Blutplättchen sind kleine, kernhaltige Blutzellen, die für die Blutstillung unerlässlich sind und von Megakaryozyten (MKs) im Knochenmark (BM) stammen. Während ihrer Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen entwickeln sich MKs in einem komplexen Prozess der Differenzierung und Reifung, der Polyploidisierung und zytoplasmatische Reifung umfasst, zu Riesenzellen. Im letzten Entwicklungsstadium, wenn MKs mit Endothelzellen in Kontakt kommen, erreichen sie ihr Reifestadium und verlängern lange zytoplasmatische Fortsätze, sogenannte Prothrombozyten, in Blutgefäße, die dann fragmentieren, um Blutplättchen im Blutkreislauf zu erzeugen 1,2. Die Mechanismen, die die MK-Reifung und die transendotheliale Thrombozytenbildung regulieren, sind noch unvollständig verstanden. Ziel dieser Sammlung ist es, komplementäre Methoden zusammenzuführen, die dazu beitragen, die Biologie von MKs in vitro und in vivo besser zu verstehen.
Die In-vitro-Expansion und -Differenzierung von MKs wird häufig verwendet, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombozytenbiogenese zugrunde liegen. Im Protokoll von Pongerard et al. beschreiben die Autoren ein standardisiertes Kulturprotokoll zur Differenzierung von MKs von humanen CD34+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Sie betonen insbesondere, dass Leukozytenfilter, die in Blutzentren erhältlich sind, eine außergewöhnliche Quelle für die Entnahme von CD34+-Zellen sind. Ihr Artikel enthält mehrere wichtige Richtlinien zur Extraktion von CD34+-Zellen, zur Beurteilung ihrer Reinheit und zur Bedeutung ihrer Aussaatdichte. Die Autoren schlagen auch eine kalibrierte Pipettiermethode vor, fünfmal hintereinander, um funktionelle Blutplättchen effizient freizusetzen. Interessante Anwendungen dieser Methode sind die Möglichkeit, pharmakologische Wirkstoffe zu bewerten oder CD34+-Zellen mit Hilfe einer CRISPR-Cas9-Genome-Editing-Methode genetisch zu manipulieren 3,4. Für Mausstudien stellen Kimmerlin et al. eine Zellsortierstrategie vor, um MK-Vorläuferzellen in ausreichender Anzahl zu reinigen, die mit molekularen und zellulären Assays kompatibel ist. Die Autoren diskutieren die Vorteile der Verwendung des Beckenkamms als Quelle für Knochenmark, das eine große Anzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält, und der Durchführung einer zweistufigen magnetischen Depletion unerwünschter Zellen vor der Zellsortierung unter Verwendung einer Kombination von Zelloberflächenmarkern. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Reduzierung der Anzahl der Tiere, die für die Gewinnung hochreiner MK-Vorläuferzellen erforderlich sind, was beispielsweise für Forscher interessant sein könnte, die die Hierarchie der hämatopoetischen Vorläuferzellen und ihre Differenzierung untersuchen. In diesem Zusammenhang beschreiben Boscher et al. eine Methode, um Vorläuferzellen in einem 3D-Medium aus 2% Methylcellulose zu züchten, um die in vivo-Umgebung besser nachzuahmen. Tatsächlich haben diese Autoren bereits gezeigt, dass MKs, die in einem 3D-Hydrogel gezüchtet werden, im Vergleich zu solchen, die in einem flüssigen Medium gezüchtet werden, einen besseren Reifezustand und eine größere Fähigkeit zur Bildung von Vorläuferzellen erreichen5. In diesem Protokoll werden kritische Schritte hervorgehoben, wie z. B. das geeignete Volumen an Methylcellulose, um eine optimale mittlere Steifigkeit zu erreichen, die Anzahl der Zellen, die in jeder Versuchsbedingung gleichwertig sein sollten, und das Risiko einer Kontamination. Zur funktionellen Verifizierung des Reifegrades erklären die Autoren, wie die gelkultivierten Zellen am dritten Kulturtag in flüssigem Medium resuspendiert werden und wie die Zellen für zukünftige Analysen durch Immunfärbung, Durchflusszytometrie oder Elektronenmikroskopie fixiert werden. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist der bildgebende Ansatz der Wahl, um eine hochauflösende Ultrastruktur von MKs zu liefern. Scandola et al. stellen sich hier ein Protokoll vor, um die Ultrastruktur von MKs in ihrer natürlichen BM-Umgebung zu analysieren, ihre Zelldichte zu quantifizieren und die verschiedenen Reifungsstadien zu bewerten. Die Autoren verwenden TEM, um die zellulären Ereignisse zu analysieren, die auftreten, wenn MKs mit der sinusförmigen Wand interagieren, wie z. B. ihre kurzen invasiven podosomenartigen Vorsprünge, die das Endotheldurchdringen 6. Eine Einschränkung der Methode besteht darin, dass die Anfangsphase des MK-Engagements nicht analysiert werden kann, da diese unreifen Zellen keine spezifischen ultrastrukturellen Merkmale aufweisen. Wie bereits erwähnt, hat dieser bildgebende Ansatz den Vorteil, dass kleine BM-Proben verwendet werden, die es ermöglichen, mehrere Studien mit einer einzigen Maus durchzuführen. Als Beispiel können die anderen Knochenmarkproben für die Knochenmarkexplantattechnik verwendet werden, die in dieser Sammlung von Guinard et al. vorgestellt wird, um die dynamische Ausdehnung von Prothrombozyten aus MKs zu untersuchen. Die Stärke dieser Methode liegt in der Verwendung von MKs, die sich in der BM entwickelt haben, um mögliche Fehlinterpretationen durch Artefakte der Zelldifferenzierung in Kultur zu vermeiden. In der Tat wurde dies bereits bei Mäusen mit MK-restriktiver MYH9-Inaktivierung dokumentiert, wobei in vitro und ex vivo unterschiedliche Ergebnisse gefunden wurden 7. Die Autoren betonen auch die Einfachheit, Reproduzierbarkeit und Schnelligkeit dieses Ansatzes. Eine interessante Anmerkung ihres Protokolls ist die Möglichkeit, Mikroskope zu verwenden, die mit Navigationssoftware ausgestattet sind, um die Verfolgung/Quantifizierung von MKs zu erleichtern, die Prothrombozyten verlängern. Eine komplementäre Methode des Explantatmodells ist die Zwei-Photonen-Bildgebung von MKs im Schädel der Maus. Die Einzigartigkeit dieser Technik besteht in der Möglichkeit, das dynamische Verhalten von fluoreszenzmarkierten MKs im Knochenmark in vivo zu untersuchen und die Prothrombozytenverlängerung sichtbar zu machen. Dieses Protokoll hat den Vorteil, dass es minimal-invasiv ist, mit begrenzten chirurgischen Eingriffen, wodurch Entzündungsreaktionen vermieden werden, von denen berichtet wurde, dass sie sich auf die Thrombozytenbildung auswirken. Wie Bornert et al. anmerken, ist eine Einschränkung dieser Methode die geringe Tiefe, die aufgrund der Dichte des Knochens abgebildet werden kann, was auch den Einsatz jüngerer Mäuse erfordert. Diese Technik kann auf genetisch veränderte Mäuse angewendet werden, um die Rolle von Genen von Interesse bei der In-vivo-Thrombozytenbildung zu untersuchen. Zum Beispiel verwendeten die Autoren diese Technik, um zu zeigen, dass die Rolle von Mikrotubuli bei der Verlängerung von Thrombozyten zwischen in vitro- und in vivo-Bedingungen unterschiedlich ist8.
Eine abnormale MK-Entwicklung und Thrombozytenproduktion kann zu Thrombozytopenie oder Thrombozythämie führen, was das Risiko von Blutungen bzw. Thrombosen erhöht. Kontinuierliche Bemühungen, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Thrombozytenbiogenese steuern, werden unsere Fähigkeit erhöhen, neue Strategien für die Behandlung von Thrombozytopenie und Thrombozythämie zu entwickeln. Im Bereich der Transfusionsforschung werden diese Bestrebungen die Grundlage für die Herstellung von kultivierten Blutplättchen als Transfusionsalternative in ausgewählten Situationen legen9.