Methodenartikel

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

DOI:

10.3791/63271

⸱

28. Dezember 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei Eukaryoten ist die Meiose essentiell für die Stabilität des Genoms und die genetische Vielfalt bei der sexuellen Fortpflanzung. Experimentelle Analysen von Spermatozyten in Hoden sind entscheidend für die Untersuchung der Spindelbildung und der Chromosomensegregation bei der männlichen meiotischen Teilung. Die Spermatozyten der Maus sind ein ideales Modell für mechanistische Untersuchungen der Meiose, jedoch fehlen die effektiven Methoden für die Analyse von Spermatozyten. In diesem Artikel wird eine praktikable und effiziente Methode zur in vivo Hemmung von Kinesin-7 CENP-E in Mausspermatozyten vorgestellt. Es wird ein detailliertes Verfahren zur Hodeninjektion eines spezifischen Inhibitors GSK923295 durch abdominale Operationen an 3 Wochen alten Mäusen vorgestellt. Darüber hinaus wird hier eine Reihe von Protokollen für die Gewebeentnahme und -fixierung, die Hämatoxylin-Eosin-Färbung, die Immunfluoreszenz, die Durchflusszytometrie und die Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. In dieser Arbeit stellen wir ein in vivo Inhibitionsmodell mittels Bauchchirurgie und Hodeninjektion vor, das eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der männlichen Meiose sein könnte. Wir zeigen auch, dass die CENP-E-Inhibition zu einer Chromosomenfehlstellung und einem Metaphasenarrest in primären Spermatozyten während der Meiose I führt. Unsere In-vivo-Inhibitionsmethode wird mechanistische Studien der Meiose erleichtern, als nützliche Methode für genetische Modifikationen der männlichen Keimbahnen dienen und ein Licht auf zukünftige klinische Anwendungen werfen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Meiose ist eines der wichtigsten, hochrigide, evolutionär konservierten Ereignisse in eukaryotischen Organismen und ist essentiell für die Gametogenese, die sexuelle Fortpflanzung, die Integrität des Genoms und die genetische Vielfalt 1,2,3. Bei Säugetieren durchlaufen die Keimzellen nach einer einzigen DNA-Replikationsrunde zwei aufeinanderfolgende Zellteilungen, Meiose I und II. Im Gegensatz zu den Schwesterchromatiden in der Mitose paaren sich duplizierte homologe Chromosomen und trennen sich während der Meiose in zwei Tochterzellen I 4,5. Bei der Meiose II ziehen sich die Schwesterchromatiden auseinander und trennen sich, um haploide Gameten ohne DNA-Replikation zu bilden6. Fehler in einer der beiden meiotischen Teilungen, einschließlich Defekte in der Spindelanordnung und Fehlsegregation der Chromosomen, können zum Verlust von Gameten, Sterilität oder Aneuploidie-Syndromen führen 7,8,9.

Zunehmende Studien haben gezeigt, dass die Motoren der Kinesinfamilie eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Chromosomenausrichtung und -trennung, der Spindelmontage, der Zytokinese und des Zellzyklusfortschritts sowohl in mitotischen als auch in meiotischen Zellen spielen10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Zentromerprotein E) ist ein Plus-End-gerichteter Kinetochor-Motor, der für die Chromosomenkongression, den Chromosomentransport und -ausrichtung sowie die Regulierung des Spindelmontage-Checkpoints in der Mitose 13,14,15,16,17,18 erforderlich ist. Während der Meiose führt die CENP-E-Hemmung durch den spezifischen Inhibitor GSK923295 zu Zellzyklusarrest, Chromosomenfehlausrichtung, Spindeldesorganisation und Genominstabilität in spermatogenen Zellen19. Die Lokalisationsmuster und die Dynamik von CENP-E an den Zentromeren sich teilender Spermatozyten deuten darauf hin, dass CENP-E mit Kinetochorproteinen für die sequentielle Assemblierung von Zentromeren während der Meiose interagiertI 20,21. In Eizellen ist CENP-E für die Chromosomenanpassung und den Abschluss der Meiose I13,22,23 erforderlich. Die Injektion von Antikörpern oder Morpholinos von CENP-E führt zu falsch ausgerichteten Chromosomen, abnormaler Kinetochororientierung und Meiose-I-Arrest sowohl in Maus- als auch in Drosophila-Oozyten 23. Verglichen mit der essentiellen Rolle von CENP-E in der Mitose sind die Funktionen und Mechanismen von CENP-E in der Meiose noch weitgehend unbekannt. Detaillierte Mechanismen von CENP-E bei der Chromosomenkonstitution und Genomstabilität in männlichen meiotischen Zellen müssen noch geklärt werden.

Die Spermatogenese ist ein komplexer und langwieriger physiologischer Prozess, der sequentielle Proliferation der Spermatogonien, Meiose und Spermiogenese umfasst. Daher ist es außerordentlich schwierig, den gesamten Prozess in vitro in Säugetieren und anderen Spezies zu reproduzieren24,25. In vitro ist es nicht möglich, eine Differenzierung der Spermatozyten nach dem Pachytenstadium zu induzieren. Studien zur männlichen meiotischen Unterteilung beschränkten sich im Allgemeinen auf experimentelle Analysen der frühen meiotischen Prophase25,26. Trotz vieler technologischer Bemühungen, einschließlich der Kurzzeitkultur von Spermatozyten27,28 und Organkulturmethoden25, gibt es nur wenige effektive Methoden, um die männliche meiotische Teilung zu untersuchen. Darüber hinaus führt die genetische Deletion essentieller Gene in der Regel zu Entwicklungsstillstand und embryonaler Letalität. Zum Beispiel können sich Mausembryonen, denen CENP-E fehlt, nicht einnisten und können sich nicht über die Implantation hinausentwickeln 29, was ein Hindernis für mechanistische Studien von CENP-E in der Meiose darstellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung eines praktikablen und praktikablen Systems zur Untersuchung der männlichen meiotischen Teilung das Forschungsfeld der Meiose erheblich voranbringen kann.

Der kleinzelldurchlässige Inhibitor ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Kinesinmotoren bei Zellteilungs- und Entwicklungsprozessen. Der allosterische Inhibitor GSK923295 bindet spezifisch an die motorische Domäne von CENP-E, blockiert die Freisetzung von ADP (Adenosindiphosphat) und stabilisiert schließlich die Wechselwirkungen zwischen CENP-E und Mikrotubuli30. In dieser Studie wird ein in vivo Inhibitions-Mausmodell durch Bauchchirurgie und Hodeninjektion von GSK923295 vorgestellt. Die Hemmung von CENP-E führt zu einer Fehlstellung der Chromosomen in der Metaphase I der primären Spermatozyten. Darüber hinaus führt die CENP-E-Hemmung zu einem meiotischen Arrest der Spermatozyten und zur Störung der Spermatogenese. Es wird eine Reihe von Protokollen für die Analyse von Spermatozyten beschrieben, die zur Beobachtung von meiotischen Spindelmikrotubuli, homologen Chromosomen und subzellulären Organellen in Spermatozyten angewendet werden können. Unsere In-vivo-Inhibitionsmethode ist eine effektive Methode zur Untersuchung der meiotischen Teilung und Spermatogenese.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Fujian Medical University geprüft und genehmigt (Protokollnummer SYXK 2016-0007). Alle Mausversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien der Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichungsnummer 8023, überarbeitet 1978) durchgeführt.

1. Konstruktion von GSK923295-vermittelten CENP-E-Inhibitionsmausmodellen

  1. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente bei 121 °C für 30 min. Bestrahlen Sie die chirurgische Ultra-Clean-Werkbank 2 h lang mit UV-C (UVC). Wiegen Sie die 3 Wochen alten männlichen ICR-Mäuse (Institute of Cancer Research), die für die Experimente verwendet wurden, und berechnen Sie die erforderliche Anästhesiedosis.
  2. Betäuben Sie Mäuse durch Verabreichung einer Kombination aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion. Überprüfen Sie die Narkosetiefe der Mäuse durch eine Kombination aus Maushornhautreflex, nozizeptivem Reflex, Atmung sowie Muskeltonus. Vergewissern Sie sich, dass die Mäuse tief betäubt sind.
    Anmerkungen: Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, um es während der Operation thermisch zu unterstützen.
  3. Binden Sie die Mausgliedmaßen zusammen und befestigen Sie sie auf der Wachsschale. Geben Sie einen Tropfen Tierarztsalbe auf die Mäuseaugen, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. Rasieren Sie die Bauchhaare der Maus vom Unterbauch bis zum Hodensack mit einem experimentellen Tierrasierer. Sichern Sie den Operationsbereich mit einem sterilen Tuch.
  4. Desinfizieren Sie den Bauchbauch mit einem Betadine-Peeling, gefolgt von dreimal 75 % Ethanol. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem sterilen Skalpell und machen Sie eine <5 mm große Öffnung.
  5. Klemmen Sie die Haut mit sterilen chirurgischen Klammern ab und ziehen Sie das Nebenhodenfettpolster mit einer sterilen Präparierzange ab, um die Hoden mit einer sterilen Pinzette zu lokalisieren. Fixieren Sie den Hoden mit einer sterilen Pinzette unter einem Stereoskop und injizieren Sie langsam 10 μl GSK923295 in einer Endkonzentration von 10 μM mit 10 μl rheodyne30 in Samenkanälchen. Für den Aufbau der Kontrollgruppe werden 10 μl 1%ige DMSO-Lösung (Dimethylsulfoxid)/PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) injiziert.
    Anmerkungen: Lagern Sie die GSK923295 Lösung in einer Konzentration von 10 mM bei -80 °C. Lösen Sie 0,1 μl 10 mM GSK923295 in 100 μl PBS-Lösung, um die 10 μM GSK923295 Lösung herzustellen.
  6. Schieben Sie den Hoden mit einer sterilen chirurgischen Zange sanft zurück in die Bauchhöhle. Peritoneum und Haut werden separat mit zwei bis vier Stichen mit der Nahtlinie mit einem Durchmesser von 0,1 mm vernäht.
  7. Beschriften Sie nach der Bauchoperation eine 3 x 3 mm große Stelle auf dem Rücken des Tieres mit einem Permanentmarker, setzen Sie die Maus zurück in den Futterkäfig und sorgen Sie für eine saubere und erregerfreie Umgebung mit ausreichend Futter und Wasser.
  8. Halten Sie die Umgebung durch die gefilterte Luft, die sterilisierten Lebensmittel und das Wasser in einem sterilen Zustand. Kümmere dich um das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu halten. Bei postoperativer Analgesie ist 3 Tage lang alle 12 Stunden eine Dosis Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zu verabreichen. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht wird, bis sie sich vollständig erholt hat.
    HINWEIS: Die Mäuse werden postoperativ versorgt und geben der Wunde bei Bedarf eine Lokalanästhesie mit 0,5 % Lidocain, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.

2. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Histopathologie

  1. Vier Tage nach der Bauchoperation werden die Mäuse mit CO 2 mit einer Durchflussrate von 2 l/min in einer CO2 -Kammer eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod durch Zervixluxation als bestätigende Methode der Euthanasie. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Hodensack zu öffnen und die Hoden mit einer Pinzette zu entfernen. Sammeln Sie Mäusehoden 4 Tage nach GSK923295 Injektion und fixieren Sie sie 12 h lang in 30 ml 10%iger Formaldehydlösung bei Raumtemperatur.
  2. Für die Gradientendehydratisierung wird die Probe nacheinander in 40 ml 70%igem Ethanol für 1 h, in 40 ml 85%igem Ethanol für 1 h, in 40 ml 95%igem Ethanol für 1 h und in 40 ml 100%igem Ethanol für 1 h inkubiert.
  3. Die Probe wird in 40 ml Xylol für 40 min und dann in 40 ml Paraffin für 1 h bei 65 °C inkubiert. Legen Sie die Taschentücher auf den Boden der Einbettbox. Das geschmolzene Paraffin in die Einbettbox geben. Kühlen Sie das Gewebe für eine vollständige Erstarrung bei 4 °C für 6 h ab.
  4. Fixieren Sie die Proben auf der Halterung des Ultramikrotoms, halten Sie den Winkel zwischen den Proben und der Messeroberfläche bei 5-10° und stellen Sie die Schichtdicke auf 5 μm ein. Die 5 μm dicken Schnitte werden mit einem Ultramikrotom präpariert, die Objektträger im Wasserbad bei 40 °C ausgebreitet und 12 h bei 37 °C in einem Objektträgertrockner getrocknet.
  5. Inkubieren Sie die Objektträger in 200 ml Xylol für 40 min, in 200 ml 100 % Ethanol für 6 min, in 200 ml 95 % Ethanol für 2 min, in 200 ml 90 % Ethanol für 2 min, in 200 ml 80 % Ethanol für 2 min und in 200 ml 70 % Ethanol für 2 min. beziehungsweise.
  6. Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in destilliertem Wasser ab und färben Sie sie 6 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der Mayer'schen Hämatoxylinlösung.
    HINWEIS: Mayer-Hämatoxylinlösung: 0,011 mol/l Hämatoxylin, 6,7 % wasserfreies Ethanol, 0,646 mol/l Aluminiumkaliumsulfat und 0,003 mol/l Natriumjodat.
  7. Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter fließendem Wasser ab und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang mit destilliertem Wasser.
  8. Inkubieren Sie die Objektträger 3 s lang in 1%igem Ethanolhydrochlorid und spülen Sie sie dann 2 Minuten lang unter fließendem Wasser ab.
  9. Färben Sie die Probe 15 s lang mit 1 % Eosin und inkubieren Sie sie dann 5 s lang mit 95 % Ethanol, 2 Minuten mit 100 % Ethanol und 40 Minuten lang mit Xylol.
  10. Versiegeln Sie die Objektträger mit 15 μl neutralem Gummi und dem 24 x 50 mm großen Deckglas.

3. Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie

  1. Sammeln Sie die 5 μm dicken Paraffinschnitte von Maushoden für Immunfluoreszenz. Inkubieren Sie die Objektträger 40 min lang in Xylol, 6 min in 100 % Ethanol, 2 min in 95 % Ethanol, 2 min in 90 % Ethanol, 2 min in 80 % Ethanol und 2 min in 70 % Ethanol. Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in destilliertem Wasser und spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit 0,01 M PBS ab.
  2. Legen Sie die Objektträger in die Antigen-Retrieval-Lösung (0,01 M Citratpuffer) und kochen Sie sie unter hohem Druck mit einem Schnellkochtopf für 4 Minuten zur Antigen-Entnahme. Kühlen Sie die Objektträger auf natürliche Weise auf Raumtemperatur ab. Zweimal 5 Minuten mit destilliertem Wasser und 5 Minuten mit PBS abspülen.
    HINWEIS: 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0): 2,1 mmol/L Zitronensäure, 11,6 mmol/L Trinatriumcitratdihydrat.
  3. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 500 μl 0,25 % TritonX-100/PBS inkubieren. Spülen Sie die Objektträger dreimal 5 Minuten lang mit PBS ab.
  4. Zur Antigenblockierung inkubieren Sie die Proben 1 h lang mit 300 μl 3 % Rinderserumalbumin (BSA)/PBST (0,1 % Tween-20 in PBS). Inkubieren Sie die Proben mit den Primärantikörpern in 3% BSA/PBST für 16 h bei 4 °C. Legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Box, um ein Austrocknen der Taschentücher zu verhindern. Erwärmen Sie die Objektträger 30 Minuten lang auf Raumtemperatur.
  5. Verwerfen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Objektträger dann dreimal 5 Minuten lang in PBST aus. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in 3 % BSA/PBST. Inkubieren Sie die Proben mit Sekundärantikörpern für 1-2 h bei 37 °C. Spülen Sie die Proben fünfmal 5 Minuten lang in PBST.
  6. Die Zellkerne werden mit 50 μL 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min bei Raumtemperatur gefärbt. Montieren Sie das Deckglas mit dem lichtbeständigen Montagemedium und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.
  7. Beobachten und zeichnen Sie Fluoreszenzsignale in den Objektträgern mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einem NA 40x/ 0,75 Objektiv ausgestattet ist.

4. Durchflusszytometrie

  1. Sammeln Sie Maushoden in 6 cm Petrischalen und schneiden Sie die Hoden mit einer chirurgischen Schere in 1 mm3 Stücke.
  2. Verdauen Sie die Hoden mit 1 ml 1%iger Kollagenase in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für 10 min bei 37 °C und zentrifugieren Sie dann die Proben 5 min lang bei 1.000 x g , um spermatogene Zellen auszufällen.
  3. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dann 1 ml 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure) für 20 min bei 37 °C hinzu und zentrifugieren Sie dann die Proben 5 min lang bei 1.000 x g .
  4. Verwerfen Sie den Überstand und inkubieren Sie dann die ausgefällten Zellen mit 1 ml 70%igem kaltem Ethanol für mehr als 8 h bei 4 °C.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei 1.000 x g und sammeln Sie dann Zellsedimente. Färben Sie die spermatogenen Zellen mit 500 μl Propidiumiodid (PI)-Färbelösung (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNase A und 0,2 % Triton X-100 in PBS) bei 37 °C für 30 min.
    Anmerkungen: Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen alle 5 Minuten vorsichtig, um Zellansammlungen zu vermeiden.
  6. Filtern Sie die Proben mit einem 300-Maschensieb, um Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen in einem Durchflussrohr und lagern Sie sie bei 4 °C.
  7. Detektion von Fluoreszenzsignalen und Lichtstreuung bei der Anregungswellenlänge von 488 nm mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie den DNA-Gehalt und die Lichtstreuung mit der Modfit MFLT32-Software.

5. Transmissionselektronenmikroskopie

  1. Schneiden Sie die Hoden mit dem scharfen Skalpell in 1 mm 3 Stücke und inkubieren Sie die Proben schnell mit3 %iger Glutaraldehyd-1,5%iger Paraformaldehydlösung in 0,1 M PBS (pH 7,2) für 4 h bei 4 °C, um Veränderungen der Ultrastruktur zu vermeiden. Spülen Sie die Proben dreimal 5 min lang mit 0,1 M PBS ab.
    Anmerkungen: Das Skalpell und die Schere sollten scharf sein und versuchen, künstliches Quetschen und Ziehen zu vermeiden. Die Bearbeitung der Proben sollte in der Fixierflüssigkeit erfolgen.
  2. Die Proben werden in 1%iger Osmsäure-1,5%iger Kaliumferrocyanidlösung bei 4 °C für 1,5 h fixiert. Trocknen Sie das Wasser mit Filterpapier ab und spülen Sie die Proben dreimal 5 min lang mit 0,1 M PBS ab.
  3. Die Proben werden in 40 ml 50%igem Ethanol für 10 min bei 4 °C dehydriert. Inkubieren Sie die Proben in 40 ml gesättigtem Uranacetatfarbstoff mit 70 % Ethanol bei 4 °C für 12 h, in 40 ml 90 % Ethanol für 10 min bei 4 °C, in 40 ml 90%igem Ethanol-Aceton für 10 min bei Raumtemperatur und in 40 ml wasserfreiem Aceton für 10 min dreimal bei Raumtemperatur.
  4. Inkubieren Sie die Proben 1,5 h lang in einem wasserfreien Aceton-Epoxidharz-618-Einbettungsmittelgemisch (v/v = 1:1) und betten Sie die Proben dann 3 h lang in Epoxidharz-618-Einbettungsmittel bei 35 °C ein.
  5. Für die Harzpolymerisation inkubieren die Proben in Epoxidharz 618-Einbettungsmitteln bei 35 °C für 12 h, bei 45 °C für 12 h und dann bei 60 °C für 24 h.
  6. Setzen Sie die Proben und das Glasmesser ein und passen Sie dann die Abstände zwischen den Proben und dem Messer an. Präparation der 90 nm dicken ultradünnen Schnitte mit einem ultradünnen Mikrotom. Schneiden Sie die Proben mit konstanter Geschwindigkeit in Scheiben und legen Sie die Objektträger dann auf ein Nickelgitter. Legen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur in eine Petrischale.
  7. Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit 2%igem Uranylacetat und dann die Proben 10 Minuten lang mit 2%igem Bleicitrat. Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Objektträger 24 Stunden lang bei Raumtemperatur.
  8. Beobachten Sie die Objektträger und nehmen Sie Elektronenbilder bei 70-100 kV mit einem Transmissionselektronenmikroskop auf.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es ist uns gelungen, ein in vivo CENP-E Inhibitionsmodell von Maushoden durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK92329519 zu konstruieren. Die wichtigsten technischen Schritte dieses Verfahrens sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach einer Hodeninjektion von GSK923295 für 4 Tage wurden die Hoden für weitere Analysen entnommen. In der Kontrollgruppe war die spermatogene Welle in den Samenkanälchen regelmäßig und organisiert (Abbi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie haben wir ein in vivo CENP-E Inhibitionsmodell von Maushoden unter Verwendung der abdominalen Chirurgie und der Mikroinjektion von GSK923295 etabliert. Die in dieser Studie verwendete Methode der Bauchchirurgie und Hodeninjektion hat die folgenden Vorteile. Erstens ist es nicht auf das Alter von Mäusen beschränkt. Experimentatoren können die Hodeninjektion in einem frühen Stadium durchführen, zum Beispiel bei 3 Wochen alten oder jüngeren Mäusen. Zweitens hat GSK923295 eine spezifische und hervor...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken allen Mitgliedern des Cytoskeleton Laboratory an der Fujian Medical University für die hilfreichen Gespräche. Wir danken Jun-Jin Lin vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir danken Ming-Xia Wu und Lin-Ying Zhou vom Electron Microscopy Lab des Public Technology Service Center der Fujian Medical University für die technische Unterstützung bei der Elektronenmikroskopie. Wir danken Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke und Jun Song vom Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences an der Fujian Medical University für ihre Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 82001608), Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Fujian, China (Fördernummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (Fördernummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (Fördernummer 2017XQ1001), Fujian Medical University High-Level Talents Anschubfinanzierungsprojekt für wissenschaftliche Forschung (Fördernummer XRCZX2017025) und Forschungsprojekt der Online-Ausbildung und des Unterrichts von Doktoranden der Chinesischen Medizin (Förderkennzeichen B-YXC20200202-06).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml SpritzeMehrere Handelsmarken erhältlichSteril.
1,5 mL ZentrifugenröhrchenAxygenMCT-150-C
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning430828
6 cm PetrischaleCorning430166
95% EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009164
Tubulin Kaninchen polyklonaler AntikörperBeyotimeAF0001Für Immunfluoreszenz-Assays. Bei 1:100 verwenden.
Kaninchen-Anti-Histon H3 (Phospho S10) monoklonaler AntikörperAbcamab267372Für Immunfluoreszenz-Assays. Bei 1:100 verwenden.
polyklonaler Anti-TUBA4A-Antikörper für KaninchenSangon BiotechD110022Für Immunfluoreszenz-Assays. Bei 1:100 verwenden.
Monoklonaler Anti-SYCP3-Kaninchen-AntikörperAbcamab175191Für Immunfluoreszenz-Assays. Bei 1:100 verwenden.
Adhäsionsmikroskop-ObjektträgerCITOTEST188105
Alexa Fluor 488-markierter Ziegen-Anti-Kaninchen-AntikörperBeyotimeA0423Sencodary-Antikörper. Bei 1:500 verwenden.
Aluminium-KaliumsulfatSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10001060
wasserfreies EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092690
Anti-Fade-EinbettmediumBeyotimeP0131Verhindern Sie das Photobleching von fluoreszierenden Signalen.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
RinderserumalbuminSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd69003435
ZentrifugeEppendorf5424BK745380
ChloralhydratSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd80037516
ZitronensäureShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
KollagenaseSangon BiotechA004194-0100
DeckgläserCITOTEST10212020C20 & mal 20 mm. Dicke 0,13-0,16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
FarbstoffwanneMehrere Handelsmarken erhältlich91347802
Eosin Y, alkohollöslichesSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009318
Formaldehyd - wässrige LösungSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hämatoxylin, wasserfreiesSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd71020784 ICR-Maus
Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J SoftwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Fluoreszierende Bildanalyse.
Leica UltramikrotomLeica
Leica EM UC-7 UltramikrotomLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseFür die Analyse von Durchflusszytometrie-Ergebnissen.
NagellackMehrere Handelsmarken verfügbar
NeutralgummiSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Nikon Ti-S2 MikroskopNikonTi-S2
PikrinsäureSinopharm Chemical Reagent Co., LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μ l Rheodyne
Geschnittenes ParaffinSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd69019461
NatriumjodatSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80117214
Chirurgische InstrumenteMehrere Handelsmarken für. Sterilisieren bei 121 °; C, 20 Min.
TransmissionselektronenmikroskopFEITecnai G2
Trinatriumcitrat-DihydratShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30188928In sterilem PBS verdünnen, um eine 0,25%ige Arbeitslösung herzustellen.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30189328In sterilem PBS verdünnen, um eine 0,1%ige Arbeitslösung herzustellen.
ParaformaldehydSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd80096618
XylolSinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd10023418
die Bauchchirurgie erhältlich

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25(2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417(2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6(2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636(2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453(2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431(2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961(2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

CENP E InhibitionMaus SpermatozytenAbdominale ChirurgieTestikul re InjektionImmunfluoreszenzf rbungChromosomensegregationSpindelapparat AssemblierungTransmissionselektronenmikroskopie

Verwandte Artikel