Dieses Papier beschreibt die Ischämie-Reperfusion (I / R) -Modellierung in einem 3-tägigen Kükenembryo unter Verwendung eines angepassten Spinalnadelhakens, um die I / R-Entwicklung und -Behandlung besser zu verstehen. Dieses Modell ist einfach, schnell und kostengünstig.
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Methodenartikel
Generierung eines Hakenischämie-Reperfusionsmodells unter Verwendung eines dreitägigen Kükenembryo
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ischämie und Reperfusionsstörungen (I / R) wie Myokardinfarkt, Schlaganfall und periphere Gefäßerkrankungen sind einige der Hauptursachen für Krankheit und Tod. Derzeit stehen viele in vitro und in vivo Modelle zur Verfügung, um den I/R-Mechanismus in Krankheiten oder geschädigtem Gewebe zu untersuchen. Bisher wurde jedoch kein in ovo I / R-Modell berichtet, das ein besseres Verständnis der I / R-Mechanismen und ein schnelleres Drogenscreening ermöglichen würde. Dieses Papier beschreibt die I / R-Modellierung unter Verwendung eines an die Wirbelsäulennadel angepassten Hakens in einem 3-tägigen Kükenembryo, um die I / R-Entwicklungs- und Behandlungsmechanismen zu verstehen. Unser Modell kann verwendet werden, um Anomalien auf DNA-, RNA- und Proteinebene zu untersuchen. Diese Methode ist einfach, schnell und kostengünstig. Das aktuelle Modell kann unabhängig oder in Verbindung mit bestehenden in vitro und in vivo I/R-Modellen verwendet werden.
Einleitung
Ischämie-Reperfusion Gewebeverletzung wurde mit einer Reihe von Pathologien in Verbindung gebracht, darunter Herzinfarkte, ischämischer Schlaganfall, Trauma und periphere Gefäßerkrankungen1,2,3,4,5. Dies ist in erster Linie auf das Fehlen eines umfassenden Verständnisses des Krankheitsverlaufs und das Fehlen eines effektiven Forschungsmodells zurückzuführen. Eine ischämische Verletzung tritt auf, wenn die Blutversorgung eines bestimmten Bereichs des Gewebes unterbrochen wird. Infolgedessen nekrotisiert ischämisches Gewebe schließlich, obwohl die Rate je nach Gewebe variiert. Daher kann die Wiederherstellung der Blutversorgung dazu beitragen, den Schaden zu mildern. Es wurde jedoch in einigen Fällen beobachtet, dass die Reperfusion mehr Gewebeschäden verursacht als Ischämie allein6,7,8. Daher ist das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Ischämie-Reperfusion erforderlich, um eine wirksame therapeutische Intervention zu entwickeln. Derzeit ist keine wirksame Behandlung von I/R-Verletzungen bekannt. Diese Diskrepanz hat zur Schaffung neuer experimenteller Modelle geführt, die von In-vitro- bis zu In-vivo-Modellen reichen, um das bestehende Problem anzugehen9,10,11,12,13.
Kükenembryonen (Gallus gallus domesticus) werden aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit, ethischen Akzeptanz, relativ großen Größe (im Vergleich zu anderen Embryonen), niedrigen Kosten und schnellen Wachstums häufig in der Forschung eingesetzt14. Wir verwendeten einen Kükenembryo nach 72 h Entwicklungszeit, um eine In-Ovo-I / R zu erzeugen, indem wir die rechte Vitellinarterie mit Hilfe einer Spinalnadel verschlossen und freisetzten. Wir nannten es das Hook-I/R-Ischämie-Reperfusionsmodell (Abbildung 1). Das in dieser Studie verwendete Modell ist in der Lage, alle nachgeschalteten Prozesse genau zu simulieren, einschließlich oxidativer und entzündlicher Signalwege, die häufig mit I/R-Schäden in Verbindung gebracht werden15,16,17.
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Protokoll
Das Institutional Animal Ethical Committee am Lucknow Medical College and Hospital von Era gab eine schriftliche Verzichtserklärung heraus, in der es heißt, dass für die Durchführung dieser Experimente in Übereinstimmung mit dem Committee for the Purpose of Control and Supervision of Animals (CPCSEA) keine formelle Genehmigung erforderlich ist. Es wurden jedoch Standardarbeitsanweisungen befolgt, um das Potenzial für embryonalen Stress zu minimieren.
1. Puffervorbereitung (Tabelle 1)
- Vorbereiten der Lösung von Ringer
- Zur Herstellung der Ringer-Lösung werden 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) in 70 ml sterilem destilliertem H2O mit einem Endvolumen von 100 mL gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Lassen Sie es vollständig auflösen und autoklavieren. Anschließend durch einen 0,22 μm Filter filtrieren, in Einwegmengen (ca. 10 ml) aliquotieren und bei Raumtemperatur lagern.
- Normale Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid, NaCl) zubereiten.
- In 70 ml sterilem destilliertem H2O werden 0,9 g NaCl (154 mM) gelöst. Machen Sie das Volumen auf 100 ml. Autoklav für 15 min bei 121 °C. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 0,1 N HCl oder 0,1 N NaOH ein, falls erforderlich. 10 mL Aliquots in einem 15 mL sterilen Zentrifugenröhrchen herstellen und bei Raumtemperatur lagern.
- 70% Ethanol (v/v) herstellen.
- Mischen Sie 70 mL reines Ethanol (Mol. wt. 46,07 g/L) auf 30 mL steriles H2O. Bereiten Sie es nach Bedarf vor oder lagern Sie es bei Raumtemperatur. Es besteht keine Notwendigkeit für die Sterilisation.
- Bereiten Sie 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (1x PBS) vor.
- 100 ml 1x PBS werden unter Zugabe von 0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14,6 mM) zu 70 mL destilliertem Wasser hergestellt. Lösen und das Volumen auf 100 ml auffüllen und für 15 min bei 121 °C autoklavieren. Bringen Sie den pH-Wert auf 7,4 und fügen Sie bei Bedarf ein paar Tropfen 0,1 N HCl oder 0,1 N NaOH hinzu. Aliquots von 10 ml in einem 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen herstellen und bei Raumtemperatur lagern.
2. Tag 1
- Ordnen Sie alle Werkzeuge an, die für die Sterilisation von Eiern erforderlich sind (70% Ethanol, Reinigungstücher, ein Eierregal und ein OHP-Marker).
- Reinigen Sie die 0-Tage-Eier mit 70% Ethanol mit Seidenpapiertüchern. Verwenden Sie nur ein 0-Tage-Ei, da ältere Eier möglicherweise keinen Embryo hervorbringen.
- Schreiben Sie das aktuelle Datum auf Eier mit einem OHP-Marker.
- Legen Sie die Eier in einen Eierinkubator, der auf eine Temperatur von 36-37 ° C und eine Luftfeuchtigkeit von 60% -65% eingestellt ist. Bebrüten Sie die Eier für die nächsten 24 h.
3. Tag 2
- Organisieren Sie die notwendige Ausrüstung für die Entnahme von 5-6 ml Albumin (Schere mit scharfer Kante, 5 ml Spritze, 18 G Nadel, Spritzenauswerfer und Klebeband).
- Wischen Sie die chirurgische Schere mit 70% Ethanol ab oder sterilisieren Sie sie mit einem Autoklaven, nachdem Sie sie mit 70% Ethanol abgewischt haben.
- Nehmen Sie nun das Ei aus dem 37 °C eier inkubator zur Schichtung.
- Legen Sie das Ei auf ein sauberes Eierregal.
- Befestigen Sie ein kleines Stück Klebeband (Größe: ca. 1 Zoll Länge x Breite) am Rand des Eies.
- Machen Sie mit einer scharfen Kantenschere ein kleines Loch in den Rand der Eierschale. Führen Sie eine 5-ml-Spritze in einem ungefähren Winkel von 75° ein.
HINWEIS: Die 5-ml-Spritze wird mit einer 24 G x 1-Nadel (steril) geliefert, aber es ist gut, die 24 G x 1-Nadel durch eine 18 G x 1,5-Nadel (steril) zu ersetzen. Die 18 G x 1,5 Nadel ist 1,25 x 38 mm breit. Daher wird es die Entfernung von Albumin erleichtern. - Nachdem Sie die Nadel in den Dottersack eingeführt haben, ziehen Sie langsam 5-6 ml Albumin ab.
HINWEIS: Dies gibt dem Embryo ein Bett, auf dem er wachsen kann. Das Zurückziehen von Albumin verhindert ein Überfüllen von Albumin beim Einrichten eines Fensters. Schließlich wird das Risiko, dass der Embryo während des Fensters beschädigt wird, durch die Eliminierung von 5-6 ml Albumin gemindert. - Nach dem Entfernen des Albumins die Öffnung mit Klebeband wieder verschließen und die Eier 48 h bei 37 °C inkubieren lassen.
4. Tag 4
- Bereiten Sie die Ringer-Lösung, 0,9 % normale Kochsalzlösung und 1x PBS wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben vor. Dann autoklavieren Sie die drei Lösungen. Nach dem Autoklavieren die jeweilige Lösung bei Raumtemperatur platzieren.
- Nehmen Sie das Ei aus dem 37 °C großen Eierinkubator heraus und schneiden Sie die Schale in eine kreisförmige Form. Bevor Sie die Eierschale schneiden, bedecken Sie den zu schneidenden Bereich mit Klebeband.
HINWEIS: Das Abdecken des Fensterbereichs mit Klebeband verhindert das Brechen der Eierschale an unerwünschte Stellen. Wenn Sie jedoch an einen unerwünschten Ort einbrechen, versiegeln Sie den Bereich mit dem Klebeband. Das Abdecken der zu schneidenden Stellen mit Klebeband verhindert, dass Schalenstücke auf den Dottersack fallen. - Erstellen Sie ein kleines Loch in der Eierschale mit einer scharf zugespitzten Kantenschere an der Stelle, an der die Fensterung gewünscht wird, und beginnen Sie mit dem Schneiden einer kreisförmigen Öffnung. Dieser Vorgang wird als Windowing bezeichnet.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der kreisförmige Schnitt groß genug ist, um einen einfachen Zugang zum Embryo aus jeder Richtung zu ermöglichen. Falls erforderlich, ändern Sie die Eizellposition, um die Position des Embryos anzupassen. - Als nächstes lokalisieren Sie mit einem Stereozoom-Operationsmikroskop die rechte Vitellinarterie (RVA).
HINWEIS: Hühnerembryonen durchlaufen normalerweise eine Thoraxtorsion (zusammen mit zervikaler Beugung usw.), wenn sie sich entwickeln, so dass die linke Seite des Kopfes im 72-Stunden-Stadium gegen das Eigelb ist. Kaudaler, wo die Vitellinarterien den Körper verlassen, ist der Embryo nicht viel verdreht, und dieser Teil des Körpers liegt ventral mit der Seite nach unten zum Eigelb. Wenn man also direkt betrachtet, befindet sich die Rechte des Embryos rechts vom Forscher. - Sobald die RVA lokalisiert ist, erzeugen Sie mit einer 26 G-Nadel zwei kleine Löcher auf der linken und rechten Seite der RVA (Abbildung 2).
- Platzieren Sie die Doppler-Blutfluss-Bildgebungssonde über der RVA. Stellen Sie sicher, dass die Doppler-Blutfluss-Bildgebungssonde 5 ± 1 mm von der Stelle der Ischämie und in Richtung des distalen Endes der RVA platziert wird. Nehmen Sie eine Flussmessung für 2 min und 30 s (oder länger, falls gewünscht) vor. Dies wird die normoxische Phasenmessung sein.
- In der Zwischenzeit formen Sie die Kante der Spinalnadel mit einer Nasenzange und einer Zahnzange manuell in die Form eines Hakens (Abbildung 3). Tun Sie dies, indem Sie den Rand der Spinalnadel für ca. 1 mm biegen. Eine größere Größe erschwert das Einführen und Entfernen der Spinalnadel während des E / A-Verfahrens.
- Führen Sie die Spinalnadel mit einem Mikromanipulator direkt unter die rechte Vitellinarterie ein.
HINWEIS: Führen Sie die Spinalnadel mit äußerster Vorsicht ein, um eine Beschädigung der RVA oder benachbarter Arterien zu vermeiden. Die optimale Technik besteht darin, den speziell entwickelten Haken der Spinalnadel genau über der rechten Seite des RVA-Lochs einzustellen, gefolgt von einem schrittweisen Einführen der speziell entwickelten Kante der Spinalnadel in den Dottersack mit Hilfe eines Mikromanipulators unter Anleitung eines Stereozoom-Operationsmikroskops durch das rechte Loch. Sobald sich der Haken der Spinalnadel im Dottersack befindet, stellen Sie den Haken unter dem RVA schrittweise so ein, dass seine Kante genau unter dem linken Loch platziert ist. Jetzt ist es an der Zeit, die Spinalnadel anzuheben. - Heben Sie nun mit Hilfe des Mikromanipulators die Arterie allmählich an, bis der Doppler-Blutflussfluss eine minimale Abnahme des arteriellen Flusses um 80% anzeigt.
- Sobald ein Drop von 80% oder mehr im Dopplerfluss erreicht ist, lassen Sie die Spinalnadel für 5 Minuten angehoben (ziehen Sie die Arterie nach oben). Dies wird die Periode der Ischämie in der RVA sein.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Dopplerfluss während der Dauer der Ischämie zu überwachen. Wenn eine signifikante Fluktuation festgestellt wird, beenden Sie die Tests. - Nach der 5-minütigen Ischämieperiode lassen Sie die Arterie allmählich frei, um den normalen Blutfluss wiederherzustellen. Stellen Sie sicher, dass ein Doppler-Blutdurchflussmesser Werte anzeigt, die mit denen vergleichbar sind, die während der Normoxie erhalten wurden. Dies ist der Zeitraum der Reperfusion in der RVA (Abbildung 4).
- Nach dem I / R-Verfahren einige Tropfen (2-3) 1x PBS auf den Embryo auftragen und 2-3 Minuten lang beobachten.
HINWEIS: Die Verwendung von 1x PBS verhindert, dass der Embryo austrocknet. - Zum Schluss das Fenster mit Klebeband wieder verschließen und das Ei für 5 h und 55 min wieder in den Eierinkubator legen.
- Nehmen Sie nach 5 h und 55 min das Ei aus dem Eierinkubator, legen Sie es auf das Eierregal, öffnen Sie das Fenster wieder und befolgen Sie das nachgeschaltete Behandlungsprotokoll.
5. Behandlungen
- Für die Behandlung der Arterien mit Medikamenten, Aktivatoren oder Inhibitoren, schneiden Sie die RVA nach 1 h des I / R-Prozesses aus.
- Für die nachgelagerten Studien entfernen Sie den Embryo zunächst aus der Eierschale, indem Sie ihn auf eine sterile 90-mm-Petrischale legen.
- Sobald der Embryo in die Petrischale entlassen wurde, schneiden Sie die RVA unter Verwendung der Augeniris unter Anleitung eines Stereozoom-Operationsmikroskops aus.
- Stellen Sie sicher, dass das Exzisionsmaß von RVA bis zu 15 ± 1 mm (distal vom Stamm), jeweils 5 ± 1 mm auf der linken und rechten Seite der Arterie und 2 ± 1 mm in Richtung Des Rumpfes beträgt.
HINWEIS: Ein Lineal kann verwendet werden, um den zu beschneidenden Bereich zu messen (optional). - Nach dem Ausschneiden der RVA waschen Sie sie mit 1x PBS in einer sterilen Petrischale mit 1x PBS.
- Für die gewünschten Behandlungen legen Sie die Arterie in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen (sterilisiert), das mit 500 μL Ringer-Lösung gefüllt ist. Legen Sie die RVA in das Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie für 5 h und 55 min in einen 37 °C Inkubator.
HINWEIS: Abhängig von den Behandlungen verwenden Sie entweder die Ringer-Lösung ohne Behandlung oder die Behandlung mit dem gewünschten Volumen und der gewünschten Konzentration von Medikament, Aktivator oder Inhibitor. - Nach 5 h und 55 min Inkubation nehmen Sie die RVA aus dem 37 °C Laborinkubator und fahren mit den gewünschten Behandlungen fort.
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Ergebnisse
Die Doppler Blood Flow Imaging-Technik wurde verwendet, um die Wirksamkeit unseres Modells zu bewerten. Kurz gesagt, wir haben die Daten aus der Kontrollgruppe mit den Daten aus der RVA-Gruppe verglichen, um den Erfolg unserer Kreation zu bestimmen. Abbildung 4A zeigt einen typischen Fluss, der mit dem Kontrolltier assoziiert ist, während Abbildung 4B die Ergebnisse einer RVA darstellt. Die Numerische 1-8 stellt die verschiedenen Ereignisse dar, die mit E/A-Phas...
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Diskussion
Ziel der Ischämie-Reperfusionsforschung ist es, therapeutische Strategien zu entwickeln, die den Zelltod verhindern und die Genesung fördern29,30. Um die aktuellen Einschränkungen in der I/R-Forschung zu überwinden, haben wir ein Hook I/R-Kükenembryomodell entwickelt, um ein zuverlässiges und reproduzierbares I/R-Modell zu erstellen. Unseres Wissens nach ist unser Modell das erste I / R-Modell, das jemals in einem 3-tägigen Kükenembryo für routinemäßige I / R-Exp...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine gegensätzlichen Interessen.
Danksagungen
Wir möchten Hari Shankar für seine kritischen Beiträge während der Videografie und des Schnitts, Herrn Baqer Hussain für voice-over, Herrn Asghar Rizvi für den Videoschnitt, Herrn Mohammad Haider für Videodrehs, Herrn Mohammad Danish Siddiqui für die Unterstützung während der Experimente danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| (-80°; C) Gefrierschrank | Haier, | China-1,5 | |
| ml Zentrifugenröhrchen | TARSONS, Indien | 500010X | |
| 100mm Petrischale (steril) | Tarsons, Indien | 460050 | |
| 18G Nadel (18G&mal; 1.5 (1.25&fach; 38mm) | Ramsons, Indien | 13990 | |
| 1mL Spritze | DISPO VAN-26G | ||
| Nadel (26G&mal; 1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, indien | 30722D | |
| 37° C Eierbrutkasten mit einstellbarer prozentualer Luftfeuchtigkeit | Gentek, Indien | GL-100 | |
| 37°; C Labor-Inkubator | SCIENCE TECH, Indien | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenin (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Weidepipette | TARSONS, Indien | 940050 | |
| 50mL Becher | TARSONS, | Indien-5mL | |
| Spritze | DISPO VAN, Indien | IP53 | |
| 70% Ethanol | Merck Millipore, Vereinigte Staaten | 64-17-5 | |
| Klebeband/Celloband | Sunrise, | Indien-Ambra1 | |
| Primer | Applied Biosystems, Foster City, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-Maus IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R& D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 Primer | Applied Biosystems, Foster City, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoklavenbeutel | Tarsons, Indien | 550022 | |
| Autoklavenmaschine | Lokal hergestellt, Lucknow, | ||
| Proteintech, USA | 66665-1-Ig | ||
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Rinderserumalbumin | Himedia, Mumbai, Indien | TC194 | |
| Calciumchlorid | Himedia, Mumbai, Indien | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Reinigungstücher | Kimberly-Clark, Indien | 370080 | |
| Gespaltene Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| Di-Natrium Hydrogenphosphat-Heptahydrat | Himedia, Mumbai, Indien | GRM39611 | |
| Doppler-Blutdurchflussmesser | Moors Instrument, Vereinigtes Königreich | moorVMS-LDF1 | |
| Eierregal | - | ||
| Eierregal | - | ||
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH Primer | Applied Biosystems, Foster City, USA | ||
| Glycine Himedia | , Mumbai, Indien | MB013 | |
| Nierentablett | HOSPITO-LC3A | ||
| /B | Zellsignaltechnologie, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem Laboratories, Mumbai, Indien | M0252 | |
| Mikromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-Acetyl-L-cystein (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nasenzange | Lokal hergestellt, Lucknow, | Indien-Augenzange | |
| Stoelting, Deutschland | 52106-40 | ||
| Augeniris | Tufft Chirurgische Instrumente, Jaipur, Indien | Hard Age Vannas Mikroschere abgewinkelt 8CM / 3 1/8" | |
| OHP Markierungsstift | Camlin, | ||
| ImmunoTag, USA | ITT08329 | ||
| Spitze Schere mit scharfen Kanten | Stoelting, Deutschland | 52132-11 | |
| Kaliumchlorid | Himedia, Mumbai, Indien | MB043 | |
| Kaliumphosphat monobasische wasserfreie | Himedia, Mumbai, Indien | MB050 | |
| Proteasehemmer | Abcam, Vereinigte Staaten | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Natriumchlorid | Fisher Scientific, Mumbai, Indien | 27605 | |
| Natriumdodecylsulfat | Himedia, Mumbai, Indien | GRM886 | |
| Spinalnadel 25GA; 3,50 Zoll (90,51 x 90 mm) | Ramson, Indien | GS-2029 | |
| Stereo-Zoom-Operationsmikroskop | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Spritzenvertreiber | BIOHAZARD | 882210 | |
| Zahnzange | Stoelting, Deutschland | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, Vereinigte Staaten | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, Indien | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, Vereinigte Staaten | RC1227 | |
| Weißes Leghorn Huhn 0-Tage-Eier | -- | ||
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
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