE-Puffer. Verwenden Sie 10 μL eines DNA-Markers als Referenz.
  5. Beobachten Sie das Gel mit einem UV-Transilluminator und suchen Sie nach dem Zielfragment um 1.500 bp.

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Ergebnisse

Die Lebensstadien von P. versicolora sind in Abbildung 1 dargestellt. Das erwachsene Männchen ist kleiner als das erwachsene Weibchen (Abbildung 1A). Auf dem Feld gruppiert der Käfer seine Eier auf einem Blatt; Hier wurden vier Eier von einem Blatt gelöst (Abbildung 1B). Die Pappelstängelsegmente und Sämlinge, die für die axenische Insektenzucht verwendet werden, sind in Abbildung 2 dargestellt...

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Diskussion

Die Herstellung keimfreier Larven und die Gewinnung von gnotobiotischen Larven durch Wiedereinführung spezifischer Bakterienstämme sind leistungsfähige Methoden, um die Mechanismen aufzuklären, die den Wirt-Mikroben-Interaktionen zugrunde liegen. Neu geschlüpfte Larven erhalten Darmmikrobiota auf zwei Arten: vertikale Übertragung von der Mutter auf die Nachkommen oder horizontale Akquisition von Geschwistern und der Umwelt34. Ersteres kann durch elterliche Übertragung auf den Nachwuchs durch Konta...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31971663) und dem Young Elite Scientists Sponsorship Program von CAST (2020QNRC001) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m SpritzenfilterMilliporeSLGP033RB
1 mg/ml NAA-Stammlösunga. 0,1 M NaOH-Lösung herstellen (0,8 g NaOH in 200 ml destilliertem Wasser lösen).
b. 0,2 g NAA in ein 250-ml-Becherglas geben, etwas 0,1 M NaOH-Lösung hinzufügen, bis sich NAA aufgelöst hat, und das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 200 ml einstellen.
c. Die Lösung zur Entfernung von Bakterien mit einem 0,22 μ μ filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter und eine sterile 50-ml-Spritze, verpacken Sie die Lösung in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sie bei -20 °C wieder her.
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenSangon BiotechF600620
10x PBS StammlösungBiosharp Life SciencesBL302A
2 M KOH LösungLösen Sie 22,44 g KOH (Molekulargewicht: 56,1) in 200 mL destilliertem Wasser auf und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 °C.
250 mL und 2.000 mL BecherShubosb16455
50 mL sterile SpritzenJintaJT0125789
500 mL MesszylinderShubosb1601
50x TAE Stammlösunga.  242 g Tris und 18,612 g EDTA werden in 700 ml destilliertem Wasser gelöst.
b. Stellen Sie den pH-Wert mit etwa 57,1 ml Essigsäure auf 7,8 ein.
c. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 1.000 mL.
d ein. Die Stammlösung wurde bei Verwendung auf 1x TAE-Puffer verdünnt.
75% EthanolXingheda trade
α-naphthalinessigsäure (NAA)Solarbio Life Sciences86-87-3
Absorptionspapier22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm
EssigsäureSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
AgarCoolaber9002-18-0
AgaroseBiowest111860
AutoklavPanasonicMLS-3781L-PC
Bead-Beating HomogenisatorJing XinXM-GTL64
DNA-ExtraktionskitMP Biomedicals116560200
EDTASaiguo Biotech1340
FilterpapierJiaojie
Gelelektrophoreseeinheitmit 70 mm DurchmesserBio-rad164-5052
Gel Signal Green NukleinsäurefarbstoffTsingKeTSJ003
Keimfreie Pappelsämlinge ShanXin Pappel von der Universität Ludong in der Provinz Shandong
Golden Star Super PCR Master Mix (1,1&fach;)TsingKeTSE101
WachstumskammerRuihuaHP400GS-C
LB Agar Mediuma. 5 g Trypton, 5 g NaCl, 2,5 g Hefeextrakt in 300 mL destilliertem Wasser auflösen
b. Das Endvolumen auf 500 mL einstellen, die Lösung in einen 1.000 mL Konuskolben überführen und 7,5 g Agar hinzufügen.
c. Das Medium 20 Minuten lang bei 121 μC autoklavieren.
Mini-ZentrifugeDRAGONLABD1008
MS basisch MediumCoolaberPM1121-50LM0245
MS festes Medium für keimfreie Pappelsämlingskultura. 4,43 g MS basisches Medium Pulver und 30 g Saccharose in 800 mL destilliertem Wasser auflösen.
b. Den pH-Wert mit 2 M KOH mit einem pH-Messgerät auf ca. 5,8 einstellen.
c. Das Endvolumen auf 1.000 mL einstellen, In zwei Teile trennen, in zwei 1.000-ml-Konuskolben umfüllen und 2,6 g Agar pro 500 ml.
Tag hinzufügen. Autoklav für 20 min bei 121 °C.
NanoDrop 1000 SpektralphotometerThermo Fisher Scientific
Pinsel1 cm breit, zum Sammeln der Eier
ParafilmBemisPM-996
PCR ThermocyclerEppendorf6331000076
PetrischalenSupin90 mm Durchmesser
METTLER TOLEDOFE20
Pipetten 0,2-2 &Mikro; LGilsonECS000699
Pipetten 100-1.000 & Mikro; LEppendorf3120000267
Pipetten 20-200 & Mikro; LEppendorf3120000259
Pipetten 2-20 µ LEppendorf3120000232
Kulturbehälter für pflanzliche GewebeChembaseZP21240 mL
Kunststoffbox2,35 l
Kaliumhydroxid (KOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primer zur Amplifikation des bakteriellen 16S rRNA-GensSangon Biotech27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'
Natriumchlorid (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Natriumhydroxid (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Stahlkugeln0,25 mmzum Zerkleinern von Geweben
StereomikroskopOLYMPUSSZ61
SaccharoseSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA MarkerTransgene BiotechBM121-01
Tris-BasisBiosharp Life Sciences1115
TryptonThermo Fisher Scientific  LP0037
UV-TransilluminatorMonad BiotechQuickGel 6100
VortexerScilogexMX-S
WeidenzweigeSha Lake Park, Wuhan, China
WeidenblattkäferHuazhong Agricultural University, Wuhan, China
HefeextraktThermo Fisher ScientificLP0021
pH-Messgerät

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