Summary
Ce travail présente un protocole flexible pour l’utilisation de la technologie FLECS (élastomère contractable surfaces élastomères marquées par fluorescence) au format micropuit pour une quantification simplifiée et sans intervention des forces contractiles unicellulaires basées sur des déplacements visualisés de micromotifs de protéines fluorescentes.
Abstract
La génération de force contractile cellulaire est un trait fondamental partagé par pratiquement toutes les cellules. Ces forces contractiles sont cruciales pour un bon développement, fonctionnent à la fois au niveau cellulaire et tissulaire et régulent les systèmes mécaniques du corps. De nombreux processus biologiques dépendent de la force, notamment la motilité, l’adhésion et la division des cellules individuelles, ainsi que la contraction et la relaxation d’organes tels que le cœur, la vessie, les poumons, les intestins et l’utérus. Compte tenu de son importance dans le maintien d’une fonction physiologique appropriée, la contractilité cellulaire peut également entraîner des processus pathologiques lorsqu’elle est exagérée ou perturbée. L’asthme, l’hypertension, le travail prématuré, les cicatrices fibrotiques et la vessie sous-active sont tous des exemples de processus pathologiques mécaniques qui pourraient potentiellement être soulagés par un contrôle approprié de la force contractile cellulaire. Nous présentons ici un protocole complet pour l’utilisation d’une nouvelle technologie de test de contractilité à base de microplaques connue sous le nom de surfaces contractibles élastomères marquées par fluorescence (FLECS), qui fournit une analyse simplifiée et intuitive de la contractilité unicellulaire à une échelle massive. Ici, nous fournissons un protocole par étapes pour obtenir deux courbes dose-réponse en six points décrivant les effets de deux inhibiteurs contractiles sur la contraction des cellules musculaires lisses primaires de la vessie humaine dans une procédure simple utilisant une seule microplaque de test FLECS, afin de démontrer la technique appropriée aux utilisateurs de la méthode. Grâce à la technologie FLECS, tous les chercheurs disposant de laboratoires biologiques de base et de systèmes de microscopie fluorescente ont accès à l’étude de ce phénotype cellulaire fonctionnel fondamental mais difficile à quantifier, abaissant efficacement la barrière d’entrée dans le domaine de la biologie de la force et du criblage phénotypique de la force des cellules contractiles.
Introduction
Les forces mécaniques générées par les cellules sont essentielles au bon fonctionnement de divers organes du corps tels que les intestins, la vessie, le cœur et autres. Ces organes doivent générer des modèles stables de contraction et de relaxation cellulaires pour maintenir l’état homéostatique interne. La contraction anormale des cellules musculaires lisses (SMC) peut entraîner l’apparition de divers troubles, y compris, par exemple, la dysmotilité intestinale, caractérisée par des schémas anormaux de contraction des muscles lisses intestinaux1, ainsi que les conditions urologiques de la vessie hyperactive2 ou sous-active3. Dans les voies respiratoires, les SMC qui présentent des schémas de contraction irréguliers peuvent déclencher une hyperréactivité asthmatique4, ce qui pourrait resserrer les voies respiratoires et diminuer le flux d’oxygène dans les poumons. Une autre condition physique répandue, l’hypertension, est causée par des fluctuations de la contraction des muscles lisses dans les vaisseaux sanguins5. De toute évidence, les mécanismes contractiles dans les cellules et les tissus peuvent conduire à des maladies qui nécessitent des options de traitement. Comme ces conditions découlent indubitablement des comportements contractiles dysfonctionnels des cellules, il devient logique et nécessaire de mesurer la fonction contractile cellulaire elle-même, lors du dépistage de candidats médicaments potentiels.
Reconnaissant la nécessité d’outils pour étudier la force contractile cellulaire, plusieurs méthodes de dosage quantitatif de contraction ont été mises au point par des chercheurs universitaires, notamment la microscopie à force de traction (TFM)6, le TFM7 à micromotifs, les tests sur gel flottant8 et les tests de microposte élastomère9. Ces technologies ont été utilisées en format à plat unique ainsi qu’en format plaque à plusieurs puits dans de nombreuses études et ont même été proposées pour des mesures de force tridimensionnelles10,11,12,13,14. Bien que ces technologies aient permis des recherches pionnières dans le vaste domaine de la biologie de la force cellulaire, elles ont toutes été largement limitées aux laboratoires possédant des capacités et des ressources spécifiques, en particulier: capacité à fabriquer des substrats TFM, capacité à appliquer correctement des algorithmes complexes et non intuitifs pour résoudre des cartes de déplacement TFM, et systèmes de microscopie relativement précis qui peuvent enregistrer des images prises avant et après le retrait d’échantillons de la scène (pour la dissociation cellulaire). Ainsi, pour un chercheur non formé, la barrière à l’entrée pour utiliser ces méthodes peut être assez élevée compte tenu de l’ensemble étendu d’exigences pour appliquer ces technologies. En outre, la résolution d’imagerie requise pour de nombreuses technologies existantes (objectifs 40x ou plus) peut limiter considérablement le débit expérimental, tandis que les technologies de mesure en vrac pourraient masquer les contributions des cellules aberrantes et empêcher la découverte de différences contractiles plus légères. Il convient de noter que, pour autant que les auteurs le sachent, seule l’approche du dosage sur gel flottant à faible débit et semi-quantitatif a suffisamment mûri pour être mise à la disposition des chercheurs (voir la figure 1).
Figure 1: Schéma global de la méthode de la technologie FLECS. (A) Les cellules sont adhérées à des micromotifs de protéines adhésives qui sont incorporés de manière covalente dans une fine couche élastomère soutenue par du verre. (B) Vue de dessus de diverses formes possibles de micromotifs et explosion d’une cellule contractant un micromoptère en forme de « X ». (C) Superposition de micromotifs fluorescents et d’images à contraste de phase d’une cellule contractante. (D) Images temporelles d’une seule cellule contractante. Barres d’échelle = 25 μm. Cette figure a été adaptée avec la permission de Pushkarsky et al15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Suite aux progrès récents de la microtechnologie, les auteurs ont développé une technologie basée sur des microplaques permettant des mesures quantitatives de la contraction unicellulaire dans des centaines de milliers de cellules appelées FLECS (surfaces contractibles élastomères marquées par fluorescence)15,16,17,18,19,20 , comme alternative à TFM. Dans cette approche, les micromotifs de protéines fluorescentes sont intégrés dans des films mous qui se déforment et rétrécissent lorsque les cellules leur appliquent des forces de traction, de manière intuitive et mesurable. Il est important de noter que les micromotifs protéiques contraignent la position, la forme et la zone de propagation des cellules, ce qui conduit à des conditions de test uniformes. Ceux-ci permettent des mesures simples basées uniquement sur leurs changements dimensionnels, qui sont très résolus spatialement, même dans des images de grossissement 4x. La méthode comprend un module d’analyse d’image basé sur un navigateur et permet une analyse simple de la force des cellules contractiles sans nécessiter de procédures de manipulation délicates ou d’enregistrement de marqueurs fiduciaires, de sorte qu’elle devrait être utilisable par tout chercheur disposant d’une installation de culture cellulaire de base et d’un microscope fluorescent simple à faible grossissement (Figure 2 ). Cette technologie, prête à l’emploi et disponible dans le commerce, a été conçue pour l’utilisateur final et vise à réduire la barrière à l’entrée pour tout scientifique de laboratoire pour étudier la biologie de la force cellulaire.
Figure 2 : Schéma du format de plaque à 24 puits pour le test de contractilité à cellule unique. Ce format a été utilisé dans les expériences décrites ici et décrites dans la partie vidéo de l’article. Barres d’échelle = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Dans ce travail, nous présentons un protocole pour appliquer le format de plaque à 24 puits de la plate-forme technologique FLECS pour quantifier les effets des médicaments modulateurs de force sur la contractilité cellulaire dans les cellules musculaires lisses primaires de la vessie. Ce protocole à usage général peut être adapté et modifié au besoin pour tenir compte de diverses autres échelles de temps, types de cellules et conditions de traitement d’intérêt, et mis à l’échelle pour répondre à d’autres questions en biologie de la force.
Protocol
1. Jour 1 : Préparation de la plaque de 24 puits
- Commencez la procédure en ajoutant 20 mL de milieu de culture cellulaire dans un tube conique de 50 mL. Dans cette expérience, le milieu à base de jambon F12 complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) est utilisé.
- Obtenez une plaque de 24 puits conçue pour tester la contractilité cellulaire. Réglez la pipette à 500 μL et procurez-vous une passoire cellulaire pour le passage des cellules.
NOTE: La plaque est disponible auprès des auteurs sur demande. - Soulevez et tenez la plaque dans une main et pelez doucement le film plastique du haut de la plaque. Ensuite, remettez soigneusement la plaque vers le bas.
- Allumez un aspirateur à vide et aspirez la couche supérieure de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) des puits pour éviter tout déversement. Supprimez le PBS une ligne à la fois. Une fois que les puits ne sont plus complètement pleins, tenez la plaque dans une main et retirez soigneusement le reste du PBS des puits. Remplir rapidement avec 500 μL de milieu de culture cellulaire. Prenez soin d’éviter tout contact entre l’aspirateur et le fond du puits.
- Secouez doucement la plaque et tapotez sur le côté pour vous assurer que tout le fond du puits est recouvert de solution. Une fois que tous les puits sont remplis de milieu, placez la plaque sur le côté.
2. Jour 1 : Ensemencement cellulaire
- Récupérer la fiole de culture avec le passage 7 ou les cellules du muscle lisse de la vessie humaine primaire (BSM) de l’incubateur à 37 °C. Au microscope, vérifiez la morphologie cellulaire et assurez-vous que les cellules ont atteint au moins 90 % de confluence, mais moins de 100 % de confluence.
- Effectuer le protocole de dissociation cellulaire. Dans une armoire de biosécurité stérile, trypsiniser les cellules pendant 2,5 minutes jusqu’à ce que les cellules soient détachées avant de les éteindre avec un milieu supplémenté en sérum (10% FBS).
- Une fois les cellules dissociées, utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et diluer la suspension cellulaire à environ 50 000 cellules/mL dans un milieu supplémenté en sérum. Il est important de noter que les cellules ont besoin d’au moins 2% de sérum pour se fixer aux micromotifs.
- Avant l’ensemencement, filtrer rapidement la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 ou 100 μm dans un tube conique de 50 mL avec une pipette sérologique pour briser les amas de cellules en cellules individuelles.
- Ajouter soigneusement 500 μL de la suspension de cellules de 50 000 cellules/mL dans chacun des 24 puits de la plaque à l’aide d’une pipette P1000 en distribuant la solution goutte à goutte à travers différentes positions dans les puits.
- Après l’ensemencement cellulaire, laissez la plaque reposer à température ambiante pendant 1 h pour laisser les cellules se déposer directement sur les micromotifs sans être influencées par les microcourants générés par l’évaporation. Après 1 h, placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit. Les cellules s’auto-assembleront et se répandront sur les micromotifs adhésifs pendant ce temps et commenceront à exercer des niveaux de contraction basale.
3. Jour 2 : Ajout d’un médicament d’essai
REMARQUE: La concentration finale de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans les puits contenant des cellules adhérentes ne peut pas dépasser 1% et le médicament / DMSO ne peut pas être ajouté directement aux cellules, mais doit d’abord être dilué et mélangé dans une solution intermédiaire de milieu cellulaire.
- Créez une série de dilution de médicament en six étapes et huit fois en transférant 30 μL du médicament d’origine dans des volumes consécutifs de 210 μL de DMSO et en mélangeant soigneusement entre chaque étape de transfert. Dans ce travail, une série de dilution en six étapes et huit fois de blébbistatine est préparée à des doses allant de 40 μM à 1 nM, dans le DMSO.
- Pour chaque solution médicamenteuse mère (à partir de l’étape 3.1), mélanger 30 μL de médicament dans 470 μL de milieu de culture cellulaire. La solution intermédiaire donne une dilution de 16,7 fois du DMSO.
- Transférer 200 μL de chaque solution intermédiaire dans le puits approprié sur la plaque de 24 puits (qui contient déjà 100 μL de milieu dans chaque puits). Cela donne une dilution supplémentaire de six fois le DMSO.
- Les étapes 3.2 et 3.3 donnent collectivement une concentration finale de 1 % de DMSO dans les puits.
- Placer la plaque traitée dans un incubateur à 37 °C pendant la durée appropriée. Pour cette expérience, une incubation de 30 minutes est utilisée.
- Immédiatement avant l’imagerie, ajouter la solution de coloration nucléaire vivante Hoechst 33342 à chaque puits (dilution finale 1:10 000). Laissez-le incuber pendant 15 minutes supplémentaires pour marquer les noyaux cellulaires.
4. Jour 2 : Imagerie de la plaque de puits
- Accédez à un microscope équipé pour imager les canaux des noyaux cellulaires (DAPI) et des micromotifs (TRITC).
- Imagez d’abord les cellules avec du DMSO uniquement.
- Ensuite, concentrez-vous et imagez à la fois les micromotifs et les noyaux cellulaires marqués afin d’identifier les cellules individuelles et de vous assurer que les deux canaux sont parfaitement alignés pour permettre une analyse automatisée des images.
- Répétez à plusieurs positions dans chacun des 24 puits de la plaque. Les images peuvent être prises avec un objectif 4x (ou éventuellement plus haut pour accélérer l’imagerie et acquérir un maximum de points de données par image).
- Exportez les images en tant que fichiers TIF et ouvrez-les sur un ordinateur connecté au Web avec ImageJ pour analyser les données.
5. Post-expérience : Analyse d’images
REMARQUE: L’analyse d’image a été effectuée à l’aide d’Biodock.ai portail et d’un logiciel d’imagerie.
- Téléchargez les images acquises sur un ordinateur.
- Assurez-vous que les paires correspondantes d’images micromotifs et nucléaires sont nommées correctement.
- Assurez-vous que les noms d’image des micromotifs prennent tous la forme « sharedCoreName _pt.tif ».
- Assurez-vous que les noms d’image des noyaux prennent tous la forme « sharedCoreName_dapi.tif ».
- Convertissez des images de TIF en PNG à l’aide d’ImageJ.
- Une fois ImageJ ouvert, chargez dans un canal à la fois. Pour cette expérience, chargez d’abord des images de micromots en tant que pile dans ImageJ.
- À l’aide de l’image > Ajuster > Luminosité/Contraste, ajustez la luminosité de l’image pour mettre en valeur les micromotifs et réduire l’arrière-plan au noir. En plus de cela, lissez les images.
- À l’aide de l'> Type > 8 bits, convertissez les images en 8 bits.
- Exportez ensuite l’image au format PNG et cochez la case au niveau de la tranche en tant que nom de fichier. Maintenant, créez un nouveau dossier PNG et enregistrez les fichiers PNG avec le même nom.
- Répétez ce processus pour les images de noyaux.
- Téléchargez des paires d’images PNG dans le logiciel de traitement d’images pour l’analyse.
- Créez et validez le compte. Les auteurs ont un compte pour permettre un accès ouvert aux utilisateurs universitaires.
- Validez le compte en contactant les auteurs.
- Connectez-vous au logiciel.
- Sous l’onglet Données sur la gauche, cliquez sur Télécharger le lot.
- Importez les images en faisant glisser et en déposant des paires d’images dans la fenêtre qui apparaît et nommez le lot. Cliquez sur OK.
- Cochez la case en regard du nom du lot et cliquez sur Analyser.
- Sur l’écran suivant, faites défiler vers le bas et cochez la case en regard de Analyse de contractilité , puis cliquez sur Sélectionner. Plus bas dans la page, sélectionnez 10x comme grossissement utilisé pour l’imagerie dans un menu déroulant.
- Cliquez sur Envoyer. Une fois l’analyse des données terminée, cliquez sur le nom du lot. Sur l’écran suivant, cliquez sur Télécharger les données sur le côté droit de la page.
REMARQUE: Les fichiers téléchargés contiendront des images qui ont été analysées, des résultats sommaires indiquant une contraction moyenne dans chaque image et une analyse détaillée de chaque micromotif détecté dans une image, indiquant leurs tailles, positions, nombre de cellules adhérées et contraction. - Tracer les valeurs de contraction par rapport aux concentrations de médicaments pour générer une courbe concentration-réponse et déterminer les puissances relatives des différents traitements.
- Cliquez sur Envoyer. Une fois l’analyse des données terminée, cliquez sur le nom du lot. Sur l’écran suivant, cliquez sur Télécharger les données sur le côté droit de la page.
Representative Results
Les régions des images acquises à partir de puits qui ont été traités avec du DMSO seulement et celles qui ont été traitées avec de la blébbistatine de 40 μM sont montrées côte à côte à la figure 3. On peut clairement observer que les cellules traitées au DMSO seulement présentent un niveau significatif de contraction basé sur les déformations très importantes des micromotifs adhérents par les cellules musculaires lisses de la vessie (BSMC) dans ce puits. Inversement, dans l’image du blébbistatine bien traité avec 40 μM, une relaxation cellulaire significative est observée7 car les micromotifs adhérents par les BSMC sont presque impossibles à distinguer des micromotifs qui ne sont pas respectés par les cellules, ce qui indique une contraction minimale. Ces images démontrent la représentation visuelle intuitive et claire de la contractilité unicellulaire offerte par la méthode de micromotifs fluorescents. Contrairement aux méthodes basées sur le TFM, où le mouvement omnidirectionnel de nombreuses particules fluorescentes réparties aléatoirement sous une monocouche cellulaire dense est destiné à transmettre une force contractile relative, ici, les géométries contractées uniformes et marquées des micromotifs fournissent des informations qualitatives immédiates et facilement interprétables sur la contraction des cellules individuelles. Ceux-ci peuvent être directement quantifiés en appliquant des opérations d’objet binaire standard sur les images.
Figure 3 : Comparaisons côte à côte d’images prises de puits contenant seulement 1 % de traitement au DMSO (à gauche) ou contenant 40 μM de blébbistatine (à droite). On peut clairement observer que le traitement par la blébbistatine réduit considérablement la contractilité des cellules individuelles, comme l’indiquent les micromotifs plus grands et non contractés. Les noyaux bleus indiquent quels micromotifs sont liés par les cellules. Barre d’échelle = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
En appliquant le module d’analyse basé sur un navigateur pour analyser les paires d’images acquises de micromotifs et de noyaux cellulaires, des distributions de contractilité unicellulaire sont obtenues pour chaque population, comme le montre la figure 4. Décrite en détail dans un rapport antérieur sur la méthodologie FLECS15, l’analyse fonctionne en localisant les positions et les orientations de chaque micromotif en forme de « X », en comptant le nombre de noyaux adhérés directement sur le centre de chaque micromotif, en calculant la longueur moyenne de chaque micromotif et en calculant la distance en pixels de la contraction de chaque micromotif par rapport à la longueur moyenne des micromotifs vides (référence de contraction nulle). Par conséquent, les micromotifs vides servent un objectif important pour normaliser les données de contraction. Il est important de noter que les cellules qui ne se lient pas aux micromotifs s’accumuleront sur les limites du puits en raison des microcourants où elles n’affecteront pas l’analyse d’image. Comme on le voit dans ces graphiques, la contractilité imperturbable de la population cellulaire traitée uniquement avec des contrôles DMSO s’étend sur une large plage allant jusqu’à 20 pixels, avec un centre situé à environ 10 pixels. Pendant ce temps, les cellules traitées avec de la blébbistatine se contractent beaucoup moins et leur distribution est poussée vers un centre d’un peu plus de 6 pixels. Il est important de noter que chaque micromotif trouvé dans l’image qui se lie exactement sur la cellule est représenté dans ces distributions. Cela démontre la capacité de la méthode à transmettre des réponses cellulaires différentielles aux traitements médicamenteux.
Figure 4 : Histogrammes représentant des données de contractilité unicellulaire obtenues à partir de l’analyse d’images prises de puits contenant 1 % de DMSO seulement (bleu) ou 40 μM de blébbistatine. La distribution des cellules traitées au DMSO est large et centrée à une valeur de contraction beaucoup plus grande (~ 10 pixels) que la distribution traitée à la blébbistatine, démontrant les effets quantitatifs du traitement des cellules par la blébbistatine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
En utilisant tous les puits sur une seule plaque de 24 puits et en imageant au moins 3 sites par puits, des courbes dose-réponse à six points sont générées simultanément pour deux composés médicamenteux. La figure 5 montre les données concentration-réponse pour les BSMC traités avec la même gamme de doses de blébbistatine ou de cytochalasine D (deux inhibiteurs de contractilité connus). Comme en témoignent les profils concentration-réponse, la cytochalasine D est l’inhibiteur le plus puissant de la contraction tonique dans ces cellules. En ajustant une courbe sigmoïdale aux points de données, les valeurs de LA CDI50 peuvent être calculées pour chaque médicament. Nos expériences indiquent que les IC50 sont de 7,9 μM et 100 nM pour la blébbistatine et la cytochalasine D, respectivement, après environ 30 minutes d’exposition aux médicaments. Il est important de noter que, dans l’ensemble, ces valeurs sont cohérentes avec les rapports précédents, validant la précision quantitative de la méthode pour déterminer la puissance des inhibiteurs de contraction7,21.
Figure 5 : Courbes concentration-réponse illustrant les effets de la blébbistatine et de la cytochalasine D sur la contractilité cellulaire dans les cellules individuelles. Chaque point de données comprend trois images pour cette condition. Une courbe sigmoïdale était adaptée à chaque ensemble de données. Les résultats indiquent que la cytochalasine D est plus puissante, ayant une valeur IC50 inférieure. Ces données sont collectables à partir d’une seule plaque FLECS de 24 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Cette méthode simplifiée pour mesurer quantitativement la contraction dans des centaines de milliers de cellules à la fois dans différentes conditions de traitement et en utilisant uniquement des instruments de microscopie standard offre une alternative accessible au TFM traditionnel pour les chercheurs afin d’étudier la biologie de la force cellulaire. Parce que la technologie présentée fournit un affichage visuel de la contraction cellulaire en analysant les changements dans les micromotifs fluorescents de forme régulière, l’ampleur de la contraction produite par une cellule donnée est intuitivement comprise - plus le micromotif est petit, plus la force contractile exercée par la cellule est grande.
Notamment, en offrant un contrôle sur des facteurs tels que la forme, la zone d’étalement et la molécule d’adhésion comprenant les micromotifs (tous les facteurs connus pour réguler la contractilité cellulaire22,23,24), la technologie présentée élimine systématiquement les variables supplémentaires qui peuvent confondre les interprétations des études de contraction cellulaire.
Dans cette expérience, une rigidité de 10 kPa a été utilisée dans le gel et un micromoptère de 70 μm (longueur diagonale) a été utilisé composé de collagène de type IV. Outre ces paramètres, la molécule adhésive peut être remplacée par divers collagènes, fibronectine, gélatine et autres matrices extracellulaires (ECM). La rigidité du gel peut être réglée jusqu’à 0,1 kPa et jusqu’à la plage MPa. La géométrie du micromotif peut être conçue de novo pour être n’importe quelle forme avec une taille de caractéristique minimale d’environ 5 μm. Ces paramètres sont découplés et peuvent être optimisés indépendamment pour un contexte biologique particulier.
Cette technologie a été largement validée pour être compatible avec les types de cellules hautement adhésives et contractiles d’un phénotype mésenchymateux, y compris divers types de cellules musculaires lisses (vessie humaine primaire, intestinale, trachéale, bronchique, utérine, aortique et artérielle), les cellules souches mésenchymateuses et leur progéniture différenciée, divers fibroblastes (pulmonaires, cutanés et cardiaques), les myofibroblastes et les cellules endothéliales. En outre, les macrophages dérivés des monocytes produiront également une force phagocytaire mesurable importante sur les micromotifs, en particulier si le micromoptule est constitué d’une opsonine connue. Diverses lignées cancéreuses peuvent également être analysées à l’aide de la méthode.
La méthode peut poser certains défis pour l’utilisation avec des cellules qui sont soit relativement petites telles que les cellules T et les neutrophiles, soit des types de cellules avec un phénotype principalement épithélial. La raison principale en est que la méthode repose sur une forte adhérence et une propagation complète des cellules sur le micromotif afin de générer le signal contractile mesurable. Les cellules qui se lient faiblement, se lient les unes aux autres ou ne se propagent pas complètement ne produiront pas de signaux contractiles mesurables. Ces comportements, qui sont relativement rares, peuvent être atténués en ajustant la taille du micromotif pour qu’il soit plus petit, ou en utilisant des molécules adhésives alternatives dans les micromotifs qui favoriseront mieux l’adhésion et la propagation dans ces cellules.
Les utilisateurs de la technologie doivent évaluer soigneusement différentes formulations possibles de milieux de culture cellulaire pour leur type particulier d’intérêt cellulaire, car différents composants, facteurs de croissance, taux sériques et sensibilités au pH peuvent entraîner des comportements variables dans différentes cellules. L’optimisation du protocole doit précéder la mise à l’échelle de tout flux de travail expérimental, et les composants multimédias doivent toujours être frais, stériles et cohérents avec les lots précédents.
En fin de compte, si la résolution d’une seule cellule n’est pas nécessaire pour les objectifs d’un utilisateur, ou si le type de cellule cible a une capacité de propagation minimale, alors le TFM traditionnel peut être tout aussi ou plus approprié pour de telles expériences. L’objectif et l’espoir des auteurs sont que cet outil offre aux biologistes cellulaires une avenue supplémentaire pour étudier la contraction cellulaire, en particulier dans le contexte des dépistages automatisés de médicaments phénotypiques à haut débit.
Spécifiquement aux utilisations futures dans les écrans de médicaments, des plaques à débit plus élevé telles qu’une plaque FLECS de 384 puits peuvent être utilisées. Dans de telles plaques, les objectifs 4x de nombreux microscopes peuvent capturer un seul puits entier dans leur champ de vision, garantissant ainsi que toutes les réponses contractiles cellulaires sont capturées. En utilisant un système d’imagerie à haut débit, une plaque entière de 384 puits peut être imagée en environ 5 minutes, ce qui rend ce système considérablement plus rapide que les autres options et, par conséquent, adapté à la découverte de médicaments phénotypiques à haut débit. En effet, les auteurs effectuent régulièrement des dépistages hebdomadaires de drogues sur environ 50 plaques de 384 puits (totalisant plus de 19 000 puits) en utilisant l’automatisation.
Disclosures
I.P. est un inventeur d’une famille de brevets délivrés protégeant les méthodes et les systèmes de la technologie FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C. et R.H. sont tous des employés de Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. est professeur à UCLA et cofondateur de Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. et R.D. détiennent des intérêts financiers dans Forcyte Biotechnologies, Inc., qui est le licencié exclusif des brevets ci-dessus et commercialise flecs Technology.
Acknowledgments
Les travaux de laboratoire ont été menés avec le soutien de la Molecular Shared Screening Resource (MSSR) de l’UCLA, où Forcyte parraine des activités de recherche, et de l’incubateur Magnify du California NanoSystems Institute (CNSI), où Forcyte Biotechnologies, Inc. est une société résidente. Les auteurs accorderont l’accès au module d’analyse FLECS Biodock.ai à tous les chercheurs universitaires sur demande. L.H. et I.P. ont contribué de manière égale à ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
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