Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Meng-Fei Xu; Yu-Hao Yang; Ya-Lan Wei; Jing-Lian Zhang; Xuan Lin; Xiao-Yan Lin; Hui Chen; Zhen-Yu She

doi:10.3791/63271

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Funktionelle Bewertung von Kinesin-7 CENP-E in Spermatozyten mittels In-vivo-Inhibition , Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

1.9K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/63271

⸱

28. Dezember 2021

Meng-Fei Xu¹^,² , Yu-Hao Yang¹^,² , Ya-Lan Wei³^,⁴ , Jing-Lian Zhang¹^,² , Xuan Lin¹^,² , Xiao-Yan Lin¹^,² , Hui Chen¹^,² , Zhen-Yu She¹^,²

¹Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, ²Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, ³Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, ⁴Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel berichtet über eine in vivo Hemmung von CENP-E durch abdominale Chirurgie und Hodeninjektion von GSK923295, einem wertvollen Modell für die männliche meiotische Teilung. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Durchflusszytometrie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Assays zeigen wir, dass die CENP-E-Hemmung zu Chromosomenfehlstellungen und Genominstabilität in Mausspermatozyten führt.

Zusammenfassung

Bei Eukaryoten ist die Meiose essentiell für die Stabilität des Genoms und die genetische Vielfalt bei der sexuellen Fortpflanzung. Experimentelle Analysen von Spermatozyten in Hoden sind entscheidend für die Untersuchung der Spindelbildung und der Chromosomensegregation bei der männlichen meiotischen Teilung. Die Spermatozyten der Maus sind ein ideales Modell für mechanistische Untersuchungen der Meiose, jedoch fehlen die effektiven Methoden für die Analyse von Spermatozyten. In diesem Artikel wird eine praktikable und effiziente Methode zur in vivo Hemmung von Kinesin-7 CENP-E in Mausspermatozyten vorgestellt. Es wird ein detailliertes Verfahren zur Hodeninjektion eines spezifischen Inhibitors GSK923295 durch abdominale Operationen an 3 Wochen alten Mäusen vorgestellt. Darüber hinaus wird hier eine Reihe von Protokollen für die Gewebeentnahme und -fixierung, die Hämatoxylin-Eosin-Färbung, die Immunfluoreszenz, die Durchflusszytometrie und die Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. In dieser Arbeit stellen wir ein in vivo Inhibitionsmodell mittels Bauchchirurgie und Hodeninjektion vor, das eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der männlichen Meiose sein könnte. Wir zeigen auch, dass die CENP-E-Inhibition zu einer Chromosomenfehlstellung und einem Metaphasenarrest in primären Spermatozyten während der Meiose I führt. Unsere In-vivo-Inhibitionsmethode wird mechanistische Studien der Meiose erleichtern, als nützliche Methode für genetische Modifikationen der männlichen Keimbahnen dienen und ein Licht auf zukünftige klinische Anwendungen werfen.

Einleitung

Die Meiose ist eines der wichtigsten, hochrigide, evolutionär konservierten Ereignisse in eukaryotischen Organismen und ist essentiell für die Gametogenese, die sexuelle Fortpflanzung, die Integrität des Genoms und die genetische Vielfalt ^1,2,3. Bei Säugetieren durchlaufen die Keimzellen nach einer einzigen DNA-Replikationsrunde zwei aufeinanderfolgende Zellteilungen, Meiose I und II. Im Gegensatz zu den Schwesterchromatiden in der Mitose paaren sich duplizierte homologe Chromosomen und trennen sich während der Meiose in zwei Tochterzellen I ^4,5