Methodenartikel

Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

DOI:

10.3791/63312

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9. Dezember 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Temple University, 2Department of Bioengineering, Temple University, 3Department of Bioengineering, University of Toledo, 4Biomedical Technology, CFD Research Corporation, 5Center for Inflammation and Lung Research, Department of Microbiology, Immunology and Inflammation, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 6Department of Radiation Oncology, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen Erkrankungen wie Sepsis. Während der Entzündung kann eine übermäßige Migration von aktivierten Leukozyten über das vaskuläre Endothel in Schlüsselorgane zu Organversagen führen. Ein physiologisch relevanter biomimetischer mikrofluidischer Assay (bMFA) wurde entwickelt und validiert unter Verwendung verschiedener experimenteller und rechnerischer Techniken, die die gesamte Leukozyten-Roll-/Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren können, um die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten-Endothelzellen zu untersuchen. Mikrovaskuläre Netzwerke, die aus In-vivo-Bildern bei Nagetieren gewonnen wurden, wurden mit einem GIS-Ansatz (Geographic Information System) digitalisiert und mit Polydimethylsiloxan (PDMS) auf einem Objektträger mikrofabriziert. Um den Einfluss von Scherrate und vaskulärer Topologie auf Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen zu untersuchen, wurde ein CFD-Modell (Computational Fluid Dynamics) entwickelt, um eine entsprechende Karte der Scherraten und Geschwindigkeiten im gesamten Netzwerk zu erstellen. Die bMFA ermöglicht die Quantifizierung von Leukozyten-Endothelzellen-Interaktionen, einschließlich Rollgeschwindigkeit, Anzahl der anhaftenden Leukozyten als Reaktion auf unterschiedliche Scherraten, Anzahl der migrierten Leukozyten, Endothelzellpermeabilität, Adhäsionsmolekülexpression und anderer wichtiger Variablen. Darüber hinaus bietet bMFA durch die Verwendung von humanbezogenen Proben wie menschlichen Endothelzellen und Leukozyten ein Werkzeug für das schnelle Screening potenzieller Therapeutika, um ihre klinische Übersetzbarkeit zu erhöhen.

Einleitung

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Entzündung ist die Reaktion des Wirts auf Infektionen und Verletzungen, und das Endothel spielt eine wichtige Rolle bei der Entzündungsreaktion 1,2,3. Entzündliche Dysregulation ist die zugrunde liegende Ursache für eine Reihe von Krankheitspathologien wie Sepsis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Asthma, entzündliche Darmerkrankungen, Krebs und COVID-19. Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen spielen bei diesen entzündlichen Erkrankungen eine zentrale Rolle. Während der Entzündung aktiviert die Freisetzung von PAMPS (pathogen-assoziierte molekulare Muster) aus Krankheitserregern oder DAMPS (schadensassoziierte molekulare Muster) aus verletztem Gewebe Immunzellen, um Zytokine/Chemokine und andere proinflammatorische Mediatoren freizusetzen, die zur Aktivierung von Endothel führen, was zu Veränderungen der vaskulären Endothelbarrierefunktion und erhöhter Permeabilitätführt 3,4 . Eine erhöhte Aktivierung von Endothelzellen während einer Entzündung führt zu einer verstärkten Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen, was zu einer übermäßigen Migration aktivierter Leukozyten über das vaskuläre Endothel in Schlüsselorganeführt 1,5,6,7.

Die Rekrutierung von Leukozyten wird durch chemisch vielfältige Chemoattraktantien eingeleitet, die aus bioaktiven Lipiden, Zytokinen, Chemokinen und Komplementkomponenten bestehen 8,9. Die Leukozytenrekrutierung ist ein mehrstufiger Prozess, der fünf diskrete Schritte umfasst: 1) Leukozytenmarge und -einfang / -bindung, 2) Rollen, 3) fester Arrest, 4) Ausbreitung und Crawling und 5) Extravasation / Migration (Abbildung 1). Jeder Schritt dieses Prozesses erfordert ein Übersprechen zwischen Leukozyten und Endothelzellen, um dieses dynamische Phänomen zu orchestrieren1,9. Letztendlich extravasieren festsitzende Leukozyten über das Endothel hinaus zu entzündetem Gewebe über einen mehrstufigen Prozess, der durch gleichzeitige chemoattraktorabhängige Signale, Klebeereignisse und hämodynamische Scherkräfte 1,9,10,11,12 gesteuert wird.

Angesichts der zentralen Rolle der Scherspannung bei der Regulierung der Endothelzellfunktion und der Bedeutung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen13 wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere In-vitro-Modelle entwickelt, um verschiedene Aspekte der Leukozytenmigrationskaskade in einer kontrollierteren Umgebung zu untersuchen14. Traditionelle fluidische Geräte zur Untersuchung von Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen können in zwei große Kategorieneingeteilt werden 14: a) Vorrichtungen zur Untersuchung des Leukozytenrollens, der Adhäsion und der Adhäsionsmolekülexpression wie parallele Plattenflusskammern und b) Vorrichtungen zur Untersuchung der Leukozytenmigration unter statischen Bedingungen wie Transwell-Kammern. Systeme wie parallele Plattenströmungskammern wurden verwendet, um die Rolle von Adhäsionsmolekülen und ihren Liganden in der Adhäsionskaskade unter Scherkräften15 zu untersuchen. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch, dass diese vereinfachten, idealisierten Geräte (z. B. gerader Kanal) nicht in der Lage sind, den Maßstab und die Geometrie der In-vivo-Mikrovaskulatur (z. B. aufeinanderfolgende Gefäßverzweigungen, Gefäßmorphologie) und die daraus resultierenden Strömungsbedingungen (z. B. konvergierende oder divergierende Strömungen bei Bifurkationen) zu reproduzieren. Infolgedessen können diese Geräte nur die Adhäsion, aber nicht die Transmigration modellieren. Transwell-Kammern können die Transmigration nur unter statischen Bedingungen untersuchen, ohne die in vivo geometrischen Eigenschaften und Strömungsbedingungen zu berücksichtigen. Daher ahmen diese traditionellen Modelle nicht die Mikroumgebung lebender Gewebe nach oder lösen Adhäsions- und Migrationskaskade in einem einzigen Assay6 auf.

Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir einen neuartigen biomimetischen 3D-mikrofluidischen Assay (bMFA) entwickelt und umfassend validiert (Abbildung 2), der in vivo mikrovaskuläre Netzwerke auf einem Chip16,17,18 realistisch reproduziert. Das Protokoll zur Mikrofabrikation dieses Gerätes wurde bereits17 veröffentlicht und wird hier nur kurz beschrieben. Die Mikrovaskulatur des Maus-Cremaster-Muskels wurde mit einem modifizierten GIS-Ansatz (Geographic Information System)19 digitalisiert. Dann wurde das synthetische mikrovaskuläre Netzwerk auf Polydimethylsiloxan (PDMS) mittels Soft-Lithographie-Verfahren basierend auf dem digitalisierten mikrovaskulären Netzwerk 14,17,20,21,22 erzeugt. Kurz gesagt, die digitalisierten Netzwerkbilder wurden auf Mylar-Film gedruckt, der dann als Maske verwendet wurde, um einen SU-8-positiven Fotolack auf einem Siliziumwafer zu mustern, um die Master für die Herstellung zu erstellen. Mikrofabrizierte Säulen (10 μm Durchmesser, 3 μm hoch) wurden verwendet, um die 3 μm hohen und 100 μm breiten Poren zu erzeugen, eine optimale Größe für die Leukozytenmigration23,24,25, die die Gefäßkanäle und Gewebekompartimente verbinden. PDMS wurde nach Herstellerangaben vorbereitet und über die entwickelten Master gegossen. Darüber hinaus wurde das PDMS entgast und über Nacht in einem Ofen (65 °C) aushärten gelassen, um komplementäre Mikrokanäle in PDMS zu erzeugen. Anschließend wurde das ausgehärtete PDMS vom SU-8-Master abgezogen, gefolgt von Stanzanschlüssen für Ein- und Ausgänge. Dann wurde das PMDS mit einem Glasobjektträger mit Plasma verbunden. Die Oberfläche des mikrofluidischen Bauelements besteht aus nativem Glas und PDMS. Um die Zellanlagerung, -ausbreitung und -proliferation zu fördern, ist eine extrazelluare Matrixbeschichtung (ECM) erforderlich. Der bMFA umfasst ein mikrovaskuläres Netzwerk und ein Gewebekompartiment, das über 3 μm hohe und 100 μm breite Poren verbunden ist (Abbildung 2). Dieses mikrofluidische System reproduziert die gesamte Leukozytenadhäsions-/Migrationskaskade in einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung eines vollständigen mikrovaskulären Netzwerks mit miteinander verbundenen Gefäßen und Verzweigungen, einschließlich Zirkulation, Randbildung, Rolling, Adhäsion und Migration von Leukozyten in das extravaskuläre Gewebekompartiment in einem einzigen System 14,16,17,21,26.

Es sollte beachtet werden, dass selbst wenn die Durchflussrate am Einlass von bMFA fest ist, die Strömungsbedingungen im Netzwerk an verschiedenen Stellen variieren und nicht mit einer einfachen mathematischen Formel berechnet werden können. Ein auf Computational Fluid Dynamics (CFD) basierendes Modell wurde entwickelt, um verschiedene Strömungsparameter (z. B. Schubspannung, Schubgeschwindigkeit, Geschwindigkeit) an verschiedenen Stellen im Netzwerk zu berechnen. Dieses CFD-Modell wurde verwendet, um die Farbstoffperfusionsmuster und Durchflussparameter in der bMFA zu simulieren. Die Kreuzvalidierung mit experimentellen Ergebnissen deutete darauf hin, dass die Strömungswiderstände im gesamten Netzwerk vom Berechnungsmodell gut vorhergesagt werden (Abbildung 3)17. Dieses CFD-Modell wurde dann verwendet, um die Geschwindigkeit und das Schubratenprofil in jedem Behälter von bMFA zu schätzen (Abbildung 4), was eine Analyse der Auswirkungen von Scherfluss und Geometrie auf das Walzen, die Adhäsion und die Migration von Leukozytenermöglichte 16. Leukozyten haften bevorzugt in der Nähe von Bifurkationen und in Regionen mit geringer Scherung in vivo, und diese räumlichen Muster der Leukozytenadhäsion wurden in bMFA unter Verwendung von Neutrophilen erfolgreich nachgewiesen (Abbildung 5)16. Dieses Papier beschreibt das Protokoll zur Vorbereitung von bMFA zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion unter entzündlichen Bedingungen unter Verwendung von humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HLMVEC) und menschlichen Neutrophilen. Mikrophysiologische Systeme, wie die bMFA, können verwendet werden, um Endothelzellinteraktionen mit verschiedenen Zelltypen wie Neutrophilen, Monozyten, Lymphozyten und Tumorzellenzu untersuchen 18,27,28,29,30. Der bMFA kann mit primären Endothelzellen aus verschiedenen Organen (z. B. Lunge vs. Gehirn) und verschiedenen Spezies (z. B. menschliche vs. murine Endothelzellen) sowie mit Endothelzelllinien21,27,31,32 gesät werden. Der bMFA kann verwendet werden, um multiple zelluläre Reaktionen, Zell-Zell-Interaktionen, Barrierefunktion, Arzneimittelabgabe und Arzneimitteltoxizität zu untersuchen.

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Protokoll

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Heparinisiertes menschliches Blut wird zur Neutrophilenisolierung von gesunden erwachsenen Spendern (Männer und Frauen im Alter zwischen 21 und 60 Jahren) nach Einverständniserklärung, wie vom Institutional Review Board der Temple University (Philadelphia, PA, USA) genehmigt, gewonnen.

1. Grundierung und Beschichtung des Geräts mit humanem Fibronektin

HINWEIS: Der bMFA verfügt über zwei Einlassanschlüsse und zwei Auslassanschlüsse, die mit dem Gefäßfach verbunden sind. Es hat auch einen Anschluss, der mit dem Gewebefach verbunden ist (Abbildung 2).

  1. Führen Sie Schläuche (O.D. von 0,06" und I.D. von 0,02") (Tabelle des Materialss) in alle Anschlüsse mit Ausnahme eines Einlassanschlusses mit Feinpunktzange ein. Klemmen Sie die beiden Auslassöffnungen und den Gewebefachanschluss mit Kieferklemmen ein. Stellen Sie sicher, dass jeder Schlauch ~ 1 Zoll lang ist.
  2. Humanes Fibronektin mit PBS aus Fibronektin-Stammlösung (1 mg/ml) auf 100 μg/ml verdünnen. Laden Sie eine 1-ml-Spritze mit vorbereiteter Fibronektinlösung. Schließen Sie die Spritze an eine 24 G stumpfe Nadel und einen ~ 4 Zoll langen Schlauch an.
    HINWEIS: Um eine Vernetzung zu verhindern, übermischen / pipettieren Sie menschliches Fibronektin. Andere extrazelluläre Matrizen (ECM) wie Kollagen können für verschiedene Zelltypen verwendet werden.
  3. Führen Sie den Schlauch in den offenen Einlassanschluss ein, drücken Sie den Kolben, bis menschliches Fibronektin aus dem anderen Einlassanschluss kommt, und klemmen Sie ihn dann ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Rest der Ports, bis alle Kanäle, das Gewebefach und der Schlauch mit der menschlichen Fibronektinlösung gefüllt sind. Entfernen Sie die Nadel, aber halten Sie den 4 Zoll langen Schlauch eingelegt und ungeklemmt.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schlauch mit Fibronektin gefüllt ist, bevor er eingespannt wird.
  4. Zum Entgasen schließen Sie den ungespannten Schlauch über den pneumatischen Primer an einen komprimierten Stickstofftank an, stellen den Druck auf ~ 5 psi ein und laufen für ~ 15 min.
  5. Überprüfen Sie nach 15 Minuten unter dem Mikroskop, ob keine Luftblasen im Gerät eingeschlossen sind. Wenn im Kanal oder Gewebefach Luftblasen eingeschlossen sind, schließen Sie das Gerät zur erneuten Entgasung wieder an den pneumatischen Primer an, d. h. wiederholen Sie Schritt 1.4.
    HINWEIS: Das inverse Mikroskop wird in allen Schritten der Mikroskopie in diesem Protokoll verwendet.
  6. Entfernen Sie das Gerät aus der pneumatischen Grundierung. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 °C für 1 h und spülen Sie dann alle Kanäle und das Gewebefach mit vorgewärmten HLMVEC-Kulturmedien (Table of Materials), ähnlich wie in Schritt 1.3. Der bMFA ist nun bereit für die Zellaussaat.
    HINWEIS: Bevor Sie einen Schlauch aus dem Anschluss entfernen/einsetzen, legen Sie zunächst einen Wassertropfen mit einer Pipette um die Basis des Einlassrohrs, um zu verhindern, dass Luft in das Gerät gelangt.

2. Aussaat von bMFA mit HLMVEC

  1. Kultur HLMVEC zu 60% - 80% Konfluenz gemäß dem Protokoll des Anbieters in einem T-25-Kolben.
  2. Aspirieren Sie HLMVEC-Nährmedien aus dem Zellkulturkolben. Zweimal mit PBS waschen.
  3. 2 ml vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung (37 °C) in den T-25-Kolben geben. 3-5 min in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2) inkubieren, bis sich die meisten Zellen vom Kolben gelöst haben.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit kann für verschiedene Zelltypen und die Trypsin-EDTA-Konzentration variieren.
  4. Geben Sie 2 ml Trypsin-Neutralisationslösung (TNS, 37 °C) in den Kolben, um Trypsin-EDTA zu neutralisieren.
  5. Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie dann die Zellsuspensionslösung in ein 15 ml konisches Rohr.
  6. Zentrifuge für 5 min bei 150 x g , um die Endothelzellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml Zellkulturmedien. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
  7. Zentrigieren Sie erneut für 5 min bei 150 x g , um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen auf die gewünschte Aussaatdichte von 20 x 106 / ml.
    HINWEIS: Abhängig von den Zelltypen und der Konfluenz können etwa 2 x 10 6 Endothelzellen aus zwei T-25-Kolben gesammelt werden, und mit der Aussaatdichte von 20 x 10 6 / ml reichen 100 μL der Zellsuspension (2 x 10 6 Endothelzellen) aus, um 5 Geräte zu säen.
  8. Montieren Sie eine 1-ml-Spritze in die programmierbare Spritzenpumpe, befestigen Sie den Schlauch an der stumpfen Nadel.
  9. Ziehen Sie ~ 20 μL der Zellsuspension in den Schlauch und stellen Sie sicher, dass sich die Zellsuspension nur im Schlauch befindet, nicht im Spritzenfass.
  10. Nehmen Sie die Klemme von einem Auslassanschluss des Geräts ab. Schließen Sie den Schlauch an einen Einlass des Geräts an. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Kanal eingeführt werden.
  11. Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 4-8 μL/min. Beobachten Sie das Gerät unter einem Mikroskop.
  12. Wenn die Kanäle mit Zellen gefüllt sind, stoppen Sie die Pumpe, klemmen Sie den Auslass ein und schneiden Sie den Einlassschlauch ab.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Luftblasen in das Gerät einzubringen.
  13. Stellen Sie das Gerät für 4 h bei 5% CO2 und 37 °C in den Inkubator.
  14. Nach 4 h Inkubation eine weitere Spritze vorbereiten, die mit frischen Zellkulturmedien gefüllt ist. Montieren Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe, schließen Sie die Spritze an den Einlassanschluss an und entfernen Sie die Klemme von einem Auslassanschluss.
  15. Lassen Sie frische Medien für ca. 5 Minuten mit 4-8 μL/min durch das Gerät laufen, um schwimmende/nicht angeschlossene Zellen auszuwaschen.

3. Zellkultur unter Strom für 48 h

  1. Bereiten Sie eine Spritze vor, die mit frischen Zellkulturmedien gefüllt ist. Montieren Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe, schließen Sie die Spritze an einen Einlassanschluss an und halten Sie einen Auslass offen. Stellen Sie das Gerät in den Inkubator (5% CO2, 37 °C).
  2. Programmieren Sie die Spritzenpumpe zur Kultivierung von Endothelzellen unter Durchfluss mit den folgenden Anweisungen in Tabelle 1.
  3. Überprüfen Sie bMFA unter dem Mikroskop nach 48 h Kultur unter dem Fluss. HLMVEC sollte Gefäßkanäle abdecken, die ein vollständiges Lumen bilden (Abbildung 6).
    HINWEIS: Für verschiedene Zelltypen können andere Durchflussregime erforderlich sein.

4. Zytokin und/oder therapeutische Behandlung

HINWEIS: Als Beispiel beschreibt dieser Abschnitt die Verwendung von bMFA zur Untersuchung der Auswirkungen der Behandlung der Zellen mit Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und einem neuartigen entzündungshemmenden Inhibitor (Protein Kinase C delta-TAT peptide inhibitor, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36.

  1. Bereiten Sie drei verschiedene bMFA-Geräte mit dem obigen Protokoll vor (Abschnitt 1-3).
  2. Laden Sie drei 1-ml-Spritzen mit Zellkulturmedien (TNF-α) (10 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) bzw. PKCδ-i (5 μM).
    HINWEIS: Zytokine werden in Zellkulturmedien rekonstituiert.
  3. Verbinden Sie die drei Spritzen mit drei bMFA-Geräten. Behandeln Sie HLMVEC mit Puffer TNF-α oder TNF-α + Inhibitor für 4 h bei 0,1 μL/min.
    HINWEIS: Basierend auf spezifischen Studienanforderungen können andere Zytokine oder Zytokincocktails (z. B. TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ)) zur Behandlung von Endothelzellen verwendet werden.

5. Menschliche Neutrophilenisolation

  1. Verwenden Sie alle Reagenzien bei Raumtemperatur (RT). Zu den Reagenzien gehören Leukozyten-Isolationsmedien, 1x HEPES-Puffer mit Ca 2+/Mg2+ (Tabelle 2), 6% Dextran in normaler Kochsalzlösung (0,9% NaCl), 3,6% NaCl-Lösung und deionisiertes Wasser (DI) Wasser.
  2. Pippen Sie 20 ml Leukozyten-Isolationsmedien in ein 50 ml konisches Röhrchen und schichten Sie 25 ml Blut vorsichtig über die Leukozyten-Isolationsmedien. Zentrifuge für 40 min bei 427 x g bei RT.
    HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt langsam und vorsichtig durch, um eine Vermischung der Blut- und Leukozytenisolationsmedien zu vermeiden.
  3. Aspirieren Sie bis zu ~ 5 ml über der Schicht der roten Blutkörperchen (RBC). Die weiße Buffy-Schicht auf dem RBC besteht überwiegend aus Neutrophilen.
  4. Fügen Sie den HEPES-Puffer hinzu, um das aktuelle Volume zu verdoppeln (vorhandenes Volume: HEPES-Puffer = 1:1).
  5. Fügen Sie einen Betrag von 6% Dextran hinzu, der 20% des endgültigen Volumens entspricht. (aktuelles Volumen/4 = Volumen von hinzugefügten 6% Dextran).
  6. Drehen Sie die Röhre einige Male vorsichtig um, um sich gut zu vermischen und lassen Sie die RBC sedimentieren (~ 25 min).
  7. Pipettieren Sie vorsichtig die obere Schicht (neutrophilenreiche Schicht) und übertragen Sie sie in eine neue 50-ml-Röhre, achten Sie darauf, nicht mit sedimentiertem RBC zu kontaminieren.
  8. Zentrifuge für 10 min bei 315 x g bei RT. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 8 ml HEPES-Puffer.
  9. Um den Rest-RBC zu lysieren, fügen Sie 24 ml DI-Wasser hinzu und mischen Sie vorsichtig für 50 s. Sofort 8 ml 3,6%ige NaCl-Lösung hinzufügen, mischen und zentrifugieren Sie für 10 min bei 315 x g bei RT.
  10. Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie das Zellpellet mit 15 ml HEPES-Puffer und zentrifugieren Sie für 5 min bei 315 x g. Suspendieren Sie das Pellet im HEPES-Puffer.

6. Neutrophiles Adhäsions- und Migrationsexperiment mit bMFA

  1. Resuspendiert die isolierten menschlichen Neutrophilen (15 Millionen) in 999 μL HEPES-Puffer.
  2. 1 μL CFDA-SE (Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester) Farbstoff-Stammlösung (10 mM) in die Neutrophilensuspension geben, um eine Arbeitskonzentration von 10 μM CFDA-SE zu erhalten, und 10 min bei RT inkubieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit HEPES-Puffer, indem Sie 5 min bei 315 x g zentrifugieren.
  3. Zählen Sie die Neutrophilen mit einem Hämozytometer und resuspendieren Sie bei 2 Millionen Neutrophilen / ml mit Zellkulturmedien, TNF-α (10 ng / ml) und TNF-α (10 ng / ml) + PKCδ-i (5 μM); vor Beginn des Experiments 15 Minuten bei RT inkubieren.
  4. Bereiten Sie eine Spritze vor, die mit 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), dem Chemoattraktor für die Studie, in Zellkulturmedien gefüllt ist. Nehmen Sie bMFA und öffnen Sie einen Einlassanschluss und einen Auslassanschluss.
    HINWEIS: Diese experimentellen Bedingungen werden verwendet, um die Bedingungen der Sepsis nachzuahmen, die eine systemische Entzündungsreaktion mit hohen Spiegeln von zirkulierenden Zytokinen / Chemokinen beinhalten. Darüber hinaus wird fMLP, ein gramnegatives, von Bakterien abgeleitetes Peptid, verwendet, um das Vorhandensein von Bakterien in der Lunge (dh im Gewebekompartiment) zu modellieren.
  5. Entfernen Sie den Gewebefach-Port-Schlauch und setzen Sie den fMLP-Schlauch ein. Injizieren Sie ~ 20 μL fMLP in das Gewebekompartiment für alle bMFA, mit Ausnahme des mit Zellkulturmedien allein behandelten. Schneiden Sie dann den Schlauch ab und klemmen Sie ihn ein.
  6. Füllen Sie die Spritze mit ~200 μL der Neutrophilensuspension und montieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe.
  7. Stellen Sie das Gerät auf die inverse Mikroskopstufe (Materialtabelle).
  8. Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 1 μL / min und warten Sie, bis ein kleiner Tropfen der Neutrophilensuspension aus dem Schlauch kommt. Stecken Sie den Schlauch in den Einlassanschluss. Siehe Abbildung 7 für die Einrichtung.

7. Bilder aufnehmen

  1. Verwenden Sie die Scan Large Image-Funktion in der Mikroskop-Bildanalysesoftware (Table of Materials), um die Adhäsionskarte in bMFA (Abbildung 8) 10 Minuten nach Beginn des Experiments zu erhalten. Die meisten Neutrophilen treten während der ersten 10 Minuten in bMFA ein.
    HINWEIS: Lassen Sie das Fluoreszenzlicht ausgeschaltet, wenn Sie keine Bilder aufnehmen, um das Photobleichen zu reduzieren.
  2. Nehmen Sie in der nächsten Stunde Zeitrafferbilder (1 Bild alle 5 Minuten) des Gewebekompartiments (Abbildung 8B, C) für die Migrationsanalyse auf, um die Migrationskarte zu erhalten.

8. Digitale Bildanalyse

  1. Für die Adhäsionskarte zählen Sie die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen in jedem Gefäß. Erstellen Sie für jede Bifurkation einen kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI) mit einem Durchmesser, der dem Zweifachen des Gefäßdurchmessers entspricht, und zählen Sie die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen.
  2. Verwenden Sie die manuelle Zählung oder die automatisierte Objektzählfunktion , um die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen in jedem Gefäß und jeder Verzweigungsregion zu quantifizieren.
  3. Verwenden Sie die Schubratenkarte des Netzwerks, die mit der CFD-Simulation17 generiert wurde, um die Scherrate in jedem Behälter zu bestimmen. Zeichnen Sie dann die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen in einem gegebenen Gefäß gegen die Scherrate in diesem Gefäß auf, um eine Scherratenkarte in bMFA zu erstellen, wie in Abbildung 9A gezeigt.
  4. Neutrophile gelten als migriert, wenn sie das Endothel in das Gewebekompartiment durchquert haben. Zählen Sie die Anzahl der migrierten Neutrophilen bei 10 min, 15 min, 30 min und 60 min. Zeichnen Sie die Anzahl der migrierten Neutrophilen im Vergleich zur Zeit auf, wie in Abbildung 9B dargestellt.

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Ergebnisse

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Nach 48 h Kultur unter Scherfluss in bMFA bedeckten Endothelzellen die Oberfläche der Gefäßkanäle in bMFA und richteten sich in Strömungsrichtung aus (Abbildung 6). Die konfokale Mikroskopie zeigte, dass alle Oberflächen der Gefäßkanäle von Endothelzellen bedeckt waren und ein vollständiges 3D-Lumen in bMFA18 bildeten.

Mit diesem Protokoll kann eine neutrophile Adhäsionskarte gewonnen werden, die zeigt, dass es eine signifikante Adhäsion vo...

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Diskussion

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Der bMFA reproduziert die Topographie und die Strömungsbedingungen der in vivo mikrovaskulären Netzwerke und kann verwendet werden, um die Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen und die Endothelfunktion in vitro unter physiologisch realistischen Bedingungen zu untersuchen. In der Mikrovaskulatur von Maus oder Mensch ist die Geometrie der mikrovaskulären Netzwerke selbstähnlich und fraktal und die Reynolds-Zahl << 1, was darauf hindeutet, dass die Gefäßgeometrie die Strömungsmuster nicht sign...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 und GM134701 (M.F.K. und L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), und Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. und L.E.K.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL SpritzeFisher Scientific14-823-30
Biomimetischer mikrofluidischer Assay (bMFA)SynVivoSMN1-C001Exklusiv bei SynVivo
Blunt NadelJensen GlobalJG24-0.5
CalciumchloridFisher ScientificC70-500
CFDA, SEThermoFisherC1157
Dextran, 250.000, PowderSpectrum Chemical Mfg. CorpDE-130
Ficoll-Paque PremiumGE Health Care17-5442-02Leukozyten-Isolationsmedien
fMLPSigma-AldrichF3506
HepesFisher ScientificAAJ1692630
Humanes FibronektinFisher Scientific33-016-015Verwenden Sie das vom Anbieter empfohlene ECM für verschiedene Zellen lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzacc-3202Mikrovaskuläres endotheliales Zellkulturmedium für die Lunge (HLMVEC).
Menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen der LungeLonzacc-2527verwenden Vedor remommiertes Trypsin-EDTA und TNS
MagnesiumchloridFisher ScientificBP214-500
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments Inc.Mikroskop
NIS-Elemente, 5.20.01Nikon Instruments Inc.Bildgebungssoftware
PBSFisher ScientificMT21040CV
PhD Ultra SpritzenpumpeHarvard Apparatur70-3007Spritzenpumpe
KaliumhydroxidFisher Scientific02-003-763
Rekombinante humane TNF-alphaR& D Systems210-TA
GleitklemmeSynVivo
NatriumchloridFisher ScientificS640-500
Synvivo Pneumatische GrundierungSynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin-Neutralisationslösung (TNS)Lonzacc-5034
Tygon-SchlauchFisher Scientific50-206-8921Schlauch

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
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