Methodenartikel

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

DOI:

10.3791/63260

⸱

28. Dezember 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Drosophila-Phototransduktion ist einer der schnellsten bekannten G-Protein-gekoppelten Signalwege. Um die Spezifität und Effizienz dieser Kaskade zu gewährleisten, bindet der Calcium (Ca2+)-permeable Kationenkanal, das transiente Rezeptorpotential (TRP), fest an das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) und bildet einen großen Signalproteinkomplex mit augenspezifischer Proteinkinase C (ePKC) und Phospholipase Cβ/No Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA). Die biochemischen Eigenschaften des Drosophila TRP-Kanals bleiben jedoch unklar. Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen TRP-Kanal zu reinigen. Zuerst wurde das gereinigte Histidin (His)-markierte NORPA 863-1095-Fragment an Ni-Perlen gebunden und als Köder verwendet, um den endogenen INAD-Proteinkomplex aus Drosophila-Kopfhomogenaten abzuziehen. Dann wurde den Ni-Perlen ein übermäßig gereinigtes Glutathion-S-Transferase (GST)-markiertes TRP 1261-1275-Fragment hinzugefügt, um mit dem TRP-Kanal zu konkurrieren. Schließlich wurde der TRP-Kanal im Überstand durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen TRP 1261-1275-Peptid getrennt. Diese Methode ermöglicht es, den Gating-Mechanismus des Drosophila TRP-Kanals sowohl aus biochemischer als auch aus struktureller Sicht zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten Drosophila TRP-Kanälen können auch in Zukunft gemessen werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phototransduktion ist ein Prozess, bei dem absorbierte Photonen in elektrische Codes von Neuronen umgewandelt werden. Es leitet ausschließlich Opsine und die folgende G-Protein-gekoppelte Signalkaskade sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen weiter. In Drosophila organisiert das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) unter Verwendung seiner fünf PDZ-Domänen einen supramolekularen Signalkomplex, der aus einem transienten Rezeptorpotential (TRP)-Kanal, Phospholipase Cβ/No-Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA) und einer augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC)1 besteht. Die Bildung dieses supramolekularen Signalkomplexes garantiert die korrekte subzelluläre Lokalisation, hohe Effizienz und Spezifität der Drosophila-Phototransduktionsmaschinerie. In diesem komplexen Komplex wirken lichtempfindliche TRP-Kanäle als nachgeschaltete Effektoren von NORPA und vermitteln den Kalziumeinstrom und die Depolarisation von Photorezeptoren. Frühere Studien zeigten, dass die Öffnung des Drosophila TRP-Kanals durch Protonen, Störung der lokalen Lipidumgebung oder mechanische Kraft 2,3,4 vermittelt wird. Der Drosophila TRP-Kanal interagiert auch mit Calmodulin5 und wird durch Calcium sowohl durch positive als auch durch negative Rückkopplung 6,7,8 moduliert.

Bisher basierten elektrophysiologische Studien über den Gating-Mechanismus von Drosophila TRP und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanälen auf ausgeschnittenen Membranpflastern, Ganzzellaufzeichnungen von dissoziierten Wildtyp-Drosophila-Photorezeptoren und heteroexprimierten Kanälen in S2-, SF9- oder HEK-Zellen 2,9,10,11,12,13, aber nicht auf gereinigten Kanälen. Die Strukturinformationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge bleiben ebenfalls unklar. Um die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigtem Protein in einer rekonstituierten Membranumgebung zu untersuchen und strukturelle Informationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge zu gewinnen, ist die Gewinnung gereinigter TRP-Kanäle in voller Länge der notwendige erste Schritt, ähnlich den Methoden, die in den TRP-Kanalstudien von Säugetieren verwendet werden 14,15,16,17.

Kürzlich wurde auf der Grundlage des Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes18,19,20 erstmals eine Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den TRP-Kanal von Drosophila-Kopfhomogenaten durch Streptavidin-Perlen5 zu reinigen. In Anbetracht der geringen Kapazität und der teuren Kosten von Streptavidin-Perlen wird hier ein verbessertes Reinigungsprotokoll eingeführt, das His-getaggtes Köderprotein und entsprechende kostengünstige Ni-Perlen mit viel höherer Kapazität verwendet. Die vorgeschlagene Methode wird dazu beitragen, den Gating-Mechanismus des TRP-Kanals aus strukturellen Winkeln zu untersuchen und die elektrophysiologischen Eigenschaften des TRP-Kanals mit gereinigten Proteinen zu messen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Reinigung von GST-markierten TRP- und His-markierten NORPA-Fragmenten

  1. Reinigen Sie das TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Tag
    1. Wandeln Sie das pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 Plasmid 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) Zellen mit der CaCl2 Hitzeschock-Transformationsmethode21 um. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Dann verstärken Sie die 10 ml Aussaatkultur in 1 L LB-Medium bei 37 ° C.
    2. Nachdem die optische Dichte (OD600) der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 °C ab und fügen Sie 0,1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; Endkonzentration) hinzu, um die Überexpression des Zielproteins zu induzieren, und inkubieren Sie bei 16 °C für 18 h.
    3. Nach Überexpression 1 l kultivierte Zellen durch Zentrifugation bei 3.993 × g für 20 min pelletieren und in 40 ml phosphatgepuffertem Kochsalzlösung (PBS) Puffer resuspendieren.
    4. Laden Sie die resuspendierten Zellen in einen bei 4 °C vorgekühlten Hochdruckhomogenisator. Erhöhen Sie den Homogenisatordruck langsam auf 800 bar. Öffnen Sie den Einlasshahn und lassen Sie die resuspendierten Zellen kreisförmig durch ein Ventil mit sehr schmalen Schlitzen gehen.
      HINWEIS: Die Zellen werden durch die hohen Scherkräfte, die durch einen großen Druckabfall und Kavitation verursacht werden, homogenisiert.
    5. Laden Sie 5 ml Glutathionperlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie die Perlen insgesamt dreimal mit 50 ml PBS-Puffer.
    6. Zentrifugieren Sie das Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48.384 x g. Den Überstand des zentrifugierten Zelllysats (40 ml) zu den ausgleichenden Glutathionperlen in der Schwerkraftsäule geben und 30 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Glutathionperlen alle 10 Minuten aus.
    7. Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen. Verwerfen Sie den Durchflussbruch. Spülen Sie die restlichen Glutathionperlen zweimal mit 50 ml PBS-Puffer ab.
    8. Fügen Sie 15 ml Elutionspuffer zu den Glutathionperlen hinzu und inkubieren Sie für 30 min. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.
    9. Nach 30 min Inkubation eluieren Sie das GST-markierte TRP 1261-1275-Fragment in einem konischen 50-ml-Rohr und beladen Sie es in einer Größenausschlusssäule (Präparationsgrad), die mit 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) Puffer ausgeglichen wird.
    10. Halten Sie die Elutionsdurchflussrate der Größenausschlusssäule auf 3 ml/min. Sammeln Sie die eluierten Proteine mit einer Rate von 5 ml / Röhrchen.
    11. Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins in der Größenausschlussspalte, indem Sie die UV-Absorptionssignale bei 280 nm analysieren und durch SDS-PAGE-Gelanalyse überprüfen (Elektrophoreseparameter: 150 V für das Stapelgel; 200 V für das auflösende Gel). Färben Sie das Gel mit Coomassie blue R250.
    12. Konzentrieren Sie das gereinigte TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Kennzeichnung von der Größenausschlusssäule auf 1 ml mit einer 15 ml Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C zentrifugiert ist, in einer Kühlzentrifuge auf dem Schreibtisch.
    13. Bestimmen Sie die Konzentration des konzentrierten Proteins mit dem Bier-Lambert-Gesetz. Messen Sie die UV-Absorption des GST-markierten TRP 1261-1275-Fragments bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
    14. Erhalten Sie den Extinktionskoeffizienten bei 280 nm, indem Sie die Proteinsequenzen in das Protparam-Programm (https://web.expasy.org/protparam/) importieren. Typischerweise ergibt 1 L Kultur von GST-markiertem TRP 1261-1275 1 ml 600 μM Protein (6 x 10-7 mol). Die benötigten Materialien sind Tabelle 1 zu entnehmen.
  2. Reinigung des NORPA 863-1095 Fragments mit seinen Tags
    1. Wandeln Sie das pETM.3C NORPA 863-1095 Plasmid20 in E. coli BL21 (DE3) Zellen mit der CaCl2 Hitzeschock-Transformationsmethode21 um. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 ml LB-Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Dann verstärken Sie die 10 ml Aussaatkultur in 1 L LB-Medium bei 37 ° C.
    2. Nachdem der OD600 der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 °C ab und fügen Sie 0,1 mM IPTG (Endkonzentration) hinzu, um die Überexpression des Zielproteins zu induzieren, und inkubieren Sie bei 16 °C für 18 h.
    3. Nach der Überexpression pelletieren Sie 1 L kultivierte Zellen durch Zentrifugation bei 3.993 x g für 20 min und resuspendieren Sie in 40 ml Bindungspuffer. Als nächstes werden die resuspendierten Zellen in einem Hochdruckhomogenisator bei 4 °C gelyst, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben.
    4. Laden Sie 5 ml Ni-Perlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie sie dreimal mit 50 ml Bindungspuffer.
    5. Zentrifugieren Sie das Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48.384 x g. Fügen Sie den Überstand des zentrifugierten Zelllysats zu den gleichgestellten Ni-Beads in der Schwerkraftsäule hinzu und inkubieren Sie für 30 min bei 4 °C. Setzen Sie die Ni-Perlen alle 10 Minuten auf.
    6. Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen. Entsorgen Sie die Durchflussfraktion und waschen Sie die verbleibenden Ni-Perlen zweimal mit 50 ml Waschpuffer.
    7. 15 ml Elutionspuffer zu den Ni-Beads geben und 30 min inkubieren. Setzen Sie die Ni-Perlen alle 10 Minuten auf.
    8. Nach 30 Minuten Inkubation das eluierte His-markierte NORPA 863-1095-Fragment in einem konischen 50-ml-Rohr sammeln und in eine Größenausschlusssäule (Präparationsgrad) laden, die mit 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) ausgeglichen wird.
    9. Halten Sie die Elutionsdurchflussrate der Größenausschlusssäule auf 3 ml/min. Sammeln Sie das eluierte Protein mit einer Rate von 5 ml / Röhrchen.
    10. Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins in der Größenausschlussspalte, indem Sie die UV-Absorptionssignale bei 280 nm analysieren und durch SDS-PAGE-Gelanalyse überprüfen (Elektrophoreseparameter: 150 V für das Stapelgel; 200 V für das auflösende Gel). Färben Sie das Gel mit Coomassie blue R250.
    11. Konzentrieren Sie das gereinigte His-markierte NORPA 863-1095-Fragment aus der Größenausschlusssäule auf 1 ml mit einer 15-ml-Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C zentrifugiert ist, in einer gekühlten Tischzentrifuge.
    12. Bestimmen Sie die Konzentration des konzentrierten Proteins mit dem Bier-Lambert-Gesetz. Messen Sie die UV-Absorption des mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragments bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
    13. Erhalten Sie den Extinktionskoeffizienten bei 280 nm, indem Sie die Proteinsequenzen in das Protparam-Programm (https://web.expasy.org/protparam/) importieren. Typischerweise ergibt die 1-L-Kultur des His-markierten NORPA 863-1095-Fragments 1 ml 600 μM Protein (6 x 10-7 mol). Die benötigten Materialien sind Tabelle 2 zu entnehmen.

2. Vorbereitung von Drosophila-Köpfen

  1. Sammeln Sie erwachsene Fliegen in konischen 50-ml-Zentrifugationsröhrchen mit der CO 2-Anästhesiemethode22,23; sofort in flüssigem Stickstoff für 10 min einfrieren und in einem -80°C Gefrierschrank lagern.
  2. Nachdem Sie eine ausreichende Anzahl von Fliegen gesammelt haben, schütteln Sie die gefrorenen 50 ml konischen Schläuche von Hand kräftig, um die Beine, Köpfe, Flügel und Körper der Fliegen zu trennen. Die Mischung auf drei nacheinander gestapelte vorgekühlte Edelstahlsiebe (jeweils 20/30/40 Maschen) geben und die Siebe schütteln.
  3. Da die Köpfe das 40-Mesh-Sieb nicht passieren können, streichen Sie die Fliegenköpfe mit einer Bürste vom 40-Mesh-Sieb, übertragen Sie sie in konische 50-ml-Rohre und lagern Sie sie bei -80 ° C.
  4. Sammeln Sie die Fliegen und ihre Köpfe kontinuierlich ein und lagern Sie sie in einem -80 ° C Gefrierschrank, bis sie die erforderliche Menge für das Experimentieren (0,5 g) erreichen. Um 0,5 g Köpfe zu sammeln, werden typischerweise 35 ml Fliegen in einem 50 ml konischen Schlauch benötigt. Die benötigten Materialien sind Tabelle 3 zu entnehmen.

3. Drosophila TRP-Kanalreinigung

  1. Insgesamt 0,5 g Köpfe wiegen und mit einem vorgekühlten Mörserstößel vollständig in flüssigem Stickstoff homogenisieren. Die homogenisierten Köpfe werden in einem 10x V/W-Lysepuffer (5 ml) aufgelöst, in einem Shaker bei 4 °C für 20 min inkubiert und dann bei 20.817 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
  2. Sammeln Sie den Spin-down-Überstand ("20817 g S", Abbildung 4) und zentrifugieren Sie ihn bei 100.000 x g für 60 min bei 4 °C. Verwenden Sie den Spin-down-Überstand ("100.000 g S", Abbildung 4) für den folgenden Pulldown-Assay.
  3. Geben Sie 1 ml Ni-Perlen in die Schwerkraftsäule und waschen Sie die Perlen mit 10 ml doppelt destilliertem H 2 O (ddH2O) bei 4 ° Cfür insgesamt drei Mal. Die Perlen mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer dreimal bei 4 °C ausgleichen.
  4. 500 μL 600 μM gereinigtes His-markiertes NORPA 863-1095 Protein (3 x 10-7 mol) in die Ni-Säule geben und 30 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.
  5. Öffnen Sie den Säulenauslasshahn, um die Perlen und den Durchflussanteil zu trennen. Nehmen Sie den Durchflussanteil für die SDS-PAGE-Analyse (NORPA F, Abbildung 4). In diesem Abschnitt werden die Köderproteine auf den Ni-Perlen immobilisiert.
  6. Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer (10 ml) bei 4 °C und bewahren Sie die Waschfraktion für die SDS-PAGE-Analyse auf (Wash 1, Abbildung 4A). Wiederholen Sie die obigen Schritte und bewahren Sie die Probe für die SDS-PAGE-Analyse auf (Wash 2, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die überschüssigen Köderproteine auf den Ni-Perlen entfernt.
  7. Fügen Sie den Überstand des Drosophila-Kopfhomogenats nach 100.000 x g Zentrifugation in die Ni-Säule bei 4 °C hinzu, wo das mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragment immobilisiert wurde.
  8. Den Überstand mit den Ni-Perlen bei 4 °C für 30 min inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf. Öffnen Sie dann den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen.
  9. Sammeln Sie den Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (Drokopflyse F, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die INAD-Proteinkomplexe (INAD/TRP/ePKC) in den Kopfhomogenaten von den immobilisierten NORPA 863-1095-Fragmenten auf den Ni-Perlen eingefangen.
  10. Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer (10 ml) bei 4 °C und halten Sie den Überstand aus Schwerkraftniederschlag für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 3, Abbildung 4A). Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 4, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die ungebundenen Proteine auf den Ni-Perlen entfernt.
  11. 500 μL 600 μM GST-markiertes TRP 1261-1275-Protein (3 x 10-7 mol) in die Ni-Perlen geben und 20 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.
  12. Sammeln Sie den eluierten Anteil aus der Schwerkraftsäule (TRP E1, Abbildung 4B), die den endogenen Drosophila TRP-Kanal enthält. Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Elutionsanteil (TRP E2, Abbildung 4B). In diesem Schritt werden unter Verwendung der GST-getaggten TRP 1261-1275-Fragmente als Konkurrenten die TRP-Kanäle aus den eingefangenen INAD-Proteinkomplexen (INAD/TRP/ePKC) auf den Ni-Perlen eluiert.
  13. Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Bindungspuffer (10 ml; Tabelle 1) bei 4 °C und sammeln Sie die Waschfraktion für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 5, Abbildung 4B).
  14. 500 μL Elutionspuffer (Tabelle 1) in die Ni-Beads geben und 20 min bei 4 °C inkubieren. Sammeln Sie den Elutionsanteil aus der Schwerkraftflusssäule (NORPA E1, Abbildung 4B). Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Elutionsanteil (NORPA E2, Abbildung 4B).
  15. Mit dem Elutionspuffer das mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragment zusammen mit den INAD/ePKC-Proteinkomplexen eluieren. Als nächstes suspendieren Sie die Ni-Beads in 500 μL Bindungspuffer.
  16. Nehmen Sie die resuspendierten Ni-Perlen, um die SDS-PAGE (gefärbt durch Coomassie blue R250) auszuführen, um die Effizienz der Elution zu analysieren und zu bewerten, ob der Elutionspuffer funktioniert (Perlen, Abbildung 4B). Die benötigten Materialien sind Tabelle 4 zu entnehmen.

4. Größenausschlusssäulenreinigung des Drosophila TRP-Kanals

  1. Installieren Sie eine Größenausschlusssäule (analytische Qualität) auf dem Proteinreinigungssystem. Ausgleich der Säule mit dem Säulenpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), der durch einen 0,45 μm Filter gefiltert wird.
  2. Konzentrieren Sie die TRP E1- und E2-Fraktion aus Schritt 3.14 mit einer 4-ml-Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert wird.
  3. Spülen Sie die Probenschleife mit dem Spaltenpuffer und laden Sie die Probe in die Probenschleife. Injizieren Sie die Probe in die Größenausschlusssäule und eluieren Sie die Proteine mit einer geeigneten Durchflussrate (0,5 ml/min).
  4. Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins durch Absorption bei 280 nm und lassen Sie ein SDS-PAGE-Gel laufen, um den gereinigten endogenen Drosophila-TRP-Kanal nachzuweisen (Abbildung 5). Die benötigten Materialien sind Tabelle 5 zu entnehmen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel wird eine Proteinreinigungsmethode zur Reinigung des endogenen Drosophila-TRP-Kanals demonstriert (Abbildung 1).

Zuerst werden rekombinante Proteinexpression und -reinigung angewendet, um die Köder- und Konkurrenzproteine zu erhalten. Dann wird ein GST-markiertes TRP 1261-1275-Fragment in E. coli BL21 (DE3)-Zellen in LB-Medium exprimiert und mit Glutathionkügelchen und einer Größenausschlusssäule gereinigt (...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INAD, das fünf PDZ-Domänen enthält, ist der Hauptorganisator der Drosophila-Fototransduktionsmaschinerie. Frühere Studien zeigten, dass INAD PDZ3 mit exquisiter Spezifität (KD = 0,3 μM) an den TRP-Kanal C-Terminal Tail bindet18. Das INAD PDZ45 Tandem interagiert mit NORPA 863-1095 Fragment mit extrem hoher Bindungsaffinität (KD = 30 nM). Diese Ergebnisse liefern eine solide biochemische Grundlage für die Entwicklung der Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie,...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) und der Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Nr. 2021A1515010796) an W. L. unterstützt. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für die sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bacterial stämme
BL21(DE3) Competent CellsNovagen69450Proteinüberexpression
Experimentmodelle
D.melanogaster: W1118 StammBloomington Drosophila Stock CenterBDSC:3605Drosophila head Vorbereitung
Material
20/30/40 mesh EdelstahlsiebeJiufeng Metallgitter FirmaGB/T6003.1Drosophila head Zubereitung
30% Acrylamid-N,N′-Methylenbisacrylamid (29:1)LableadA3291SDS-PAGE Gelvorbereitung
AmmoniumpersulfatInvitrogenHC2005SDS-PAGE Gelpräparation
Cocktail-ProteasehemmerRoche05892953001Proteasehemmer
Coomassie brilliant blue R-250Sangon BiotechA100472-0025SDS-PAGE Gelfärbung
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100Präparation
für GrößenausschlusssäulenpufferEthylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz (EDTA)Sangon BiotechA500838-0500Legierungspufferpräparat mit Größenausschluss
GlycinSangon BiotechA610235-0005SDS-PAGE Pufferpräparation
Glutathion-Sepharose 4 Fast Flow KügelchenCytiva17513202Affinitätschromatographie
ImidazolSangon BiotechA500529-0001Elutionspuffer Vorbereitung für Ni-Säule
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025Induktion der Proteinüberexpression
LB Bouillon PulverSangon BiotechA507002-0250E.coli. Zellkultur
L-Glutathion reduziert (GSH)Sigma-aldrichG4251-100GElutionspuffer Vorbereitung für Glutathionkügelchen
Ni-Sepharose excel beadsCytiva17371202Affinitätschromatographie
N-Dodecyl beta-D-maltosid (DDM)Sangon BiotechA610424-001Detergens für die Proteinreinigung
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE Gelpräparation
PBSSangon BiotechE607008-0500Homogenisierungspuffer für E.coli.-
Zellen PMSF LableadP0754-25GProteaseinhibitor
Vorgefärbter ProteinmarkerThermo Scientific26619/26616Leiter für vorgefärbte Proteinleiter
Größenausschlusssäule (Präparationsqualität)Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 PG-Säule
Größenausschlusssäule (analytische Qualität)Cytiva29091596Superose 6 Erhöhung 10/300 GL Säule
NatriumchloridSangon BiotechA501218-0001Puffervorbereitung für Proteinaufreinigung
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sangon BiotechA500228-0001SDS-PAGE Gel/Puffer Vorbereitung
Tris-BaseSigma-aldrichT1503-10KGVorbereitung für Proteinreinigungspuffer
Ultrafiltration Spin SäuleMilliporeUFC901096/801096Proteinkonzentration
Equipment
AnalysenwaageDENVERAPX-60Metage of Drosophila head
Tischgekühlte Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge für konische 15-ml- und 50-ml-ZentrifugationsröhrchenEppendorf5810RProteinkonzentration
Gekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge für den Schreibtisch 1,5 mL ZentrifugationsröhrchenEppendorf5417RZentrifugation von Drosophila Kopflysat nach der Homogenisierung
Leere Schwerkraft-Durchflusssäule (Innendurchmesser = 1,0 cm)Bio-Rad738-0015TRP-Proteinreinigung
Leere Schwerkraft-Durchflusssäule (Innendurchmesser = 2,5 cm)Bio-Rad738-0017Aufreinigung von Ködern und Konkurrenzproteinen aus E.coli.
Gel DokumentationssystemBio-RadUniversal Hood II Gel Doc XR SystemSDS-PAGE Imaging
Kühlzentrifuge HochgeschwindigkeitszentrifugeBeckman-ScharAvanti J-26 XPZentrifugation von E.coli. Zellen/Zelllysat
Hochdruck-HomogenisatorUNION-BIOTECHUH-05Homogenisierung von E.coli. Zellen
FlüssigstickstofftankTaylor-WhartonCX-100Drosophila head-Zubereitung
ProteinaufreinigungssystemCytivaAKTA-AuffrischerProteinaufreinigung
Kühlschrank (-80 Grad; C)Thermo900GPem>Drosophila Kopfpräparation
SpektralphotometerMAPADAUV-1200OD600 Messung von E.coli. Zellen
SpektralphotometerThermo ScientificNanoDrop 2000cBestimmung der Proteinkonzentration
UltrazentrifugeBeckman-ScharOptima XPN-100 UltrazentrifugeUltrazentrifugation
<

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075(2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191(2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Drosophila TRP Kan leReinigung von ProteinkomplexenAffinit tsreinigungGr enausschlusschromatographieNickel BeadsGlutathion BeadsINAD ProteinkomplexPhototransduktionswegCryo EM Techniken

Verwandte Artikel