Summary
यहां, हमने यह दिखाने के लिए एलिज़ारिन लाल धुंधलापन का उपयोग किया है कि लीड एसीटेट एक्सपोजर ज़ेब्राफिश लार्वा में हड्डी द्रव्यमान परिवर्तन का कारण बनता है। इस धुंधला विधि को अन्य खतरनाक विषाक्त पदार्थों द्वारा प्रेरित ज़ेब्राफिश लार्वा हानि में हड्डी के नुकसान की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
लीड (पीबी) एक्सपोजर के कारण रासायनिक रूप से प्रेरित हड्डी का नुकसान मानव और पशु कंकाल प्रणालियों दोनों पर प्रतिकूल प्रभावों की एक सरणी को ट्रिगर कर सकता है। हालांकि, ज़ेबराफ़िश में विशिष्ट प्रभाव और तंत्र स्पष्ट नहीं हैं। एलिज़ारिन लाल में कैल्शियम आयनों के लिए एक उच्च संबंध है और हड्डी की कल्पना करने और कंकाल खनिज द्रव्यमान को चित्रित करने में मदद कर सकता है। इस अध्ययन में, हमने एलिज़ारिन लाल धुंधलापन का उपयोग करके ज़ेब्राफिश लार्वा में लीड एसीटेट (पीबीएसी) -प्रेरित हड्डी के नुकसान का पता लगाने का लक्ष्य रखा। ज़ेबराफिश भ्रूण को निषेचन के बाद 2 और 120 घंटे के बीच पीबीएसी सांद्रता (0, 5, 10, 20 मिलीग्राम / एल) की एक श्रृंखला के साथ इलाज किया गया था। निषेचन के 9 दिनों के बाद लार्वा पर पूरे-माउंट कंकाल धुंधला किया गया था, और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कुल दाग वाले क्षेत्र की मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणामों ने संकेत दिया कि खनिज युक्त ऊतक लाल रंग में दागदार थे, और हड्डी खनिज में खुराक-निर्भर परिवर्तन के साथ पीबीएसी-एक्सपोज़र समूह में दाग वाले क्षेत्र में काफी कमी आई थी। यह पेपर पीबीएसी-प्रेरित हड्डी दोषों में कंकाल परिवर्तनों की जांच के लिए एक धुंधला प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। अन्य रसायनों द्वारा प्रेरित हड्डी के नुकसान का पता लगाने के लिए जेब्राफिश लार्वा में भी विधि का उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
हाल के अध्ययनों ने पुष्टि की है कि ग्लूकोकार्टोइकोड्स, एरोमाटेज इनहिबिटर और अत्यधिक शराब की खपत के कारण ऑस्टियोपोरोसिस आम है 1,2. सीसा (पीबी) एक जहरीली धातु है जो पौधों, मिट्टी और जलीय वातावरण में पायाजाता है। यद्यपि मानव शरीर पर पीबी के प्रतिकूल प्रभावों ने बहुत ध्यान आकर्षित किया है, हड्डी पर इसके अपरिवर्तनीय प्रभाव की आगे जांच करने की आवश्यकता है। लीड नशा विकासशील और वयस्क कंकाल दोनों में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों की एक विविध सरणी का कारण बनता है, जो सामान्य जीवन गतिविधियों को प्रभावित करता है। अध्ययनों में क्रोनिक पीबी एक्सपोजर और हड्डी की क्षति4 के बीच एक संबंध पाया गया है, जिसमें बिगड़ा हुआ हड्डी संरचना 5,6, हड्डी खनिज घनत्व कम हो गया है, और यहां तक कि ऑस्टियोपोरोसिस का खतरा भी बढ़गया है।
खनिज ऊतक हड्डी की ताकत8 के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, और हड्डी खनिज मैट्रिक्स जमाव हड्डी के गठन का एक महत्वपूर्ण सूचकांकहै। एलिज़ारिन लाल में कैल्शियम आयनों के लिए एक उच्च संबंध है, और एलिज़ारिन लाल धुंधलाहड्डी के गठन का आकलन करने के लिए एक मानक प्रक्रिया है। इस विधि के अनुसार, खनिज ऊतक लाल रंग का होता है, जबकि अन्य सभी ऊतक पारदर्शी रहते हैं। दाग वाले क्षेत्र को तब डिजिटल छवि विश्लेषण11 द्वारा निर्धारित किया जाता है।
ज़ेबराफिश एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव है जिसका व्यापक रूप से दवा की खोज और रोग मॉडल में उपयोग किया जाता है। ज़ेबराफिश और मनुष्यों में आनुवंशिक अध्ययन ने आणविक स्तर12 पर कंकाल मोर्फोजेनेसिस के अंतर्निहित तंत्र में समानता का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, उच्च-थ्रूपुट दवा या बायोमोलेक्यूल स्क्रीनिंग म्यूरिन मॉडल की तुलना में ज़ेबराफिश के बड़े चंगुल में अधिक संभव है, जिससे प्रोस्टोजेनिक या ओस्टियोटॉक्सिक अणुओं के यांत्रिक अध्ययन की सुविधा मिलतीहै। टोटो10 में कंकाल के विभेदक धुंधलापन का उपयोग अक्सर छोटे कशेरुक और स्तनधारी भ्रूण में कंकाल डिस्प्लेसिया का अध्ययन करने में किया जाता है। ज़ेब्राफिश लार्वा में रसायनों की हड्डी के विकास संबंधी विषाक्तता की जांच के लिए एलिज़ारिन लाल धुंधलापन किया गया था। यहां, हमने जेब्राफिश लार्वा में लीड एसीटेट-प्रेरित हड्डी दोषों का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में लीड का उपयोग किया।
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Protocol
यहां उल्लिखित सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और सूचना विश्वविद्यालय की आचार समिति के पशु देखभाल संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. मछली पालन और भ्रूण संग्रह 14
- हर दिन तीन बार मछली को खिलाएं; सुनिश्चित करें कि ज़ेबराफिश को 14:10 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ 28.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाए।
- शाम को 2: 1 पुरुष से महिला अनुपात पर स्पॉनिंग टैंक में अलगाव बोर्डों द्वारा नर और मादा वयस्क मछलियों को अलग करें।
- अगली सुबह, 9:00 बजे अलगाव बोर्ड ों को हटा दें और 2 घंटे बाद भ्रूण एकत्र करें।
- प्रयोग से पहले भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए जैव रासायनिक इनक्यूबेटर में रखें।
2. रासायनिक जोखिम
- मदर स्टॉक तैयार करें: लीड एसीटेट ट्राइहाइड्रेट (5 ग्राम) का वजन करें, और इसे हिलाने के साथ अल्ट्राप्योर पानी (50 एमएल) में घोलें।
चेतावनी: पीबीएसी विषाक्त है। उपयुक्त धूल मास्क, सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनें। प्रयोग को एक फ्यूम हुड के तहत करें। - जेब्राफिश भ्रूण को साफ 6-वेल प्लेटों में चुनें और यादृच्छिक रूप से वितरित करें (3 एमएल जेब्राफिश प्रजनन पानी में प्रति कुएं 30 भ्रूण; इसकी संरचना के लिए तालिका 1 देखें)। निषेचन (एचपीएफ) के बाद 2 से 120 घंटे तक पीबीएसी (0, 5, 10, 20 मिलीग्राम / एल) के साथ भ्रूण का इलाज करें।
नोट: पीबीएसी की सांद्रता को खुराक-रेंज-खोज प्रयोगों के अनुसार चुना गया था। परिणामों से पता चला है कि जेब्राफिश भ्रूण पर लीड एसीटेट का एलसी50 120 एचपीएफ पर 41.044 मिलीग्राम / एल था। इसलिए, उच्चतम एकाग्रता एलसी50 के आधे हिस्से पर सेट की गई थी और 2 गुना कमजोर पड़ने से तैयार समाधानों की एक श्रृंखला थी। - निषेचन (डीपीएफ) के बाद 5 दिनों से लार्वा को दिन में दो बार खिलाएं। 14:10 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ 28.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर जेब्राफिश भ्रूण को बनाए रखें।
- पीबी-मुक्त माध्यम (जेब्राफिश प्रजनन जल) को हर 24 घंटे में 9 डीपीएफ तक ताज़ा करें।
नोट: प्रयोगों के पूरा होने पर, सभी लीड युक्त समाधानों को एक निर्दिष्ट तरल टैंक में डाला गया और प्रयोग प्रबंधन केंद्र द्वारा इलाज किया गया।
3. अलीजारीन लाल धुंधलापन
नोट: पूरी धुंधला प्रक्रिया के दौरान उपयुक्त धूल मास्क, सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनें। सभी समाधानों की रचनाएँ तालिका 1 में दिखाई गई हैं।
- विशिष्ट धुंधला कदम
नोट: रंगाई प्रक्रिया कमरे के तापमान पर 24-वेल प्लेट में की गई थी। प्रत्येक समाधान जोड़े जाने के बाद, 24-वेल प्लेट को कम गति से हिलने वाली मेज सेट पर रखें।- 9 डीपीएफ पर प्रत्येक समूह से यादृच्छिक रूप से 10 जेब्राफिश लार्वा निकालें और मछली को 2 घंटे के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड / 1 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड खारा के 1 एमएल में ठीक करें।
- घोल को डिकेंट करें और 10 मिनट के लिए 100 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5)/10 एमएम एमजीसीएल2 के साथ जेब्राफिश लार्वा को धोएं।
- घोल को अलग करें और लार्वा को निम्नलिखित समाधानों में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें: निर्जल इथेनॉल (ईटीओएच) समाधान (80% ईटीओएच / 100 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5)/10 एमएम एमजीसीएल2, 50% ईटीओएच / 100 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच = 7.5), और 25% ईटीओएच / 100 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच = 7.5)।
- घोल को डिकेंट करें, 3% एच2ओ2 और 0.5% कोह से युक्त घोल के साथ ब्लीच करके वर्णक को हटा दें, और वर्णक को पूरी तरह से हटाने तक हर 10 मिनट में एक बार निरीक्षण करें।
- जेब्राफिश लार्वा को 25% ग्लिसरीन / 0.1% केओएच के साथ 10 मिनट के लिए कई बार धोएं जब तक कि कोई बुलबुले न हों।
नोट: बुलबुले से बचना महत्वपूर्ण है; अन्यथा, ज़ेबराफिश शरीर में बुलबुले माइक्रोस्कोप के नीचे एक काले क्षेत्र के रूप में दिखाई देंगे, जो अवलोकन और मात्रात्मक विश्लेषण को प्रभावित करेगा। - लार्वा को 50 मिनट के लिए 0.01% एलिजारिन के 1 एमएल में भिगोकर दाग दें।
- घोल को डिकेंट करें और पृष्ठभूमि को साफ करने के लिए 10 मिनट के लिए 50% ग्लिसरीन / 0.1% केओएच का 1 एमएल जोड़ें। बाद के अवलोकन के लिए मछलियों को ताजा 50% ग्लिसरीन / 0.1% KOH में स्टोर करें।
4. छवि अधिग्रहण
- लार्वा को तरल बूंद के बीच में रखते हुए, हर बार ग्लास स्लाइड पर एक लार्वा स्थानांतरित करें।
- एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा का निरीक्षण करें।
- कैमरा चालू करें, सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री तालिका देखें), और डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें।
- एई पर क्लिक करें, और सबसे अच्छी छवि प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त एक्सपोज़र समय (इस प्रयोग में 60 एमएस) चुनें।
- सभी छवियों को एक ही सेटिंग्स के तहत कैप्चर करें। छवियों को बाद के विश्लेषण .tif लिए स्वरूप में सहेजें.
5. छवि विश्लेषण
नोट: छवि विश्लेषण के लिए नमूना ग्राफ़ के एक सेट के साथ एक उदाहरण के लिए पूरक फ़ाइल देखें।
- ImageJ आइकन को डबल-क्लिक करें और चरण 4.5 में सहेजी गई छवियों का विश्लेषण करें।
- फ़ाइल पर क्लिक करें | चरण 4.5 में सहेजे गए चित्रों को खोलने के लिए खोलें।
- छवि पर क्लिक करें | टाइप करें, 8-बिट का चयन करें।
- संपादित करें पर क्लिक करें | इनवर्ट।
- विश्लेषण पर क्लिक करें | कैलिब्रेट करें, पॉपअप इंटरफ़ेस में अनकैलिब्रेटेड ओडी का चयन करें, निचले इंटरफ़ेस के निचले बाईं ओर ग्लोबल कैलिब्रेशन की जांच करें, और ठीक पर क्लिक करें।
- विश्लेषण पर क्लिक करें | स्केल सेट करें | पॉपअप इंटरफ़ेस में स्केल निकालने के लिए क्लिक करें , नीचे ग्लोबल देखें, और ठीक क्लिक करें।
- विश्लेषण पर क्लिक करें | माप सेट करें, पॉपअप इंटरफ़ेस में आइटम क्षेत्र का चयन करें, नीचे सीमा से सीमा की जाँच करें (केवल चयनित श्रेणी को मापने के लिए), और ठीक क्लिक करें।
- छवि पर क्लिक करें | समायोजित करें | थ्रेशोल्ड, उपयुक्त सीमा का चयन करने के लिए पॉपअप इंटरफ़ेस के बीच में स्लाइडर स्लाइड करें (प्रत्येक छवि के लिए सीमा बदलें) ताकि एक छवि में परीक्षण किए जाने वाले सभी लक्ष्यों का चयन किया जा सके, और सेट पर क्लिक करें।
- विश्लेषण पर क्लिक करें | माप. प्रत्येक समूह की दिनांक रिकॉर्ड करें.
- मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए टुकी के कई तुलना परीक्षणों के बाद एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करें, और पी < 0.001 (*** पर महत्व स्तर सेट करें।
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Representative Results
एलिज़ारिन लाल धुंधला ज़ेबराफिश लार्वा में हड्डी खनिज में परिवर्तन को मापने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट विधि है। इस अध्ययन में, हमने देखा है कि पीबीएसी का ज़ेब्राफिश लार्वा पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ा, जिसमें मृत्यु, विकृति, हृदय गति में कमी और शरीर की लंबाई कम हो गई। इसके अलावा, पीबीएसी-प्रेरित हड्डी के नुकसान की जांच के लिए ज़ेब्राफिश लार्वा के खनिज कंकाल क्षेत्रों का मूल्यांकन किया गया था। 9 डीपीएफ (चित्रा 1 ए) में, सिर के कंकाल की कई हड्डियां खनिज युक्त होती हैं और इसलिए लाल रंग में दागदार होती हैं, जैसे कि पैराफेनोइड (पीएस), ऑपरकल (ओपी), सेराटोब्रांचियल (सीबी), और नोटोकॉर्ड (एनसी)। इसके विपरीत, ओटोलिथ (ओटी) (गैर-बोनी संरचनाएं) लाल के बजाय भूरे-काले दिखाई देते हैं। प्रत्येक छवि में कुल दाग वाले क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए डिजिटल विश्लेषण किया गया था। नियंत्रण समूह की तुलना में, 10 और 20 मिलीग्राम / एल पीबीएसी के साथ इलाज किए गए लीड एसीटेट समूहों ने दाग वाले क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण कमी (पी < 0.001) दिखाई (चित्रा 1 बी)। हड्डी खनिज में परिवर्तन ने खुराक-निर्भरता दिखाई।
चित्र 1: ज़ेब्राफिश लार्वा खोपड़ी पर पीबीएसी की विभिन्न सांद्रता के प्रभाव। (ए) 9 डीपीएफ पर लार्वा में एलिज़ारिन लाल रंग से सना सिर की हड्डी के पृष्ठीय पहलू की छवियां। खनिज युक्त ऊतक लाल रंग में सना हुआ है। स्केल सलाखों = 0.5 मिमी (बी) 9 डीपीएफ पर सापेक्ष खनिज क्षेत्र में परिवर्तन; प्रति समूह 10 लार्वा। डेटा को एसईएम के औसत के रूप ± व्यक्त किया जाता है। तीन प्रतिकृतियां की गईं। पी < 0.001 *** संक्षेप: पीएस = पैराफेनोइड; ओपी = ऑपेकल; ओटी = ओटोलिथ; सीबी = सेराटोब्रांचियल; एनसी = नोटोकॉर्ड; डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| घोल | संयोजन | |
| ज़ेबराफिश प्रजनन पानी | पीएच 7-7.3, 27-29 डिग्री सेल्सियस, चालकता 450-550 μs, लवणता 0.25-0.75%0, घुलित ऑक्सीजन >6 मिलीग्राम / L, फोटोअवधि 14/10 घंटे, कठोरता 100-200 मिलीग्राम / एल < < < <, क्लोरीन 0 मिलीग्राम / | |
| 2% पैराफॉर्मलडिहाइड और 1x PBS का मिश्रित घोल (50 mL) | 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 25 एमएल, 10x PBS बफर का 5 एमएल, और डबल डिस्टिल्ड वाटर (ddH2O) q.s. से 50 mL | |
| 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) और 10 mM MgCl2 का मिश्रित घोल (50 mL) | 1 M Tris-HCl (pH = 7.5) का 5 mL, 1 MgCl2 का 0.5 mL, और ddH2O q.s से 50 mL | |
| 80% निर्जल इथेनॉल, 10 mM MgCl2, और 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) का मिश्रित घोल (50 mL) | 95% निर्जल इथेनॉल का 42.1 एमएल, 1 एम ट्रिस-एचसीएल का 5 एमएल (पीएच = 7.5), 1 एमजीसीएल2 का 0.5 एमएल, और डीडीएच2ओ क्यू एस से 50 एमएल | |
| 50% निर्जल इथेनॉल और 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) का मिश्रित घोल (50 mL) | 95% निर्जल इथेनॉल का 26.3 एमएल, 1 एम ट्रिस-एचसीएल का 5 एमएल (पीएच = 7.5), और डीडीएच2ओ क्यू एस से 50 एमएल | |
| 25% निर्जल इथेनॉल और 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) का मिश्रित घोल (50 mL) | 95% निर्जल इथेनॉल का 13.2 एमएल, 1 एम ट्रिस-एचसीएल का 5 एमएल (पीएच = 7.5), और डीडीएच2ओ क्यू एस से 50 एमएल | |
| 3% H 2O 2समाधान और 0.5% KOH समाधान का मिश्रित समाधान | उपयोग से पहले 6% H2O2 और 1% KOH की बराबर मात्रा मिश्रित | |
| 25% ग्लिसरीन और 0.1% KOH का मिश्रित घोल (50 mL) | 100% ग्लिसरीन का 12.5 एमएल, 20% कोह का 0.25 एमएल, और डीडीएच2ओ क्यू एस से 50 एमएल | |
| 0.01% एलिजारिन (50 एमएल) | 0.5% एलिजरिन का 1 एमएल, 100% ग्लिसरीन का 12.5 एमएल, 1 एम ट्रिस-एचसीएल का 5 एमएल (पीएच = 7.5), और डीडीएच2ओ क्यू एस से 50 एमएल | |
| 50% ग्लिसरीन और 0.1% KOH का मिश्रित घोल (50 mL) | 100% ग्लिसरीन का 25 एमएल, 20% कोह का 0.25 एमएल, और डीडीएच2ओ क्यू एस से 50 एमएल | |
तालिका 1: एलिज़ारिन लाल धुंधला प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों की संरचना। संक्षिप्त नाम: q.s. = क्वांटम पर्याप्त (आवश्यकतानुसार)।
पूरक फ़ाइल: छवि विश्लेषण के लिए नमूना ग्राफ़ का एक सेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
जेब्राफिश हड्डी चयापचय रोग का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल है। कृंतक मॉडल की तुलना में, ज़ेबराफिश मॉडल स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत तेज़ हैं, और रोग की गंभीरता का माप आसान है। जंगली प्रकार के ज़ेब्राफिश लार्वा में, सिर के कंकाल का खनिजकरण 5 डीपीएफ पर और अक्षीय कंकाल 7 डीपीएफ15 पर होता है। इस प्रकार, पीएस, ओपी, सीबी और एनसी जैसी कपाल हड्डियां 9 डीपीएफ पर अच्छी तरह से विकसित होती हैं। लार्वा को पूरी तरह से दागदार और ब्लीच किए जाने के बाद, नरम ऊतकों को साफ कर दिया गया, जिसके परिणामस्वरूप मछली के शरीर की पारदर्शी उपस्थिति हुई। लाल रंग में ज़ेब्राफिश में खनिज हड्डियों को दागने और कल्पना करने के लिए एलिज़ारिन लाल धुंधला अभिकर्मक जोड़ा गया था।
इस प्रयोग में विश्वसनीय प्रयोगात्मक निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए छवि विश्लेषण महत्वपूर्ण है। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अच्छी मुद्रा और स्वच्छ पृष्ठभूमि के साथ ज़ेबराफिश की तस्वीरों का चयन किया गया था। जब हम एक ही छवि के लिए दाग वाले क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करते हैं, तो एक मछली के लाल रंग में सना हुआ सभी खनिज हड्डियों की गणना की जाएगी। इस प्रकार, हम लीड-उजागर और नियंत्रण समूहों के बीच हड्डी द्रव्यमान परिवर्तनों की तुलना कर सकते हैं। इस अध्ययन में, पीबीएसी एक्सपोजर ने ज़ेब्राफिश में विकासात्मक विषाक्तता का कारण बना, और 9 डीपीएफ पर 10 और 20 मिलीग्राम / एल पीबीएसी-एक्सपोज़र समूहों में खनिज हड्डी के दाग वाले क्षेत्र में महत्वपूर्ण कमी देखी गई। इस प्रकार, पीबीएसी के शुरुआती भ्रूण के संपर्क में आने से ज़ेब्राफिश लार्वा की हड्डी का द्रव्यमान कम हो गया। चित्र 1 जेब्राफिश लार्वा में एलिज़रिन लाल धुंधलापन द्वारा कल्पना की गई पीबीएसी-प्रेरित हड्डी के नुकसान को दर्शाता है।
कैल्सीफाइड मैट्रिक्स से जुड़ने वाले रंगों का उपयोग पूरे कंकाल को लेबल करने के लिए किया जाता है। कैल्सीन एक फ्लोरोसेंट क्रोमोफोर है जो विशेष रूप से जीवित ऊतक में कैल्शियम से भी जुड़ सकता है और इसका उपयोग हड्डी संरचनाओं को लेबल करने और हड्डी के विकास का अध्ययन करनेके लिए किया जाता है। कैल्सीन के विपरीत, निश्चित ऊतक का एलिज़ारिन लाल धुंधलापन कंकाल परिवर्तनों का एक स्थायी रिकॉर्ड उत्पन्न करता है जो कई नमूनों की तुलना की सुविधा प्रदान कर सकता है। माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) 2 डी एक्स-रे की एक श्रृंखला प्राप्त करके खनिज ऊतक का सटीक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान कर सकता है। हालांकि, ज़ेबराफ़िश के छोटे आकार और विकासशील ज़ेबराफ़िश कंकाल की कई हड्डियों के पतले होने के कारण, माइक्रो सीटी विश्लेषण उपकरण इन हड्डियोंको सटीक रूप से चिह्नित नहीं कर सकते हैं।
फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनें वास्तविक समय में जीवित लार्वा या इससे भी अधिक परिपक्व मछली में कंकाल के विकास की कल्पना करने में मदद करतीहैं। इसी तरह, विवो स्टेनिंग में एलिज़ारिन रेड एस जीवित मछली के मूल्यांकन और विकृतियों की निरंतर ट्रैकिंग की अनुमतिदेता है। इस प्रकार, ज़ेबराफिश लार्वा में हड्डी के नुकसान का विश्लेषण करने के लिए एलिज़ारिन लाल धुंधलापन एक उपयोगी और लागत प्रभावी तरीका है। हालांकि, प्रयोगात्मक चरणों की जटिलता और उपयोग किए गए समाधानों की संख्या के कारण, एलिज़ारिन लाल दाग वाली छवियों के विश्लेषण के अंतिम परिणाम प्रयोगात्मक ऑपरेशन से प्रभावित हो सकते हैं। इसके अलावा, शरीर की मात्रा और नरम ऊतकों में वृद्धि के कारण वयस्क ज़ेबराफिश के लिए इस धुंधला विधि का उपयोग करना मुश्किल है; माइक्रो सीटी विश्लेषण या ट्रांसजेनिक लाइनें वयस्क ज़ेबराफिश के कंकाल इमेजिंग के लिए एक बेहतर विकल्प होगा। सारांश में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग रासायनिक विषाक्त जोखिम के बाद ज़ेब्राफिश लार्वा में हड्डी खनिज में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रक्रिया हड्डी की बीमारी का अध्ययन करने और नई चिकित्सीय दवाओं को विकसित करने के लिए एक ज़ेब्राफिश मॉडल स्थापित करने के लिए उपयोगी हो सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81872646; 81811540034; 81573173) और जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों (पीएपीडी) के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
