Summary
本稿では、マイクロ流体音響泳動技術と、培地からのグラム陰性菌の迅速かつ効率的な単離に使用できるアプタマー修飾マイクロビーズを用いたマイクロ流体音響ホレストリーチップの製造と操作について説明します。
Abstract
この記事では、マイクロ流体音響泳動技術と、培地からのグラム陰性菌の迅速かつ効率的な単離に使用できるアプタマー修飾マイクロビーズを使用したマイクロ流体音響ホレスティックチップの製造と操作について説明します。この方法は、長い正方形のマイクロチャネルのミックスを使用して分離効率を高めます。このシステムでは、サンプルとバッファーはフローコントローラを介して入口ポートに注入されます。ビーズセンタリングとサンプル分離のために、パワーアンプを備えたファンクションジェネレータを介して圧電トランスデューサにAC電力を印加し、マイクロ流路に音響放射力を発生させます。入口と出口の両方に二股のチャネルがあり、同時に分離、精製、濃縮が可能です。この装置は、10倍の用量濃度まで>98%の回収率および97.8%の純度を有する。この研究は、細菌を分離するための既存の方法よりも高い回収率および純度を実証しており、この装置が細菌を効率的に分離できることを示唆している。
Introduction
マイクロ流体プラットフォームは、誘電体移動、磁気泳動、ビーズ抽出、フィルタリング、遠心マイクロ流体学および慣性効果、および弾性表面波1,2に基づく方法に加えて、医療および環境サンプルから細菌を単離するために開発されている。病原菌の検出はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて継続されますが、通常は手間がかかり、複雑で、時間がかかります3,4。マイクロ流体音響泳動システムは、合理的なスループットと非接触細胞分離5、6、7を通じてこれに対処する代替手段です。アコーストフォレーシスは、音波を介した物質の動きの現象を利用してビーズを分離または濃縮する技術です。マイクロ流路に音波が入ると、ビーズの大きさ、密度等に応じて選別され、浮遊培地7,8の生化学的・電気的性質に応じて細胞を分離することができる。そこで、多くの音響フォレーシス研究が盛んに進められ9、10、11、最近では、立地弾性表面波マイクロ流体における境界駆動音響ストリーミングによって誘導される音響ホア運動の3D数値シミュレーションが導入されている12。
様々な分野の研究が抗体を置き換える方法を検討しています 2,3.アプタマーは高い選択性と特異性を有する標的物質であり、2、9、10、13と多くの研究が行われている。アプタマーは、抗体と比較して小型、優れた生物学的安定性、低コスト、および高い再現性の利点を有し、診断および治療用途で研究されている2、3、14。
ここでは、アプタマー修飾マイクロビーズを使用して、培地からグラム陰性(GN)細菌を迅速かつ効率的に分離するために使用できるマイクロ流体音響泳動技術プロトコルについて説明します。このシステムは、長い長方形のマイクロ流路内で2つの直交共鳴を同時に刺激し、アプタマー結合マイクロビーズをノード点と対ノード点に整列させ、焦点を合わせることによって、単一の圧電作動を介して2次元(2D)音響定在波を生成し、分離効率2,11,15,16.入口と出口の両方に二股のチャネルがあり、同時に分離、精製、濃縮が可能です。
このプロトコルは、細菌感染症の早期診断、ならびにリアルタイムの水モニタリングによる病原性細菌感染に対する迅速、選択的、かつ敏感な応答の分野で役立ちます。
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Protocol
1. マイクロ流体音響泳動チップ設計
メモ:図1は、音響泳動によるマイクロチャネルからのターゲットマイクロビーズの分離と収集の概略 図 を示しています。マイクロ流体音響泳動チップは、CADプログラムを使用して設計されています。
- 細菌の大きさに対応するアプタマー修飾ビーズとストレプトアビジン被覆ポリスチレン(PS)ビーズの混合物を使用して、デバイスの分離性能を検討するマイクロ流体音響泳動チップを設計します。
- ターゲット出口でPSビーズを収集し、PSサンプル混合物をサンプル入口に注入した後、出口を通って残りを廃棄するマイクロ流体音響泳動チップを設計します( 図2 および 表1を参照)。
メモ:この目的のために、音響流体チップは、サンプルとバッファを注入するための2つのインレット、マイクロビーズを中央に整列させるための圧電トランスデューサ(PZT)が取り付けられたメインチャネル、およびサンプルが収集され、廃棄物が排出される2つのアウトレットで構成されるように設計されています(図3A) - マイクロビーズ、バッファー、バクテリア、アプタマーがメインチャネルを通過し、PZTによって誘導されるチップ内音響泳動を介してマイクロビーズが中央に整列するマイクロ流体音響泳動チップを設計します(図3B、C)
2. マイクロ流体音響泳動チップ製造
メモ: 図 3A、B に示すように、ホウケイ酸ガラス - シリコン層、シリコン層、ホウケイ酸ガラス層、および PZT 層の 4 つの層を次の順序で組み立てます。
- ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブを接続するための入口と出口にサンドブラスト17 で直径2mmの穴を開けたホウケイ酸ガラス(最上層)を用意する。ホウケイ酸ガラスは、20 × 80 × 0.5 mm3を測定します。
- フォトレジストを用いて形成した断面積0.2~0.2mm2のマイクロチャネルと、ディープリアクティブイオンエッチング(RIE)18で得られたシリコンパターンと×厚さ200μmのシリコンチャネル層を作製した。反応性イオンエッチング中に、サンプルおよびバッファー入口チャネル、および収集および廃棄物出口チャネル用に直径 1 mm の穴を開けます。
メモ:ここで、イオンエッチングはRIEプロセスを使用してマイクロチャネルを形成します。シリコンチャネル層用のシリコンウェーハ上にフォトレジストをチャネル状に塗布した。PR被覆シリコンウェーハを、フッ素18に13.56Mhzを印加して生成したプラズマでエッチングした。 - 工程2.2で作製したシリコン層(20×80×0.5mm3)の上下の層(20×80×0.5mm3)を工程2.1のホウケイ酸ガラスに接合し、19の1,000V、400°Cで陽極酸化処理して第3のホウケイ酸ガラス層を設けたチップを作製した。
- シアノアクリレート接着剤(10μL以下)を使用して、マイクロ流体チャネルに沿ってホウケイ酸ガラス層にPZT(20×40mm2)を取り付けます。
メモ:高さの変化を最小限に抑えるために、綿棒を使用して接着剤をチャネルに非常に薄い層として塗布します。 図3C は、デバイスの画像である。
3. 細菌株および培養物
注:実験のためにGNおよびグラム陽性(GP)細菌を選択してインキュベートするには、 表2 を参照してください。培養方法については、ステップ3.1~3.4を参照されたい。すべての細菌は、600nmで0.4の吸光度(OD600)が得られるまで好気的条件下でインキュベートされるべきである。
- エシェリヒア・コリDH5α、エシェリヒア・コリKCTC2571、スフィンゴモナス・インスラエ、シュードモナス・ピクトルムおよび表皮ブドウ球菌およびスタフィロコッカス・パステウリなどのGP細菌などのGN細菌の場合、ルリア・ベルタニ培地中で37°Cおよび220rpmで16時間インキュベートする。
- エンテロバクター(GN)およびバチルスメガテリウム(GP;KCTC 1021)、栄養ブロス培地中で37°Cおよび220rpmで16時間インキュベートする。
- エンテロコッカス・タイランディカス(GP)の場合、デマン、ロゴサ、シャープ(MRS)培地中で37°C、220rpmで16時間インキュベートします。
- Listeria grayi(GP)の場合、脳心臓注入培地中で37°Cおよび220rpmで16時間インキュベートする。
- 培養した細菌を遠心分離機(9056 x g)で室温(RT)で1分間、次いで1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で2回洗浄する。
- 選択したGNおよびGP細菌をPBS緩衝液に再懸濁することによって分析のために調製する。
4. マイクロビーズおよびマイクロビーズへのアプタマーの固定化
- 使用前にストレプトアビジン被覆マイクロビーズ(10 μm)混合物(材料表)を再懸濁します(ボルテックスを介して20秒間混合)。
- 95°Cで3分間変性させた後、0°Cで2分間リフォールディングすることにより、アプタマーを調製する。
- 再懸濁ストレプトアビジン被覆マイクロビーズ混合物250 μLを1.5 mLチューブに移し、RTでTris-HCl緩衝液(50 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl)で洗浄した。次いで、100μLのビオチン化DNAアプタマーをチューブに加える。
- 混合物を回転させながらRTで30分間インキュベートする(25rpm)。
- 遠心分離(9056 x g)後、RTで200 μLのTris-HClバッファーでチューブを2回洗浄します。
- 洗浄したサンプルチューブに10 μLのBSA(100 mg/mL)を加え、回転しながらRT(25 rpm)で30分間インキュベートします。
- 最後に、RTでトリス塩酸緩衝液中で遠心分離(9056 x g)によってアプタマー修飾マイクロビーズを2回洗浄する。
5. 音響フォレーシスのセットアップと操作
- PEEKチューブを2つの注入口に接続して2つのサンプルとバッファーを注入し、廃棄物を収集および排出するための2つの排出口に接続します(図4)。
- マイクロ流体音響泳動チャネルに、10 mL シリンジを使用して気泡のない脱塩水を手動で充填します。
- 流体の流れを制御するために、2つ以上の出力チャンネルを備えた精密圧力コントローラを準備します。次に、バイアルをサンプルとバッファーで半分充填し、それぞれキャップに2つの穴を開け、チップ入口に接続します。
メモ:2つ以上の出力チャンネルを備えた高精度圧力コントローラは、複数の高精度圧力コントローラと交換できます。バッファー入口では、サンプル注入中にサンプルが中心に移動するのを防ぐ層流を生成できるバッファーがフローコントローラーを介して注入されます。 - 装置を調製した後、精密圧力制御装置を用いて、試料入口に2kPa、緩衝液入口に4kPaの圧力を加えて試料及び緩衝液を注入する。
注:現時点では、層流をスムーズにするために、バッファーの注入圧力はサンプルの注入圧力よりも高くする必要があります。流れは、入口チャネルに接続されたアスピレータに固定されたフローコントローラによって制御される。 - ビーズに焦点を合わせ、顕微鏡で確認しながらPZTを使用してマイクロ流体チャネルの中心に移動します。
メモ: ビードが大きいほど、波形への影響が大きくなるため、ノードポイントに合わせやすくなります。アンプ付きファンクションジェネレータは、PZTに電力を供給してマイクロチャネルに正弦波を生成します。マイクロ流路の上下はガラス製であるため、発生した正弦波を反射させてノード点7を作成する。 - シングルチャンネルファンクションジェネレータを使用して3.66MHzの共振周波数を生成し、パワーアンプを使用して標準信号を16dB(約9倍)増幅します(図4)。
メモ:アクチュエータの共振周波数は、チャネルのサイズと一致する必要があります。チャネルは正方形であるため、PZTは正確な周波数で動作し、単一のノードを作成します。 - 音響流体チップ上の分離および濃縮プロセスを、蛍光顕微鏡と1,200fpsで動作する高速カメラで観察します。
- サンプルの採取や廃棄物排出口から排出される細菌結合ビーズや細菌の蛍光顕微鏡カメラで撮影した画像を確認することで、GN細菌やGP細菌の有無を定量・分析します。
注:バッファー、バクテリア、アプタマーを含むマイクロビーズはメインチャネルを通過し、マイクロビーズはPZTによって誘導されるインチップ音響泳動を介して中央に整列されます。最後に、GN菌を結合させたマイクロビーズを回収口で回収し、未回収の菌を廃液排出口から排出する。
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Representative Results
図5 は、PZT電圧(オフ、0.1V、0.5V、5V)の関数としてのビードフローの画像を示しています。本研究で紹介した音響フォレティックチップの場合、PZTの電圧が上昇するにつれて、10μmサイズのビーズの中心濃度が上昇することが確認された。10μmサイズのビーズのほとんどは、PZT電圧の5Vで中央に集中していました。この結果により、シングルチャンネルファンクションジェネレータで3.66MHzの共振周波数を生成し、パワーアンプを用いて一般信号を16dB(約9倍)増幅しました。
表3 は、本試験で用いた音響流体チップに1 μm(セルサイズ)と10 μm(アプタマー付着ビーズ)のマイクロビーズ混合物を注入し、出口流量(400、450、475 μL/min)によるチップ分離性能を評価した結果である。回収率は、注入された10μmサイズのビーズの総数に対する出口で回収したビーズ数の割合で、それぞれ98%±2.2%、98%±2.5%、90%±9.8%であった。純度は、収集されたビーズの総数に対する10μmサイズのビーズの数の割合であり、それぞれ97.1%±3.6%、97.6%±2.4%、および99.4%±0.6%であった。これは、この装置が10μmのサイズのビーズに対して高い分離効率を有することを示している。
図6 は、ビーズ当たりの細菌結合数の画像及びグラフを示す。ターゲットサンプルと廃棄物サンプルに関する音響泳動チップ操作に関するデータは、それぞれ出口と入口で収集されました。全てのサンプルを採取管で10-μLサンプリングを行い、マイクロビーズに結合する菌数を蛍光顕微鏡下で観察した。多くのGN細菌(例えば 、E. 大腸菌 DH5α)は全てのビーズに結合しているが、一方、少数のGP細菌(例えば、 リステリア・グレイ)はいくつかのビーズに結合している。各アプタマー修飾マイクロビーズ(25個のビーズ中)に結合したGNおよびGP細菌の数を、高速度カメラ付き顕微鏡を用いて測定した。5つのGN細菌すべてがビーズに結合し(それぞれ4.96±0.77)、有意に少ないGP細菌が試験した物質(それぞれ0.08±0.08)に結合した。シグナル強度はGN細菌とGP細菌とで有意に異なっていた。これらのデータは、この装置がGN細菌の単離に成功したことを確認する。
図1:マイクロチャネルの概略図、音響泳動によるマイクロビーズの中央位置合わせ、およびターゲットの収集。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アプタマーアフィニティービーズを用いたGN細菌の分離のためのマイクロ流体音響泳動チップのCAD画像。(B)上部ガラス層。(1~4の寸法については、表1を参照のこと)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:音響泳動マイクロデバイスの構造。(A)フロアプロット、(B)断面図、および(C)デバイスの写真。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞を分離および収集するために使用される音響流体システムの概略図。サンプルまたは緩衝液は、フローコントローラを介して入口ポートに注入されます。ビーズセンタリングとサンプル分離のために、AC電力は、パワーアンプを備えたファンクションジェネレータを介してPZTに印加され、マイクロチャネルに音響放射力を生成する。分離されたターゲットサンプルは収集管を通して回収され、残りの廃液は別の出口を通して回収される。高速カメラモジュールを使用して、分離を視覚化します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PZT電圧の関数としてのビーズの流れの画像。 (A)PZT OFF、(B)PZT 0.1 V、(C)PZT 0.5 V、(D)PZT 5 V 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:アプタマー修飾マイクロビーズに結合したGN(大腸菌 DH5α)およびGP(Listeria grayi)細菌の数 (n=25、エラーバー=標準誤差)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 数 | デバイス | 幅(W)または直径(D)(μm) |
| 1 | 入口ポートと出口ポート(シリコン) | 1000(D) |
| 2 | マイクロ流体チャネル | 200 (W) |
| 3 | 入口と出口のチャンネル | 400 (W) |
| 4 | 入口ポートと出口ポート(ガラス) | 1500(D) |
表1:空気圧マイクロ流体プラットフォームの寸法 ( 図2の1〜4)。
| GNバクテリア | GPバクテリア |
| 大腸菌 (DH5α) | バチルス・メガテリウム (KCTC 1021) |
| エンテロバクター・クロアカエ | 表皮ブドウ球菌 |
| スフィンゴモナス・インスラエ | リステリア・グレイ |
| 大腸菌KCTC 2571 | エンテロコッカス・タイランディカス |
| シュードモナス・ピクトルム | ブドウ球菌パストゥリ |
表2:研究したGNおよびGP細菌。
| ワット出口での流量(μL/分) | 回収率(%) | 純度(%) |
| 400 (5 倍の体積連結) | 98 ± 2.2 | 97.1 ± 3.6 |
| 450 (10 倍の体積連結) | 98 ± 2.5 | 97.6 ± 2.4 |
| 475 (20 倍の体積連結) | 90± 9.8 | 99.4 ± 0.6 |
表3:分離の回収率及び純度
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Discussion
培養試料中のGN細菌を、その大きさや種類に応じた連続走行法に基づき、高速で捕捉・移送する音波浮上マイクロ流体装置と、アプタマー修飾マイクロビーズを開発しました。長い正方形のマイクロチャネルにより、以前に報告された20、21、22、23、24、25、26よりもシンプルな設計と2D音響泳動のコスト効率が向上します。この装置は、10倍の用量濃度まで>98%の回収率を有する。この研究は、細菌を分離するための既存のラベルフリー方法20、21、22、23、24および親和性ビーズ方法25、26よりも高い回収率および純度を示す。このことは、本装置が細菌を効率的に分離できることを示唆している。しかし、10μmビーズはサイドチャネルに流入できるため、性能試験における音響放射を遮断する閉じた出口から生じる強い引き抜き力により、20倍の線量濃度で回復率は90%に低下する。チップ上の回収率は98%に達することができますが、吸入器内のビーズの沈殿や吸入器をチップに接続するチューブの目詰まりなど、いくつかの要因が回収率を低下させます。
この音響フォレティックチップを作り、それを動作させるために必要ないくつかの重要なポイントがあります。PZTの取り付けに使用する接着剤は、波形の精度のためにできるだけ使用せず、PZTとマイクロチャネルは平行でなければなりません。このステップでエラーが発生すると、PZTを介してチップに誤った波形が送信され、ビーズのミスアライメントとして現れます。また、シリンジからのビーズの沈降や、シリンジからのチップによる接続チューブの閉塞など、いくつかの要因が回収率を悪化させる可能性があるため、操作時には注意してください。
この装置は、細菌感染症の早期診断の分野で生細菌または細菌由来バイオマーカーを検出するために使用することができるだけでなく、バイオテロリズムおよび病原性細菌感染の同定に役立つ水質汚染の監視にも拡張することができる。
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Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、韓国政府(科学情報化部)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成金によって支援されました。(いいえ。NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
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