Vereinfachte Hochdurchsatzanalyse der Einzelzellkontraktilität mit mikrostrukturierten Elastomeren

Zellerzeugte mechanische Kräfte sind für die ordnungsgemäße Funktion in verschiedenen Organen im ganzen Körper unerlässlich. Plus der Darm Blase, Herz und andere. Diese Organe müssen stabile Muster der Zellkontraktion und -entspannung erzeugen, um den inneren hämostatischen Zustand aufrechtzuerhalten.

Eine abnormale Kontraktion der glatten Muskelzellen kann zum Auftreten verschiedener Erkrankungen führen, einschließlich der Darmdysmotilität, die abnormale Muster des Darms mit Muskelkontraktion sowie Zustände wie überaktive oder unteraktive Blase charakterisiert. Und in den Atemwegen können einige Muskelzellen, die unregelmäßige Muster kontrahieren, asthmatische Hyperreaktionsfähigkeit auslösen. Es ist klar, dass kontraktile Mechanismen in Zellen und Geweben zu Krankheiten führen können, die Behandlungsmöglichkeiten erfordern.

Und da diese Bedingungen direkt auf dysfunktionales kontraktiles Verhalten von Zellen zurückzuführen sind, wird es sowohl logisch als auch notwendig, die kontraktile Zellfunktion selbst zu messen, wenn potenzielle Arzneimittelkandidaten untersucht werden. Nach den jüngsten Fortschritten in der Mikrotechnologie haben wir einen benutzerfreundlichen Mikroplatten-basierten Assay entwickelt, der quantitative Messungen der Einzelzellkontraktion ermöglicht. In Hunderttausenden von Zellen genannt Flex, auch bekannt als fluoreszierend markierte elastomere kontrahierbare Oberflächen.

Bei diesem Ansatz betten wir fluoreszierende Proteinmikromuster und damit weiche Filme ein, die sich verformen und schrumpfen, wenn Zellen Zugkräfte auf sie ausüben. Wichtig ist, dass die Proteinmikromuster die Zellposition, -form und -ausbreitungsfläche einschränken. Die einheitlichen Testbedingungen und erlauben einfache Messungen nur auf der Grundlage ihrer Maßänderungen.

Insgesamt ermöglicht die Plattform, die ein browserbasiertes Bildanalysemodul enthält, eine einfache Analyse der kontrahierbaren Zellkraft, ohne dass empfindliche Handhabungsverfahren oder die Registrierung von treuhänderischen Markern erforderlich sind, und kann von jedem Forscher mit den grundlegenden Zellkulturen und dem einfachen Fluoreszenzmikroskop mit geringer Vergrößerung bedient werden. Diese Technologie wurde mit Blick auf den Endbenutzer entwickelt und zielt darauf ab, die Eintrittsbarriere für jeden Laborwissenschaftler zu verringern, um die zelluläre Kraftbiologie zu studieren Beginnen Sie mit der Zugabe von 20 Millilitern Medien in eine chronische Röhre, erhalten Sie eine 24-Well-Platte, die entwickelt wurde, um die Zellkontraktilität zu untersuchen. Stellen Sie Ihre Pipette auf 500 Mikroliter und erhalten Sie ein Zellsieb für Zellpathogene.

Entfernen Sie den Deckel auf der 24-Well-Platte, halten Sie die Platte so hoch und entfernen Sie dann vorsichtig die Kunststoffschicht auf der Oberseite der Platte. Stellen Sie die Platte vorsichtig wieder ab. Aspirieren Sie nur die oberste Schicht PBS aus jedem Bohrloch, um ein Verschütten zu verhindern.

Entfernen Sie nun zeilenweise das verbleibende PBS aus dem Bohrloch und füllen Sie es schnell mit 500 Mikrolitern Zellmedien. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und tippen Sie auf die Seite, um sicherzustellen, dass der gesamte Boden des Brunnens mit Lösung bedeckt ist. Sobald alle Brunnen mit Medien gefüllt sind, stellen Sie die Platte zur Seite.

Holen Sie sich an dieser Stelle Ihre Zellkultur aus dem Inkubator. Wir werden ein solides Assoziationsprotokoll durchführen. Zweck dieses Protokolls ist es, eine Suspension von 50.000 Zellen pro Milliliter zu erstellen.

Bevor Sie die Zellen aussäen, stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Zellen einmal durch das Sieb belasten, um Zellklumpen in einzelne Zellen aufzubrechen, legen Sie vorsichtig 500 Mikroliter Ihrer Zelllösung in jede Vertiefung. Nach der Zellaussaat ist es wichtig, die Platten eine Stunde ruhen zu lassen, damit sich die Zellen direkt auf den Mustern absetzen können. Nachdem eine Stunde vergangen ist, legen Sie die Platte über Nacht in einen Inkubator.

Der zweite Teil des Experiments besteht aus der Zugabe der Medikamente zur 24-Well-Platte und der fluoreszierenden Bildgebung der Platte. Für diesen Teil des Protokolls haben wir zwei wichtige Anforderungen, um eine robuste Zelllebensfähigkeit und -reaktion zu gewährleisten. Die erste ist, dass die endgültige Konzentration von DMSO in den Vertiefungen mit der Zelle nicht mehr als 1% beträgt, was bedeutet, dass wir eine 100-vollständige Verdünnung aus unseren Medikamentenbeständen vornehmen müssen.

Die zweite ist, dass wir DMSO nicht so direkt zu den Bohrlöchern hinzufügen können, weil es auf den Boden dieser Mischung stürzt und dann die Zellen mit einer hohen Konzentration schädigt. Stattdessen müssen wir eine Zwischenlösung aus DMS0-Medikamenten und -Medien entwickeln, die wir gründlich miteinander mischen können, um eine hohe lokale DSSO-Exposition gegenüber den Zellen zu vermeiden. In diesem Protokoll werden wir eine sechsstufige achtfache Verdünnung durchführen, die einen Bereich von 40 Mikromolar bis zu einem Nanomolar abdeckt Erstellen Sie die sechsstufige achtfache Verdünnungsreihe, indem Sie 30 Mikroliter Stammarzneimittellösung in aufeinanderfolgende 210-Mikroliter-Volumina DMSO übertragen und gründlich zwischen jedem Übertragungsschritt mischen In unserem Experiment Wir werden die Wirkung von Blebbistatin bewerten.

auf menschlichen Blasen durch die Muskelzellen. Um beide Anforderungen zu erfüllen, werden wir zunächst eine DMSO- und Medienlösung für Zwischenmedikamente entwickeln. Das ergibt eine 16,7-fache Verdünnung von DMSO.

Dann werden wir diese Zwischenlösung zu unseren Zellen hinzufügen, wobei wir Anteile verwenden, die eine zusätzliche sechsfache Verdünnung ergeben, was zu einer Gesamtverdünnung von 100 vollen Verdünnungen und der Endkonzentration von 1% DMSO führt. Um dies zu erreichen, mischen Sie für jede Stammarzneimittellösung 30 Mikroliter Arzneimittel in 470 Mikroliter Zellkulturmedium, dann übertragen Sie 200 Mikroliter dieser Zwischenlösung in die entsprechende Vertiefung auf der 24-Well-Platte. die 1000 Mikroliter in jedem Brunnen enthält. Dies ergibt zusammen eine Endkonzentration von 1% DMSO-Inkubation für die entsprechende Zeitspanne. In unserem Experiment inkubieren wir 30 Minuten lang, wenn Sie bereit sind, einen lebenden Kernfleck überall in Ihren Brunnen hinzuzufügen, fügen Sie eine Verdünnung von eins zu 10.000 aus dem Bestand hinzu.

Lassen Sie es für weitere 15 Minuten inkubieren. Wenn Sie zum Abbilden bereit sind, benötigen Sie ein Fluoreszenzmikroskop, das mit der Abbildung der Fluoreszenzkanäle sowohl für die markierten Zellkerne als auch für den Fluoreszenzfarbstoff ausgestattet ist. Die Mikromuster sind beschriftet, mit denen in unserem Beispiel der Tri-C-Kanal zu sehen ist.

Jetzt werden wir Blebbistatin-Kerne fluoreszieren, um einzelne Zellen zu identifizieren, stellen Sie sicher, dass Sie die Fleckenzellkerne in genau der gleichen Position abbilden, an der Sie das Mikromuster betrachten, damit sie während der Analyse ausgerichtet werden können. Laden Sie die aufgenommenen Bilder auf Ihren Computer hoch und stellen Sie sicher, dass die Bilder ordnungsgemäß beschriftet sind, sodass die Musterkanäle auf Unterstrich PT enden. Und Bilder im Kernkanal enden mit einer Unterstreichung von dapi. Jetzt konvertieren wir die tif-Bilder in PNG-Bilder mit Bild J Sobald Bild J geöffnet ist, laden Sie es jeweils in einem Kanal.

Wir werden zuerst den Musterkanal laden und den Kontrast anpassen, um das Signal zu maximieren und den Hintergrund zu minimieren. Außerdem werden wir das Bild glätten. Sobald das Bild nach unseren Wünschen geändert wurde, ändern wir den Bildtyp auf acht Bit.

Exportieren Sie dann das Bild als PNG-Typ. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen, und verwenden Sie Segmentbeschriftungen als Dateinamen. Erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen PNGs.

Dann speichern Sie die PNG-Dateien dort, Um die Bilder zu analysieren, navigieren Sie zu Biodock dot AI, erstellen Sie ein Konto und kontaktieren Sie die Autoren, um freien Zugang zum Analysemodul zu erhalten. Melden Sie sich an, sobald Ihr Konto erstellt wurde. Hier können Sie neue Bilder hochladen.

Wir nennen diesen neuen Batch, Web-Experiment-Daten JoVE. Jetzt können wir die Bilder importieren, indem wir sie ziehen und dann ablegen, drücken Sie OK.At diesem Punkt, wählen Sie Ihre Daten aus. Klicken Sie dann auf Analysieren, scrollen Sie nach unten zu dem Modul mit der Bezeichnung Kontraktilitätsanalyse und klicken Sie dann auf Auswählen.

Stellen Sie die Vergrößerung auf den gleichen Wert ein, den Sie für die Bildgebung verwendet haben Sobald die Daten vollständig sind, klicken Sie darauf, dann können wir Daten herunterladen auswählen. Sobald die Daten heruntergeladen wurden, können wir überlagerte Bildpaare für jedes eingegebene Bild sehen. Wir haben auch Zugang zu einer zusammenfassenden Statistik, die uns die durchschnittliche Kontraktion für jeden Zellsatz liefert.

Die Maßeinheit für die Kontraktion ist in Pixeln. Wenn wir uns die Daten ansehen, können wir hier sehen, dass es in den nur mit DMSO behandelten Vertiefungen eine viel höhere Kontraktion der Zellen im Vergleich zu den Zellen gab, die mit Blebbistatin behandelt wurden. Wir haben auch Zugriff auf Daten für jedes einzelne Muster, das in einem der Bilder erkannt wurde.

Dies gibt uns detaillierte Informationen über die Position des Bildes, den Bildursprung, den Positionstyp, die Anzahl der Zellen, entweder Null eins oder mehr als eins, die Größe des Mikromusters und die berechnete Kontraktion der Zellen. Diese Schicht besteht aus jedem einzelnen identifizierten Muster innerhalb der Mikroplatte. Einzelzellenmuster aus dieser Liste waren durchschnittlich, um die durchschnittliche Kontraktion für das PNG-Bild in der anderen Datei zu berechnen.

Sie können die einzelnen Zelldaten nach Bedarf für Ihr Experiment sortieren und analysieren. Für diesen Teil des Videos zeigen wir repräsentative Daten, die von einer 24-Well-Platte gesammelt werden können, die diese Reaktionsdaten von glatten Blasenmuskelzellen zeigt, die mit zwei verschiedenen Medikamenten behandelt wurden. Dies sind Bilder von Brunnen, die mit DMSO bzw. Blebbistatin behandelt wurden.

Hier können wir sehen, dass die Zellen, die nur mit DMSO behandelt werden, eine große Anzahl von Kontraktmikromustern aufweisen, aber Zellen, die mit Blebbistatin behandelt wurden, waren größer und offen für die Feststellung, dass es weniger Kontraktion gibt. Die Daten in diesem Histogramm zeigen die Kontraktilität der Variationszellen als Folge der verschiedenen Behandlungen zu den Zellen. Das Verteilungszentrum für Zellen, die mit Blebbistatin behandelt wurden, ist niedriger als das Verteilungszentrum für Zellen, die mit dem DMSO behandelt wurden.

Dies stimmt mit den Informationen überein, die in den vorherigen Bildern angezeigt wurden. Weil die Zellen, die mit Blebbistatin behandelt wurden, eine viel geringere Kontraktion aufwiesen. Dies bedeutet, dass die Behandlung mit Blebbistatin die Zellen deutlich entspannt.

Jeder dieser Datensätze trägt zu einem Punkt auf der Dosis-Wirkungs-Kurve bei, der von einer einzigen 24-Well-Platte gesammelt werden kann, und folgt den im Video gezeigten Protokollen. Hier können wir sehen, dass Cytochalasin D stärker ist als Blebbinstan, wie die niedrigeren Kontraktionswerte angesichts der höheren Konzentrationen des Arzneimittels zeigen. Wenn Sie Ihre Experimente signifikant skalieren möchten, ist eine 384-Well-Plate-Version verfügbar, die mit Automatisierung verwendet werden kann, um die Experimente dramatisch zu skalieren.

Diese Daten können von einer 384-Well-Platte gesammelt werden, anstatt sechs Verdünnungsschritte für jedes Medikament auf der 24-Well-Platte zu haben, ermöglicht uns die 384-Well-Platte, 20 Verdünnungsschritte für jedes Medikament mit mehreren Replikaten durchzuführen. Die Snowflakes-Technologie ist einzigartig. Es ermöglicht die Visualisierung der Einzelzellkontraktion mittels Mikroskopie, was bisher nicht möglich war.

Die Technologie beruht also auf der Form von Metriken, die mit fluoreszierend markiertem Protein gemustert sind. Systematisches Muster soll sich für die zelluläre Kontraktion bilden und ermöglicht eine präzise Messung der Modulation eines Phänotyps durch ein bestimmtes Medikament. Natürlich wird diese Technologie immer noch aktiv für Anwendungen und viele verschiedene Krankheitsbereiche entwickelt, wie Asthma, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Entzündungsimmunonkologie und natürlich jede unserer Krankheitsindikationen, bei denen eine abnormale zelluläre Kontraktion eine Schlüsselrolle beim Fortschreiten der Krankheit spielt.

Wie wir zeigen, bietet diese auf Mikromusterung basierende Technologie zur Messung der Zellkontraktilität eine vereinfachte Alternative zur herkömmlichen Zugkraftmikroskopie, die eine intuitive Analyse ermöglicht, das Schrumpfen des Musters beobachtet und die Einzelzellauflösung in großen Zellpopulationen ermöglicht. Einige Überlegungen, diese Methode kann Herausforderungen für die Verwendung von Zellen darstellen, die entweder zu klein sind, wie T-Zellen und Neutrophile, oder Zelltypen, die nicht haften. Darüber hinaus produzieren Zellen, die wöchentlich binden, überwiegend aneinander binden oder sich nicht vollständig ausbreiten, keine messbaren kontraktilen Signale.

Anwender der Technologie müssen verschiedene mögliche Zellkulturmediumformulierungen für ihren jeweiligen Zelltyp sorgfältig bewerten. als verschiedene Komponenten, Wachstumsfaktoren, Serumspiegel und pH-Empfindlichkeiten können unterschiedliche Verhaltensweisen beeinflussen. Die Optimierung der Protokolle sollte die Skalierung aller experimentellen Workflows fortsetzen.

Letztendlich, wenn eine Einzelzellauflösung nicht notwendig ist oder wenn der Zielzelltyp eine minimale Spreizkapazität hat, können traditionelle Anziehungskraftmikroskopie-Methoden für solche Experimente verwendet werden. Ansonsten hoffen wir, dass dieses Tool eine zusätzliche Möglichkeit für Zellbiologen bietet, die Zellkontraktion zu untersuchen und ihre Studien durchzuführen.