Methodenartikel

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

DOI:

10.3791/63231

⸱

11. März 2022

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Untersuchung der Glykosylierung in Prokaryoten ist ein schnell wachsendes Gebiet. Bakterien beherbergen auf ihrer Oberfläche unterschiedliche glykosylierte Strukturen, deren Glykane einen stammspezifischen Barcode bilden. Die assoziierten Glykane zeigen eine höhere Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur als die von Eukaryoten und sind wichtig für bakterielle Wirtserkennungsprozesse und die Interaktion mit der Umwelt. In pathogenen Bakterien waren Glykoproteine an verschiedenen Stadien des Infektionsprozesses beteiligt, und Glykanmodifikationen können bestimmte Funktionen von Glykoproteinen beeinträchtigen. Trotz der Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung, Struktur und Biosynthesewege von Glykanen bleibt das Verständnis der Rolle von Glykoproteinen bei der Pathogenität oder der Wechselwirkung mit der Umwelt sehr begrenzt. Darüber hinaus werden bei einigen Bakterien die für die Proteinglykosylierung erforderlichen Enzyme mit anderen Polysaccharid-Biosynthesewegen, wie Lipopolysaccharid- und Kapsel-Biosynthesewegen, geteilt. Die funktionelle Bedeutung der Glykosylierung wurde in mehreren Bakterien durch Mutation spezifischer Gene aufgeklärt, von denen angenommen wird, dass sie am Glykosylierungsprozess beteiligt sind, und durch die Untersuchung seiner Auswirkungen auf die Expression des Zielglykoproteins und des modifizierenden Glykans. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes und O-glykosyliertes polares Flagellum. Flagellar-Glykane zeigen eine Vielfalt in der Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge zwischen Aeromonas-Stämmen. Alle bisher analysierten Stämme zeigen jedoch ein Pseudaminsäurederivat als verbindenden Zucker, der Serin- oder Threoninreste modifiziert. Das Pseudaminsäurederivat wird für die Anordnung polarer Flagellen benötigt, und sein Verlust hat Auswirkungen auf die Adhäsion, die Bildung von Biofilmen und die Besiedlung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Konstruktion von Nullmutanten verwendet werden kann, um die Beteiligung von Genen oder Genomregionen, die mutmaßliche Glykosyltransferasen enthalten, an der Biosynthese eines Flagellenglykans zu verstehen. Dazu gehört auch das Potenzial, die Funktion der beteiligten Glykosyltransferasen und die Rolle des Glykans zu verstehen. Dies wird erreicht, indem die Glykanmangel-Mutante mit der Wildtyp-Sorte verglichen wird.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Proteinglykosylierung wurde sowohl bei Gram-positiven als auch bei Gram-negativen Bakterien beschrieben und besteht aus der kovalenten Bindung eines Glykans an eine Aminosäure-Seitenkette 1,2. In Prokaryoten geschieht dieser Prozess normalerweise über zwei wichtige enzymatische Mechanismen: O- und N-Glykosylierung 3. Bei der O-Glykosylierung wird das Glykan an die Hydroxylgruppe eines Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Rückstands gebunden. Bei der N-Glykosylierung ist das Glykan an den Seitenkettenamidstickstoff eines Asparagins (Asn)-Rest....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Bioinformatische Identifizierung von Flagellenglykosylierungsinseln (FGIs) in Aeromonas

  1. Um die PseAc-Biosynthesecluster in den Aeromonas-Genomen zu identifizieren, verwenden Sie das tblastn-Tool aus der NCBI-Datenbank26. Rufen Sie zunächst orthologe Proteine zu PseC und PseI von A. piscicola AH-3 (Identifikationscodes sind OCA61126.1 und OCA61113.1) aus Datenbanken sequenzierter Aeromonas-Stämme ab und verwenden Sie dann das tblastn-To....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Methodik bietet ein effektives System zur Erzeugung von Nullmutanten in Genen oder chromosomalen Regionen von Aeromonas, die die Glykosylierung von Flagellen und die Rolle von Flagellenfilamenten beeinflussen können (Abbildung 1).

Das Protokoll beginnt mit der bioinformatischen Identifizierung von mutmaßlichen FGIs und den Genen, die GTs kodieren, die in dieser Region vorhanden sind. In Aeromonas basiert die chromosomale Lage von FGIs auf d.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der entscheidende frühe Schritt dieser Methode ist die Identifizierung von Regionen, die an der Glykosylierung von Flagellen und mutmaßlichen GTs beteiligt sind, da diese Enzyme eine hohe Homologie aufweisen und an vielen Prozessen beteiligt sind. Die bioinformatische Analyse von Aeromonas-Genomen in öffentlichen Datenbanken zeigt, dass diese Region an die polare Flagellenregion 2 angrenzt, die die Flagellin-Gene in vielen Stämmen enthält und Gene enthält, die an der Biosynthese von Pseudaminsäure

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom National Research Council Canada für den Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) und für die Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) unterstützt.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitAngewandte Biosysteme4337455Wird für die Sequenzierung verwendet
AccuPrime Taq DNA-Polymerase, High FidelityInvitrogen12346-086Wird für die Amplifikation von AB-, CD- und AD-Fragmenten verwendet
AgaroseConda-Pronadise8008Wird für die DNA-Elektrophorese
verwendet Alkalische Phosphatase, Kälberdarm (CIAP)PromegaM1821Zur Entfernung von Phosphat am 5'-Ende
Bacon-AgarBecton Dickinson214010Zur Motilitätsanalyse
BamHIPromegaR6021Zur Endonuklease-Restriktion
BglIIPromegaR6081Zur Endonuklease-Restriktion
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-Imaging-Station wird für die DNA-Visualisierung
verwendet Biotaq-PolymeraseBiolineBIO-21040Wird für das Kolonie-Screening
CäsiumchloridApplichemA1126,0100Wird für die Flagellenreinigung
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Wird für die triparentale Paarung
verwendet Cytiva illustra GFX PCR DNA und Gelband-AufreinigungskitCytivia28-9034-71Wird zur Aufreinigung von PCR-Amplikons und DNA-Fragmenten verwendet.
EDTAApplichem131026.1211Wird für die DNA-Elektrophorese verwendet
Elektroporationsküvetten 2 mm SpaltVWR732-1133Wird für die Transformation
verwendet EthidiumbromidApplichemA1152,0025Verwendung für die DNA-Visualisierung
HyperLadder 1 Kb MarkerBiolineBIO-33053DNA-Marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA AufreinigungskitInvitrogen10750204Wird für die bakterielle Chromosomen-DNA-Reinigung
Luria-Bertani (LB) Miller-AgarCondalab996Wird für Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) MillerBouillonCondalab1551verwendet für Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpektralphotometer zur DNA-Quantifizierung
RifampicinApplichemA2220,0005Zur triparentalen Paarung
SOC MediumInvitrogen15544034Zur Elektroporationsrückgewinnung
SpectinomycinApplichemA3834,0005Zur triparentalen Paarung
SW 41 Ti SchwingschaufelrotorBeckman331362Zur Flagellenreinigung
T4-DNA-LigaseInvitrogen15224017Wird für die Ligationsreaktion
verwendet Trypticasein-Soja-AgarCondalab1068Wird für Aeromonas angebaute
Trypticasein-Sojabrüheverwendet Condalab1224Wird für Aeromonas angebautes
TryptonCondalab1612verwendet für die Motilitätsanalyse
TrisApplichemA2264,0500Wird für die DNA-Elektrophorese und Flagellenreinigung verwendet
Triton X-100ApplichemA4975,0100Wird für die bakterielle Lyse
verwendet Ultra Clear Röhrchen (14 mm x 89 mm)Beckman344059Wird für die Flagellenreinigung verwendet
Veriti 96 Well Thermal Cycler AngewandteBiosystemeWird für PCR-Reaktionen
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Wird zur Isolierung von Plasmid-DNA verwendet
verwendet verwendet verwendet verwendet

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobac....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Bacterial GlycosyltransferasesNull Mutant GenerationFlagella GlycosylationBacterial MotilityAeromonas StrainsGene DeletionPolar FlagellumMass SpectrometrySwimming MotilityGlycan Biosynthesis

Verwandte Artikel