Summary
Aquí, hemos utilizado la tinción de rojo alizarina para mostrar que la exposición al acetato de plomo causa un cambio de masa ósea en las larvas de pez cebra. Este método de tinción se puede adaptar a la investigación de la pérdida ósea en larvas de pez cebra inducida por otros tóxicos peligrosos.
Abstract
La pérdida ósea inducida químicamente debido a la exposición al plomo (Pb) podría desencadenar una serie de impactos adversos en los sistemas esqueléticos humanos y animales. Sin embargo, los efectos y mecanismos específicos en el pez cebra siguen sin estar claros. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio y puede ayudar a visualizar el hueso e ilustrar la masa mineral esquelética. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar la pérdida ósea inducida por acetato de plomo (PbAc) en larvas de pez cebra mediante el uso de tinción de rojo de alizarina. Los embriones de pez cebra fueron tratados con una serie de concentraciones de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 y 120 h después de la fecundación. La tinción esquelética de montaje completo se realizó en larvas a los 9 días posteriores a la fertilización, y el área total teñida se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los resultados indicaron que los tejidos mineralizados se tiñeron de rojo, y el área teñida disminuyó significativamente en el grupo de exposición a PbAc, con un cambio dependiente de la dosis en la mineralización ósea. Este artículo presenta un protocolo de tinción para investigar los cambios esqueléticos en los defectos óseos inducidos por PbAc. El método también se puede utilizar en larvas de pez cebra para la detección de la pérdida ósea inducida por otros productos químicos.
Introduction
Estudios recientes han confirmado que la osteoporosis debida a glucocorticoides, inhibidores de la aromatasa y consumo excesivo de alcohol es común 1,2. El plomo (Pb) es un metal tóxico que se encuentra en las plantas, el suelo y los ambientes acuáticos3. Aunque los efectos adversos de Pb en el cuerpo humano han atraído mucha atención, su impacto irreversible en el hueso necesita ser investigado más a fondo. La intoxicación por plomo causa una amplia gama de cambios patológicos tanto en el esqueleto en desarrollo como en el adulto, que afectan las actividades normales de la vida. Los estudios han encontrado una asociación entre la exposición crónica a Pb y el daño óseo4, incluyendo estructuras óseas deterioradas5,6, densidad mineral ósea reducida e incluso mayor riesgo de osteoporosis7.
El tejido mineralizado es de gran importancia para la resistencia ósea8, y la deposición de la matriz de mineralización ósea es un índice crítico de la formación ósea9. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio, y la tinción con rojo de alizarina es un procedimiento estándar para evaluar la formación ósea10. De acuerdo con este método, el tejido mineralizado se tiñe de rojo, mientras que todo el resto del tejido permanece transparente. El área teñida se cuantifica mediante análisis de imagen digital11.
El pez cebra es un organismo modelo importante ampliamente utilizado en el descubrimiento de fármacos y modelos de enfermedades. Estudios genéticos en peces cebra y humanos han demostrado similitudes en los mecanismos subyacentes de la morfogénesis esquelética a nivel molecular12. Además, el cribado de fármacos o biomoléculas de alto rendimiento es más factible en grandes nidadas de pez cebra que en modelos murinos, facilitando el estudio mecanicista de moléculas proosteogénicas u osteotóxicas13. La tinción diferencial del esqueleto in toto10 se utiliza con frecuencia en el estudio de la displasia esquelética en pequeños vertebrados y fetos de mamíferos. La tinción de rojo de alizarina se realizó para investigar la toxicidad del desarrollo óseo de los productos químicos en larvas de pez cebra. Aquí, utilizamos el plomo como ejemplo para describir un protocolo para detectar defectos óseos inducidos por acetato de plomo en larvas de pez cebra.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por el Instituto de Cuidado de Animales del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.
1. Cría de peces y recolección de embriones 14
- Alimente a los peces tres veces al día; Asegúrese de que el pez cebra se mantenga a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h.
- Separe los peces adultos machos y hembras mediante tablas de aislamiento en tanques de desove en una proporción de macho a hembra de 2: 1 por la noche.
- A la mañana siguiente, retire las tablas de aislamiento a las 9:00 AM y recoja los embriones 2 h más tarde.
- Colocar los embriones en una incubadora bioquímica mantenida a 28,5 °C antes del experimento.
2. Exposición química
- Preparar el caldo madre: pesar el acetato de plomo trihidratado (5 g) y disolverlo en agua ultrapura (50 mL) con agitación.
PRECAUCIÓN: PbAc es tóxico. Use máscaras contra el polvo adecuadas, ropa protectora y guantes. Realice el experimento bajo una campana extractora. - Seleccione y distribuya aleatoriamente los embriones de pez cebra en placas limpias de 6 pocillos (30 embriones por pocillo en 3 ml de agua de cría de pez cebra; consulte la Tabla 1 para su composición). Tratar los embriones con PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) de 2 a 120 h después de la fecundación (HPF).
NOTA: Las concentraciones de PbAc se eligieron de acuerdo con los experimentos de determinación del rango de dosis. Los resultados mostraron que la CL50 del acetato de plomo en embriones de pez cebra fue de 41,044 mg/L a 120 hpf. Por lo tanto, la concentración más alta se estableció en la mitad de la LC50 y una serie de soluciones preparadas por dilución 2 veces. - Alimente a las larvas dos veces al día a partir de 5 días después de la fertilización (dpf). Mantener los embriones de pez cebra a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14:10 h.
- Refresque el medio libre de Pb (agua de cría del pez cebra) cada 24 h hasta 9 dpf.
NOTA: Al finalizar los experimentos, todas las soluciones que contienen plomo se vertieron en un tanque de líquido designado y fueron tratadas por el centro de gestión de experimentos.
3. Tinción de rojo alizarina
NOTA: Use máscaras contra el polvo adecuadas, ropa protectora y guantes durante todo el proceso de tinción. Las composiciones de todas las soluciones se muestran en la Tabla 1.
- Pasos específicos de tinción
NOTA: El proceso de teñido se llevó a cabo en una placa de 24 pocillos a temperatura ambiente. Después de agregar cada solución, coloque la placa de 24 pocillos en la mesa de agitación a baja velocidad.- Retire 10 larvas de pez cebra al azar de cada grupo a 9 dpf y fije el pescado en 1 ml de paraformaldehído al 2% / solución salina tamponada con fosfato al 2 h.
- Decantar la solución y lavar las larvas de pez cebra con 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM de MgCl2 durante 10 min.
- Decantar la solución e incubar las larvas en las siguientes soluciones durante 5 min cada una para la detinción: solución de etanol anhidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5) y 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7.5).
- Decantar la solución, eliminar el pigmento blanqueando con una solución que consiste en 3% deH2O2y 0,5% de KOH, y observar una vez cada 10 min hasta que el pigmento se elimine por completo.
- Enjuague las larvas de pez cebra varias veces con 25% de glicerina / 0.1% de KOH durante 10 minutos cada una hasta que no haya burbujas.
NOTA: Es importante evitar las burbujas; De lo contrario, las burbujas en el cuerpo del pez cebra aparecerán como un campo de visión negro bajo el microscopio, lo que afectará las observaciones y el análisis cuantitativo. - Manchar las larvas remojando en 1 ml de alizarina al 0,01% durante 50 min.
- Decantar la solución y añadir 1 ml de glicerina al 50% / KOH al 0,1% durante 10 minutos para limpiar el fondo. Almacene los peces en 50% de glicerina fresca / 0.1% KOH para su posterior observación.
4. Adquisición de imágenes
- Transfiera una larva al portaobjetos de vidrio cada vez, manteniendo la larva en el medio de la gota de líquido.
- Observe las larvas bajo un microscopio estéreo.
- Encienda la cámara, abra el software (consulte la Tabla de materiales) y mantenga la configuración predeterminada.
- Haga clic en AE y elija un tiempo de exposición adecuado (60 ms en este experimento) para obtener la mejor imagen.
- Capture todas las imágenes con la misma configuración. Guarde las imágenes en .tif formato para su posterior análisis.
5. Análisis de imágenes
Nota : consulte el archivo suplementario para obtener un ejemplo con un conjunto de gráficos de ejemplo para el análisis de imágenes.
- Haga doble clic en el icono ImageJ y analice las imágenes guardadas en el paso 4.5.
- Haga clic en Archivo | Abrir para abrir las imágenes guardadas en el paso 4.5.
- Haga clic en la imagen | Tipo, seleccione 8 bits.
- Haga clic en Editar | Invertir.
- Haga clic en Analizar | Calibrar, seleccione OD sin calibrar en la interfaz emergente, marque Calibración global en la parte inferior izquierda de la interfaz inferior y haga clic en Aceptar.
- Haga clic en Analizar | Establecer escala | Haga clic para Eliminar escala en la interfaz emergente, marque Global a continuación y haga clic en Aceptar.
- Haga clic en Analizar | Establezca Medidas, seleccione el área del elemento en la interfaz emergente, marque el umbral Limitar al umbral a continuación (para medir solo el rango seleccionado) y haga clic en Aceptar.
- Haga clic en la imagen | Ajustar| Umbral, deslice el control deslizante en el centro de la interfaz emergente para seleccionar el umbral apropiado (cambie el umbral para cada imagen) para que se seleccionen todos los objetivos que se probarán en una imagen y haga clic en Establecer.
- Haga clic en Analizar | Medir. Registre las fechas de cada grupo.
- Utilice ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para analizar las diferencias y establezca el nivel de significación en p < 0.001 (***).
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Representative Results
La tinción de rojo alizarina es un método sensible y específico para medir los cambios en la mineralización ósea en larvas de pez cebra. En este estudio, hemos observado que PbAc tuvo efectos adversos sobre las larvas de pez cebra, incluyendo muerte, malformación, disminución de la frecuencia cardíaca y acortamiento de la longitud corporal. Además, se evaluaron las áreas de esqueleto mineral de las larvas de pez cebra para examinar la pérdida ósea inducida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A), muchos huesos del esqueleto de la cabeza están mineralizados y, por lo tanto, teñidos de rojo, como el paraesfenoides (PS), el opérculo (OP), el ceratobranquial (CB) y la notocorda (NC). En contraste, los otolitos (OT) (estructuras no óseas) aparecen de color marrón-negro en lugar de rojo. Se realizó un análisis digital para cuantificar el área total teñida en cada imagen. En comparación con el grupo control, los grupos de acetato de plomo tratados con 10 y 20 mg/L de PbAc mostraron una disminución significativa (p < 0,001) en el área teñida (Figura 1B). Los cambios en la mineralización ósea mostraron dependencia de la dosis.
Figura 1: Efectos de diferentes concentraciones de PbAc en larvas de cráneo de pez cebra . (A) Imágenes de la cara dorsal del hueso de la cabeza teñido con rojo alizarina en larvas a 9 dpf. El tejido mineralizado se tiñe de rojo. Barras de escala = 0,5 mm. (B) Cambios en el área mineralizada relativa a 9 dpf; 10 larvas por grupo. Los datos se expresan como media ± SEM. Se realizaron tres réplicas. p < 0,001 ***. Abreviaturas: PS = paraesfenoides; OP = opérculo; OT = otolito; CB = ceratobranquial; NC = notocorda; DPF = días después de la fertilización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Composición | |
| Agua de cría del pez cebra | pH 7-7.3, 27-29 °C, conductividad 450-550 μs, salinidad 0.25-0.75 %0, oxígeno disuelto >6 mg/L, fotoperiodo 14/10 h, dureza 100-200 mg/L, cloro 0 mg/L, concentración de nitrógeno amoniacal <0.02 mg/L, nitrito <1 mg/L, nitrato <50 mg/L, dióxido de carbono <50 mg/L | |
| Solución mixta (50 mL) de paraformaldehído al 2% y 1x PBS | 25 mL de paraformaldehído al 4%, 5 mL de tampón PBS 10x y agua destilada doble (ddH2O) c.s.p. a 50 mL | |
| Solución mixta (50 mL) de 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y 10 mM de MgCl2 | 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH=7,5), 0,5 mL de 1 M MgCl 2 y ddH2 O c.s.p. a 50 mL | |
| Solución mixta (50 mL) de etanol anhidro al 80%, 10 mM de MgCl2 y 100 mM de Tris-HCl (pH=7,5) | 42,1 mL de etanol anhidro al 95%, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH=7,5), 0,5 mL de 1 M MgCl2 yddH2O c.s.p. a 50 mL | |
| Solución mixta (50 mL) de etanol anhidro al 50% y Tris-HCl al 100 mM (pH=7,5) | 26,3 mL de etanol anhidro al 95%, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH=7,5) y ddH2O c.s.p. a 50 mL | |
| Solución mixta (50 mL) de etanol anhidro al 25% y Tris-HCl al 100 mM (pH=7,5) | 13,2 mL de etanol anhidro al 95%, 5 mL de Tris-HCl 1 M (pH=7,5), y ddH2O c.s.p. a 50 mL | |
| Solución mixta de solución de 3% deH2O2y solución de KOH al 0,5% | Cantidades iguales de 6% H 2 O2y 1% KOH mezclado antes de su uso | |
| Solución mixta (50 mL) de glicerina al 25% y KOH al 0,1% | 12.5 mL de glicerina al 100%, 0.25 mL de KOH al 20% y ddH2O c.s.p. a 50 mL | |
| 0.01% Alizarina (50 mL) | 1 ml de alizarina al 0,5%, 12,5 ml de glicerina al 100%, 5 ml de Tris-HCl al 1 M (pH=7,5) y ddH2O c.s.p. a 50 ml | |
| Solución mixta (50 mL) de glicerina al 50% y KOH al 0,1% | 25 mL de glicerina al 100%, 0,25 mL de KOH al 20% y ddH2O c.s.p. a 50 mL | |
Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas en el protocolo de tinción de rojo de alizarina. Abreviatura: q.s. = cuántico suficiente (según sea necesario).
Archivo complementario: un conjunto de gráficos de muestra para el análisis de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El pez cebra es un modelo adecuado para estudiar la enfermedad metabólica ósea. En comparación con los modelos de roedores, los modelos de pez cebra son relativamente rápidos de establecer, y la medición de la gravedad de la enfermedad es más fácil. En larvas de pez cebra de tipo salvaje, la mineralización del esqueleto de la cabeza ocurre a 5 dpf y el esqueleto axial a 7 dpf15. Por lo tanto, los huesos craneales como PS, OP, CB y NC están bien desarrollados a 9 dpf. Después de que las larvas se decoloraron y blanquearon por completo, los tejidos blandos se limpiaron, lo que resultó en una apariencia transparente del cuerpo del pez. El reactivo de tinción rojo alizarina se agregó para teñir y visualizar los huesos minerales en el pez cebra en rojo.
El análisis de imágenes es fundamental para obtener conclusiones experimentales fiables en este experimento. Se seleccionaron fotografías de pez cebra con buena postura y fondo limpio para el análisis cuantitativo. Cuando cuantificamos el área teñida para una sola imagen, se calcularán todos los huesos mineralizados teñidos de rojo de un pez. Por lo tanto, podemos comparar los cambios de masa ósea entre los grupos expuestos al plomo y los grupos de control. En este estudio, la exposición a PbAc causó toxicidad para el desarrollo en el pez cebra, y se observó una reducción significativa en el área teñida del hueso mineral en los grupos de exposición a 10 y 20 mg / L de PbAc a 9 dpf. Por lo tanto, la exposición embrionaria temprana a PbAc redujo la masa ósea de las larvas de pez cebra. La Figura 1 muestra la pérdida ósea inducida por PbAc visualizada por la tinción de rojo alizarina en las larvas de pez cebra.
Los tintes que se unen a la matriz calcificada se utilizan para etiquetar todo el esqueleto. La calceína es un cromóforo fluorescente que también puede unirse específicamente al calcio en el tejido vivo y se ha utilizado para etiquetar estructuras óseas y estudiar el crecimiento óseo10. A diferencia de la calceína, la tinción de rojo alizarina del tejido fijo genera un registro permanente de cambios esqueléticos que pueden facilitar las comparaciones de varias muestras. La tomografía microcomputarizada (Micro CT) puede proporcionar un análisis cuantitativo preciso del tejido mineralizado mediante la adquisición de una serie de radiografías 2D. Sin embargo, debido al pequeño tamaño del pez cebra y a que muchos de los huesos del esqueleto del pez cebra en desarrollo son delgados, las herramientas de análisis de Micro CT no pueden caracterizar con precisión estos huesos16.
Las líneas reporteras transgénicas fluorescentes también ayudan a visualizar el desarrollo esquelético en larvas vivas o incluso peces más maduros en tiempo real17. Del mismo modo, la tinción in vivo de rojo de alizarina S permite la evaluación de peces vivos y el seguimiento continuo de malformaciones18. Por lo tanto, la tinción de rojo de alizarina es una forma útil y rentable de analizar la pérdida ósea en larvas de pez cebra. Sin embargo, debido a la complejidad de los pasos experimentales y el número de soluciones utilizadas, los resultados finales del análisis de imágenes teñidas de rojo alizarina pueden verse afectados por la operación experimental. Además, es difícil utilizar este método de tinción para el pez cebra adulto debido al aumento del volumen corporal y los tejidos blandos; El análisis de micro TC o las líneas transgénicas serían una mejor opción para obtener imágenes esqueléticas del pez cebra adulto. En resumen, el protocolo presentado aquí se puede utilizar para estudiar los cambios en la mineralización ósea en larvas de pez cebra después de la exposición a sustancias químicas tóxicas. Este procedimiento podría ser útil para establecer un modelo de pez cebra para estudiar la enfermedad ósea y desarrollar nuevos fármacos terapéuticos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81872646; 81811540034; 81573173) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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