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Methodenartikel

Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

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DOI:

10.3791/63308

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1. Dezember 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Methode, einen fluoreszierenden Kalziumfarbstoff durch den geschnittenen Nerv in die motorischen Nervenenden der Maus zu laden. Darüber hinaus wird eine einzigartige Methode zur Erfassung schneller Kalziumtransienten in den peripheren Nervenenden mittels konfokaler Mikroskopie vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Abschätzung des präsynaptischen Kalziumspiegels ist eine Schlüsselaufgabe bei der Untersuchung der synaptischen Übertragung, da der Eintritt von Kalzium in die präsynaptische Zelle eine Kaskade von Ereignissen auslöst, die zur Freisetzung von Neurotransmittern führen. Darüber hinaus vermitteln Veränderungen des präsynaptischen Kalziumspiegels die Aktivität vieler intrazellulärer Proteine und spielen eine wichtige Rolle bei der synaptischen Plastizität. Die Untersuchung der Kalziumsignalisierung ist auch wichtig, um Wege zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen zu finden. Die neuromuskuläre Verbindung ist ein geeignetes Modell für die Untersuchung der synaptischen Plastizität, da sie nur eine Art von Neurotransmittern hat. Dieser Artikel beschreibt die Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch das geschnittene Nervenbündel in die motorischen Nervenenden der Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Abschätzung aller Parameter im Zusammenhang mit intrazellulären Kalziumveränderungen, wie z.B. basaler Kalziumspiegel und Kalziumtransienten. Da der Einstrom von Kalzium von der Zellaußenseite in die Nervenendigungen und dessen Bindung/Unbindung an den calciumsensitiven Farbstoff innerhalb weniger Millisekunden erfolgen, ist ein schnelles Bildgebungssystem erforderlich, um diese Ereignisse aufzuzeichnen. In der Tat werden Hochgeschwindigkeitskameras häufig für die Registrierung von schnellen Kalziumveränderungen verwendet, aber sie haben niedrige Bildauflösungsparameter. Das hier vorgestellte Protokoll zur Erfassung von Calcium-Transienten ermöglicht eine extrem gute räumlich-zeitliche Auflösung durch konfokale Mikroskopie.

Einleitung

Das Problem der Messung schneller Kalziumwellen in erregbaren Zellen ist einer der wichtigsten und herausforderndsten Aspekte bei der Untersuchung der Signalübertragung im zentralen und peripheren Nervensystem. Calciumionen spielen eine wichtige Rolle bei der Auslösung der Freisetzung von Neurotransmittern, der synaptischen Plastizität und der Modulation der Aktivität verschiedener intrazellulärer Proteine 1,2,3,4,5. Die Untersuchung der Kalziumsignalisierung ist auch wichtig, um Wege zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen zu finden6. Um Veränderungen des Kalziumspiegels zu messen, werden üblicherweise fluoreszierende kalziumempfindliche Farbstoffe verwendet, und Änderungen ihres Fluoreszenzniveaus werden analysiert 7,8,9.

Das Laden von Kalziumfarbstoffen in Zellen kann auf verschiedene Arten erreicht werden. Überwiegend werden zellpermierte Farbstoffe verwendet10,11. In einem solchen Fall ist es jedoch nicht nur schwierig, die Konzentration eines Farbstoffs in der Zelle zu kontrollieren, sondern es ist auch schwierig, Zielzellen für die Beladung auszuwählen. Diese Methode ist nicht für die Untersuchung peripherer Nervenenden anwendbar, da der Farbstoff in postsynaptische Zellen eindringt. Stattdessen sind zellimpermeant Farbstoffe für solche Präparate besser geeignet. In diesem Fall werden die Farbstoffe durch Mikroinjektion oder durch eine Patchpipette12,13,14 an die Zellen abgegeben. Es gibt auch eine Methode zum Laden durch einen Nervenstumpf. Die letztere Methode eignet sich am besten für neuromuskuläre Verbindungspräparate 15,16,17,18,19,20. Es ermöglicht die Färbung nur für Zellen von Interesse. Obwohl diese Methode keine genaue Bewertung der Konzentration des Farbstoffs in der Zielzelle liefert, kann die Konzentration ungefähr geschätzt werden, indem der Fluoreszenzgrad der ruhenden Zellen in Lösungen mit einer bekannten Konzentration von Calcium21 verglichen wird. In dieser Studie wird eine Modifikation dieser Methode vorgestellt, die auf Synapsen von Säugetieren angewendet wird.

Der Kalziumeintritt während der depolarisierenden Phase des Aktionspotentials ist ein schneller Prozess, insbesondere in der neuromuskulären Verbindung; Daher ist für seine Registrierung eine geeignete Ausrüstung erforderlich1. Eine aktuelle Studie mit einem spannungsempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff zeigte, dass die Dauer des Aktionspotentials in der peripheren Synapse einer Maus etwa 300 μsbeträgt 22. Calcium transient, bewertet mit Calcium-sensitiven Farbstoffen in den peripheren Synapsen des Frosches, hat eine längere Dauer: Die Anstiegszeit beträgt etwa 2-6 ms und die Zerfallszeit beträgt etwa 30-90 ms, abhängig vom verwendeten Calciumfarbstoff23,24. Um schnelle Prozesse mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen zu messen, werden in der Regel CCD- oder CMOS-Kameras mit schnellen und empfindlichen CCD-Matrizen eingesetzt. Diese Kameras haben jedoch den Nachteil einer niedrigen Auflösung, begrenzt durch die Größe der empfindlichen Elemente der Matrix25,26,27,28. Die schnellsten Kameras mit ausreichender Empfindlichkeit, um sowohl Aktionspotentiale als auch Kalziumtransienten als Reaktion auf niederfrequente Stimulation von Zellen aufzuzeichnen, haben eine Abtastfrequenz von 2.000 Hz und eine Matrix mit einer Abmessung von 80 x 8029. Um Signale mit einer höheren räumlichen Auflösung zu erhalten, wird konfokale Mikroskopie verwendet, insbesondere wenn es notwendig ist, einige volumetrische Änderungen im Signal30,31,32 zu beurteilen. Es sollte jedoch bedacht werden, dass die konfokale Mikroskopie im Zeilenscanmodus eine hohe Scangeschwindigkeit aufweist, aber es gibt immer noch erhebliche Einschränkungen bei der Geschwindigkeit der Aufzeichnung schneller Prozesse bei der Erstellung eines räumlichen Bildes33. Es gibt konfokale Mikroskope auf Basis rotierender Nipkow-Scheiben (Slit-Scanning-Mikroskopie) und Multipoint-Array-Scanner, die eine höhere Scangeschwindigkeit aufweisen. Gleichzeitig sind sie den klassischen konfokalen Mikroskopen in der konfokalen Bildfilterung unterlegen (Pinholes Crosstalk für Mikroskope mit Nipkow-Scheibe)32,34,35. Konfokale Bildgebung mit Resonanzabtastung kann auch eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung liefern, die für hohe zeitliche Messungen erforderlichist 36. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Registrierung schwacher Fluoreszenzantworten bei hoher Abtastgeschwindigkeit bei Verwendung von Resonanztomographen hochempfindliche Detektoren wie Hybriddetektoren36 erfordert.

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Erhöhung der zeitlichen Auflösung von Signalen vor, die mit der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (LSCM) aufgezeichnet wurden, unter Beibehaltung der räumlichen Auflösung37. Das aktuelle Verfahren ist eine Weiterentwicklung der zuvor beschriebenen und auf die LSCM-Plattform38,39,40 übertragenen Methoden. Dieser Ansatz erfordert keine Änderungen in der Mikroskophardware und basiert auf der Anwendung eines Algorithmus zur Aufzeichnung periodisch evozierter fluoreszierender Signale mit einer Zeitverschiebung relativ zum Zeitpunkt der Stimulation.

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Protokoll

Es wurden Experimente an isolierten Nerven-Muskel-Präparaten von Levator auris longus (m. LAL) aus den Mäusen BALB/C (20-23 g, 2-3 Monate alt) durchgeführt41. Die experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung von Labortieren der Kasaner Föderalen Universität und der Kasaner Medizinischen Universität in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Das Versuchsprotokoll entsprach den Anforderungen der Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaften und wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Kasan genehmigt.

1. Vorbereitung der Ringer- und Filing-Lösungen

  1. Bereiten Sie die Ringer-Lösung für den Säugetiermuskel vor, indem Sie die folgenden Zutaten mischen: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH2 PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) und Glucose (11 mM). Blasen Sie durch die Lösung mit 95% O2 und 5%CO2 und stellen Sie den pH-Wert auf 7,2-7,4 ein, indem Sie gegebenenfalls HCl / NaOH hinzufügen.
  2. Bereiten Sie die Farbstoffladelösung vor.
    1. Bereiten Sie HEPES-Lösung (10 mM) mit einem pH-Wert im Bereich von 7,2-7,4 vor. 500 μg handelsüblicher Farbstoff werden in einer 500 μL Durchstechflasche geliefert. Der Farbstoff wird in 14 μL der HEPES-Lösung gelöst, um eine Farbstoffkonzentration von 30 mM zu erhalten. Gut schütteln und zentrifugieren, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
    2. Die Lösung des Ca2+ -Indikators mit HEPES-Lösung auf 1 mM Konzentration verdünnen. Bewahren Sie es in einem Gefrierschrank (-20 °C) auf und vermeiden Sie Lichteinwirkung.

2. Farbstoffbeladungsverfahren

HINWEIS: Das Farbstoffladeverfahren wird gemäß dem Protokoll für die Belastung durch den Nervenstumpf durchgeführt, das an die zuvor veröffentlichten Protokolle 19,42,43,44,45,46 angepasst ist.

  1. Sezieren Sie den LAL-Muskel nach dem Dissektionsverfahren für dieses Präparat, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen47,48 beschrieben.
    1. Fixieren Sie das Gewebe leicht gestreckt (nicht mehr als 30% der ursprünglichen Länge) in der elastomerbeschichteten Petrischale mit feinen Edelstahlstiften und fügen Sie Ringer-Lösung hinzu, bis der Muskel vollständig bedeckt ist.
      HINWEIS: Die Petrischale wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Elastomer vorgefüllt (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie die Füllpipette vor
    1. Bereiten Sie mit einem Mikropipettenzieher (siehe Materialtabelle) eine Mikropipette mit einer möglichst scharfen feinen Spitze für die intrazellulären Aufnahmen vor. Verwenden Sie Kapillaren ohne innere Filamente (1,5 mm Außendurchmesser und 0,86 oder 1,10 mm Innendurchmesser).
    2. Brechen Sie die Mikropipettenspitze ab, nachdem Sie die Verjüngung mit einem Schleifmittel geritzt haben, wobei die Spitze bis etwa 100 μm Durchmesser offen bleibt. Polieren Sie die Spitze auf Begrenzung, wenn der Innendurchmesser von >80 μm auf 12-13 μm schrumpft. Befestigen Sie einen Silikonschlauch auf der einen Seite der Füllpipette und eine Spritze (ohne Nadel) auf der anderen Seite.
  3. Finden Sie unter einem Stereomikroskop die Stelle, an der sich der Nervenstamm in separate Nervenäste verwandelt. Legen Sie die Füllpipette mit dem montierten Röhrchen und der Spritze mit Wachs auf die Petrischale. Bewegen Sie die Pipettenspitze, bis sie über dem Nerv steht.
  4. Schneiden Sie den Nerv mit einer feinen Schere in der Nähe der Muskelfaser ab und lassen Sie ein kleines Stück des Nervenstumpfes etwa 1 mm lang. Saugen Sie den Nervenstumpf zusammen mit etwas Ringer-Lösung, ohne ihn einzuklemmen, vorsichtig in die Spitze der Füllungspipette ein. Entfernen Sie den Silikonschlauch aus der Füllpipette.
  5. Ziehen Sie eine gewisse Menge der Farbstoffladelösung (~ 0,3 μL) mit einer Spritze mit einem langen Filament. Dieses Volumen entspricht ca. 3 cm des Filaments.
    HINWEIS: Zunächst ist es notwendig, einen Glühfaden aus einer Pipettenspitze mit einem Volumen von 10 μL herzustellen, indem man mit einer Alkohollampe oder einem Gasbrenner am Feuer zieht.
  6. Führen Sie die Filamentspitze mit Ladelösung vorsichtig in die Füllpipette ein. Geben Sie die Mischung direkt auf den Nervenstumpf ab. Inkubieren Sie das Präparat bei Raumtemperatur bei Dunkelheit für 30 min.
  7. Danach spülen Sie die Zubereitung mit frischer Ringer-Lösung aus und inkubieren Sie bei 25 °C bis zu 2 h in einem Glasbecher mit 50 ml (oder mehr) Ringer-Lösung (die Zubereitung muss mit der Lösung bedeckt werden). Während dieser Zeit erreicht der Farbstoff die Synapsen.

3. Videoaufnahme mit konfokaler Mikroskopie

HINWEIS: Die Registrierung von Kalziumtransienten erfolgt mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (LSCM) (siehe Materialtabelle). Um schnelle Kalziumtransienten zu registrieren, wurde ein Originalprotokoll verwendet, das Aufzeichnungen von Signalen mit einer ausreichenden räumlichen und zeitlichen Auflösung ermöglichte. Die Methode wurde in der Veröffentlichung von Arkhipov etal 37 ausführlich beschrieben. Das Mikroskop wurde mit einem 20-fach Wasserimmersionsobjektiv (1,00 NA) ausgestattet. Die 488-nm-Laserlinie wurde auf 10% Intensität abgeschwächt und die Emissionsfluoreszenz von 503 bis 558 nm gesammelt.

  1. Montieren Sie das Präparat in die siliziumelastomerbeschichtete Experimentierkammer und fixieren Sie es, leicht gestreckt, mit einem Satz Stahl-Mikronadeln. Spülen Sie das Präparat ausgiebig mit Ringer-Lösung aus.
    HINWEIS: Es wurde eine einfache, maßgeschneiderte Perfusionsversuchskammer aus organischem Glas verwendet, deren Boden mit einem Elastomer bedeckt war (hergestellt nach den Anweisungen des Herstellers; siehe Materialtabelle). Die Kammer verfügt über ein Lösungsversorgungsrohr. Die Lösung wird über eine Spritzennadel abgepumpt, die auf einer Magnethalterung montiert ist (siehe Materialtabelle). Als Versuchskammer könnte eine Petrischale verwendet werden (wie diejenige, die für die Inkubation der Zubereitung verwendet wird), jedoch mit angeschlossenen Versorgungs- und Saugrohren.
  2. Installieren Sie eine Saugelektrode, die zur Stimulation des Nervs verwendet wird.
    HINWEIS: Die Konstruktion der Elektrode ähnelt dem, was 2015 in der Arbeit von Kazakov et al49 veröffentlicht wurde. Platzieren und fixieren Sie die Elektrode durch Wachsen neben dem Bad. Bewegen Sie die Spitze nahe am Nervenstumpf und saugen Sie sie in die Elektrode ab.
  3. Montieren Sie die Vorbereitungskammer auf dem Mikroskoptisch und legen Sie die Ein- und Auslassarmaturen in die Kammer.
  4. Um die Zubereitung zu durchbluten, verwenden Sie ein einfaches, schwerkraftgetriebenes System. Schalten Sie die Perfusionssaugpumpe ein, um die überschüssige Lösung zu entfernen.
  5. Stecken Sie die stimulierende Saugelektrode in einen elektrischen Stimulator und stellen Sie sicher, dass nach Reizen Muskelkontraktionen auftreten. Siehe Abschnitt 3.9-3.12 für Stimulationsbedingungen und Aufzeichnung.
  6. Füllen Sie das Perfusionssystem mit der Ringer-Lösung mit d-Tubocurarin (10 μM).
    HINWEIS: Diese Lösung hilft, Muskelkontraktionen zu verhindern. D-Tubocurarin- oder alpha-Bungarotoxin-spezifische Blocker von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren auf der postsynaptischen Membran würden Muskelkontraktionen ganz oder teilweise blockieren50. Auch zur Verhinderung von Muskelkontraktionen könnten spezifische Blocker postsynaptischer Natriumkanäle wie μ-Conotoxin GIIIB verwendet werden51.
  7. Schalten Sie die Perfusionssaugpumpe ein und starten Sie die Perfusion des Präparats mit der Ringer-Lösung, die d-Tubocurarin enthält.
  8. Stellen Sie die Imaging-Parameter in der LSCM-Software wie folgt ein.
    1. Wählen Sie in der LSCM-Software (LAS AF; siehe Materialtabelle) die Option Elektrophysiologie.
      HINWEIS: Wenn in diesem Modus ein Bild zum Zeitpunkt aufgenommen wird, wird mit Hilfe der Triggerbox ein Synchronisationsimpuls an den Stimulator gesendet. Dies löst die Erzeugung von Aktionspotentialen in der Zubereitung aus (Abbildung 1; Stimulatoreinheit).
    2. Wählen Sie Erfassungsmodus. Um den Stimulator mit dem Mikroskop-Synchronisationsimpuls auszulösen, wählen Sie in den Einstellungen des Menüs Job die Trigger-Einstellungen . Legen Sie das Feld Trigger Out On Frame auf den Kanal out1 fest.
    3. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Scan-Modus: XYT, Scanfrequenz: 1400 Hz, Zoomfaktor: 6.1, Pinhole: vollständig geöffnet. Stellen Sie sicher, dass der sequentielle Transpassing-Modus Bidirektional X aktiviert ist.
    4. Legen Sie die Mindestzeit für die Bildung eines Frames auf 52 ms und die Frames, die in einem Rohvideo erfasst werden sollen, auf 20 Frames fest.
      HINWEIS: Diese Einstellungen ermöglichen die Bildaufnahme mit einer Auflösung von 128 x 128 Pixeln, während alle 52 ms ein einzelnes Bild aufgenommen wird.
    5. Stellen Sie die Anregungswellenlänge des Argonlasers auf 488 nm mit 8% der Ausgangsleistung ein.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Das Schema des Versuchsaufbaus. 1. Konfokales Laserscanning-Mikroskop (LSCM). 2. Synchronisationsmodul von LSCM (Triggerbox). 3. Stimulator. 4. Isoliereinheit. 5. Die biologische Probe. 6. Saugelektrode zur elektrischen Stimulation des Nervs. 7. Perfusionssysteme (7a: Perfusatbehälter, 7b: Tropfer, 7c: Durchflussregler, 7d: Isolierflasche). Pfeile zeigen auf die Ausbreitungsrichtung des synchronisierenden Impulses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Drücken Sie die Live-Modus-Taste, um in den Live-Modus zu wechseln, wodurch eine Vorschau der mit dem Farbstoff beladenen Nervenenden angezeigt wird.

figure-protocol-2
Abbildung 2: Mausnerv und -terminals mit dem Ca2+ Indikator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Stimulationseinheit
    ANMERKUNG: In dieser Arbeit wurde der im Artikel von Land et al.52 beschriebene Stimulator verwendet. Dieses Gerät ermöglicht die Einstellung der zeitlichen Parameter der Stimulation über die MatLab-Software.
    1. Erstellen Sie eine neue Datei, fügen Sie den Code aus dem oben genannten Artikel in das MatLab-Codefenster ein und speichern Sie die Datei. Klicken Sie auf Ausführen, um ein Fenster mit Stimulationsparametern zu sehen. Stellen Sie die Verzögerungszeit und die Dauer des Stimulus ein.
      HINWEIS: Die Verzögerung bestimmt die zeitliche Auflösung des rekonstituierten Fluoreszenzsignals. Der elektrische Impuls von 0,2 ms Dauer wird verzögert und dann an die Isoliereinheit gesendet. Letzterer bildet die Amplitude und Polarität des Stimulationsimpulses und isoliert das biologische Objekt elektrisch vom Aufzeichnungsgerät.
    2. Um den Nerv zu stimulieren, wählen Sie eine supramaximale Amplitude des stimulierenden Impulses (25% -50% größer als die maximale Stimulationsintensität, die erforderlich ist, um alle Nervenfasern zu aktivieren).
      HINWEIS: Die vorgestellte Methode basiert auf einem speziellen Algorithmus für die Aufzeichnung einzelner schneller Fluoreszenzsignale unter Verwendung von LSCM mit dem minimierten Sweep. Bei jedem Schritt des entwickelten Algorithmus wird das aufgezeichnete Fluoreszenzsignal vom vorherigen um ein Zeitintervall verschoben, das kürzer ist als der Mikroskop-Sweep. Der Wert der Zeitverschiebungen bestimmt die zeitliche Auflösung des erforderlichen Signals. Die Anzahl der Schritte (Verschiebungen) im Algorithmus hängt von der erforderlichen zeitlichen Auflösung und der ursprünglichen zeitlichen Auflösung ab. Bei dieser Registrierungsmethode wird die Stimulation der Zubereitung mit einer Frequenz von 0,25 Hz durchgeführt.
  2. Suchen Sie im Live-Modus nach dem ROI und erhalten Sie den besten Fokus. Führen Sie die Datenerfassungssoftware aus.
  3. Verschieben Sie die Verzögerung am Stimulator um 2 ms weniger als der vorherige Wert und führen Sie die Datenerfassungssoftware aus.
  4. Wiederholen Sie Schritt 3.11 26 Mal, um 26 Sequenzen zu erfassen, wobei jede Sequenz um 2 ms von der vorherigen verschoben wird.

4. Videobearbeitung

HINWEIS: Eine Reihe von Videobildern, die mit dem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, werden im TIFF-Format mit der freien Software LAS X exportiert (siehe Materialtabelle). Diese Serie wurde in Rahmen unterteilt und in einen Ordner exportiert. Zur Erzeugung der Bildsequenz mit höherer Zeitauflösung wurde die ImageJ-Software verwendet, die über einen offenen Initialcode zur Analyse und Verarbeitung der Daten verfügt. Der Algorithmus der Signalverarbeitung ist schematisch in Abbildung 3 dargestellt.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Schema zum Kompilieren einer hochauflösenden Videodatei (2 ms im Bild) aus Originalvideodateien mit niedriger zeitlicher Auflösung (52 ms im Bild). Die Original-Videodateien und die entsprechenden Signale sind in Schwarz, Magenta und Grün eingefärbt. Die kompilierte Videodatei und das resultierende Signal sind rot eingefärbt. Das Schema rechts, Zeile für Zeile, zeigt die mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommenen Videobilder. Links ändern sich die entsprechenden Fluoreszenzsignale vom ausgewählten ROI. Die oberste Linie wird Frame für Frame aus den empfangenen Frames nach dem Schema gebildet. Das Ergebnis ist ein Videobild, das aus dem gesamten Frame-Array besteht, so dass es eine Verzögerungszeit von 2 ms zwischen den Frames anstelle von 52 ms gibt. Jede Zeile entspricht einem Offset des Stimulationssignals um (n - 1) * t, wobei t die Zeitverschiebung (2 ms) und n die Anzahl der Shift-Iterationen ist. k bezeichnet die Anzahl der Bilder in den Originalvideodateien (Zeilen 2-4) und hängt von der Dauer des aufgezeichneten Signals ab. In diesem Fall ist es notwendig, k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms) auszuwählen, um ein Signal mit einer Dauer von 1 s zu registrieren. t0 ist die erforderliche Verzögerung vor der Stimulation. Um die Anzahl der Shift-Iterationen n zu berechnen, muss die anfängliche zeitliche Auflösung zwischen Frames (52 ms) durch die erforderliche zeitliche Auflösung (2 ms) dividiert werden. In diesem Fall ist n = 26, was 26 registrierten Sweeps entspricht. Als Ergebnis der durchgeführten Manipulationen wird ein Videobild bestehend aus n * k = 520 Bildern erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Führen Sie die LAS X-Software aus. Öffnen Sie das Projekt, das während des Ausführens des Experiments erstellt wurde. Klicken Sie auf Exportieren und dann auf Speichern unter , um Frames im .tiff Format im Zielordner zu speichern.
  2. Führen Sie die ImageJ-Software aus. Klicken Sie auf Datei > > Bildsequenz importieren.
  3. Wählen Sie im Fenster Bildsequenz öffnen den Zielordner aus und öffnen Sie den ersten Frame.
  4. Legen Sie im Fenster Sequenzoptionen im Feld Startbild die Bildnummer für den ersten Frame auf 1 fest. Setzen Sie im Feld Inkrement den Wert auf die Anzahl der Frames in der ersten Signalaufzeichnung (20 für den vorliegenden Fall) und klicken Sie auf OK.
  5. Um die generierte Datei der zusammengefügten ersten Frames in einem separaten Ordner zu speichern, klicken Sie auf Datei > > Ordner speichern.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.5 für die nächsten 19 Frames. Legen Sie im Fenster Sequenzoptionen die entsprechende Bildnummer im Feld Startbild fest.
  7. Um das vollständige Video mit hoher Zeitauflösung zu erzeugen, fügen Sie alle Frames zusammen. Klicken Sie dazu auf Datei > > Bildsequenz importieren und wählen Sie 1 in den Feldern Startbild und Inkrement . Das Ergebnis ist das finale Video mit erhöhter zeitlicher Auflösung. Speichern Sie die Datei in .tiff oder einem anderen geeigneten Format.

5. Videoanalyse

HINWEIS: Wählen Sie in ImageJ ROI und Hintergrund aus. Subtrahieren Sie den Hintergrund vom ROI. Die Daten werden als Verhältnis (ΔF / F 0 - 1) * 100% dargestellt, wobei F0 die Intensität der Fluoreszenz in Ruhe und ΔF die Intensität der Fluoreszenz während der Stimulation ist.

  1. Klicken Sie auf Image > Stacks > Tools > Stack Sorter. Klicken Sie dann auf Analyse > Tools > ROI Manager.
  2. Ziehen Sie die in Schritt 4.7 gespeicherte .tiff Datei per Drag & Drop in das ImageJ-Fenster. Erweitern Sie das Bild für eine bessere Ansicht. Um die Bildvisualisierung zu verbessern, klicken Sie auf Bild > Helligkeit/Kontrast >anpassen > Auto. Dieser Schritt wirkt sich nicht auf die Daten aus.
  3. Stellen Sie den Hintergrund in der Nähe des Nervenendes ein, indem Sie ROI zeichnen. Fügen Sie es dem ROI-Manager hinzu. Berechnen Sie den Hintergrund, indem Sie auf Mehr > Multi Measure klicken. Kopieren Sie Mittelwerte, fügen Sie sie in das Tabellenkalkulationsprogramm ein und berechnen Sie den Mittelwert.
  4. Subtrahieren Sie den berechneten Durchschnittswert von den Stapeln, indem Sie auf Prozess > Haupt > Subtrahieren klicken. Geben Sie den Wert ein.
  5. Zeichnen Sie den ROI um ein Nervenende über eine Polygonlinie. Fügen Sie es dem ROI-Manager hinzu.
  6. Messen Sie die Intensität des Nervenendes: Klicken Sie auf Mehr > Multi Messen. Kopieren Sie Mittelwerte, und fügen Sie sie in das Tabellenkalkulationsprogramm ein.
  7. Berechnen Sie den durchschnittlichen Offset von Signalen.
    HINWEIS: Verwenden Sie die entsprechenden Punkte abhängig von der Verzögerungszeit vor der Stimulation. In diesem Schritt wird der Wert F0 festgelegt, der in nachfolgenden Berechnungen verwendet wird.
  8. Teilen Sie die Signalwerte durch den durchschnittlichen Offset-Wert.
    HINWEIS: Nach diesem Schritt enthält das Signal nicht den Beitrag des Hintergrunds und der Rohfluoreszenz zu den Amplitudenwerten für den ausgewählten ROI.
  9. Subtrahieren Sie 1 von den in Schritt 5.8 erhaltenen Werten und multiplizieren Sie dann mit 100%.
  10. Zeichnen Sie einen Graphen von Ca2+- transient und berechnen Sie die Amplitude.

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Ergebnisse

Nach Beladung des Präparats mit Farbstoff gemäß der vorgestellten Technik wiesen die meisten Synapsen, die sich in der Nähe des Nervenstumpfes befanden, ein ausreichendes Maß an Fluoreszenz auf (siehe Abbildung 2). Nach Beladungsvorbereitung mit dem Farbstoff und Anwendung der beschriebenen Registrierungs- und Bildverarbeitungsmethode wurden Calciumtransienten mit der gewünschten räumlichen und zeitlichen Auflösung erhalten (siehe Abbildung 4). Der Calcium-Trans...

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Diskussion

Die Methode zum Laden von Ca2+-empfindlichem Farbstoff in Mausnervenenden durch den Nervenstumpf und zur Registrierung eines schnellen Kalziumtransienten mit einem konfokalen Mikroskop wird in diesem Artikel vorgestellt. Als Ergebnis der Implementierung dieser Belastungsmethode wiesen die meisten Synapsen in der Nähe des Nervenstumpfes ein ausreichendes Maß an Fluoreszenz auf, um den Eintritt von Kalzium in die Nervenenden als Reaktion auf eine niederfrequente Stimulation des motorischen Nervs zu registrieren....

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Fluoreszenzstudien dieser Arbeit wurden mit finanzieller Unterstützung des Russian Science Foundation Grant (Projekt Nr. 19-15-00329) durchgeführt. Die Methode wurde unter Finanzierung aus dem Regierungsauftrag für FRC Kazan Scientific Center der RAS АААА-А18-118022790083-9 entwickelt. Die Forschung wurde mit der Ausrüstung des Föderalen Forschungszentrums "Kazan Scientific Center of RAS" entwickelt. Die Autoren danken Dr. Victor I. Ilyin für die kritische Lektüre dieses Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
KapillarglasClark Elektromedizinische Instrumente, UKGC150-10
Konfokal- und Multiphotonenmikroskopsystem Leica TCS SP5 MPLeica Microsystems , Heidelberg, Deutschland
Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher P 97Sutter Instrument, USAP-97
DurchflussreglerKD Medical GmbH Krankenhausprodukte, DeutschlandKD REGEinweg-Infusionsset mit Durchflussregler
HEPESSigma-Aldrich, USAH0887100 ml
Beleuchtungssystem Leica CLS 150XLeica Microsystems, Deutschland
ImageJNational Institutes of Health, USAhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF SoftwareLeica Microsystems, Heidelberg, Deutschland
Las X SoftwareLeica Microsystems, Heidelberg, Deutschlandhttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnethalterung mit SaugschlauchBIOSCIENCE TOOLS, USAMTH-S
Microspin FV 2400Biosan, LettlandBS-010201-AAA
Minutien PinsFine Science Tools, Kanada26002-20
Multispin MSC 3000Biosan, LettlandBS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 PentakaliumsalzMolekulare Sonden, USAO6806500 μ g
PipetteBiohit, Russland7202100,5-10 & Mikro; L
PipettenspitzeBiohit, Russland78134910 & micro; L
Plastilinlokaler Hersteller
Einweg-InjektionsnadelnBbraun100 Sterican0,4-fach; 40 mm
TabellenkalkulationsprogrammMicrosoft, USAMicrosoft Office Excel
Stereomikroskop, Leica M80Leica Microsystems , Deutschland
SaugelektrodeKazakov A. EINFACHE SAUGELEKTRODE ZUR ELEKTRISCHEN STIMULATION BIOLOGISCHER OBJEKTE / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Internationale Forschungszeitschrift. - 2015. - Nr. 9 (40) Teil 3. - S. 13-16.http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 ElastomerDow Corning, USA
Spritzelokaler Hersteller0,5 mL
Spritzelokaler Hersteller60 mL

Referenzen

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