In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.
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Methodenartikel
Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen Erkrankungen wie Sepsis. Während der Entzündung kann eine übermäßige Migration von aktivierten Leukozyten über das vaskuläre Endothel in Schlüsselorgane zu Organversagen führen. Ein physiologisch relevanter biomimetischer mikrofluidischer Assay (bMFA) wurde entwickelt und validiert unter Verwendung verschiedener experimenteller und rechnerischer Techniken, die die gesamte Leukozyten-Roll-/Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren können, um die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten-Endothelzellen zu untersuchen. Mikrovaskuläre Netzwerke, die aus In-vivo-Bildern bei Nagetieren gewonnen wurden, wurden mit einem GIS-Ansatz (Geographic Information System) digitalisiert und mit Polydimethylsiloxan (PDMS) auf einem Objektträger mikrofabriziert. Um den Einfluss von Scherrate und vaskulärer Topologie auf Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen zu untersuchen, wurde ein CFD-Modell (Computational Fluid Dynamics) entwickelt, um eine entsprechende Karte der Scherraten und Geschwindigkeiten im gesamten Netzwerk zu erstellen. Die bMFA ermöglicht die Quantifizierung von Leukozyten-Endothelzellen-Interaktionen, einschließlich Rollgeschwindigkeit, Anzahl der anhaftenden Leukozyten als Reaktion auf unterschiedliche Scherraten, Anzahl der migrierten Leukozyten, Endothelzellpermeabilität, Adhäsionsmolekülexpression und anderer wichtiger Variablen. Darüber hinaus bietet bMFA durch die Verwendung von humanbezogenen Proben wie menschlichen Endothelzellen und Leukozyten ein Werkzeug für das schnelle Screening potenzieller Therapeutika, um ihre klinische Übersetzbarkeit zu erhöhen.
Einleitung
Entzündung ist die Reaktion des Wirts auf Infektionen und Verletzungen, und das Endothel spielt eine wichtige Rolle bei der Entzündungsreaktion 1,2,3. Entzündliche Dysregulation ist die zugrunde liegende Ursache für eine Reihe von Krankheitspathologien wie Sepsis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Asthma, entzündliche Darmerkrankungen, Krebs und COVID-19. Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen spielen bei diesen entzündlichen Erkrankungen eine zentrale Rolle. Während der Entzündung aktiviert die Freisetzung von PAMPS (pathogen-assoziierte molekulare Muster) aus Krankheitserregern o....
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Protokoll
Heparinisiertes menschliches Blut wird zur Neutrophilenisolierung von gesunden erwachsenen Spendern (Männer und Frauen im Alter zwischen 21 und 60 Jahren) nach Einverständniserklärung, wie vom Institutional Review Board der Temple University (Philadelphia, PA, USA) genehmigt, gewonnen.
1. Grundierung und Beschichtung des Geräts mit humanem Fibronektin
HINWEIS: Der bMFA verfügt über zwei Einlassanschlüsse und zwei Auslassanschlüsse, die mit dem Gefäßfach verbunden sind. Es hat auch einen Anschluss, der mit dem Gewebefach verbunden ist (Abbildung 2).
- Führen S....
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Ergebnisse
Nach 48 h Kultur unter Scherfluss in bMFA bedeckten Endothelzellen die Oberfläche der Gefäßkanäle in bMFA und richteten sich in Strömungsrichtung aus (Abbildung 6). Die konfokale Mikroskopie zeigte, dass alle Oberflächen der Gefäßkanäle von Endothelzellen bedeckt waren und ein vollständiges 3D-Lumen in bMFA18 bildeten.
Mit diesem Protokoll kann eine neutrophile Adhäsionskarte gewonnen werden, die zeigt, dass es eine signifikante Adhäsion vo.......
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Diskussion
Der bMFA reproduziert die Topographie und die Strömungsbedingungen der in vivo mikrovaskulären Netzwerke und kann verwendet werden, um die Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen und die Endothelfunktion in vitro unter physiologisch realistischen Bedingungen zu untersuchen. In der Mikrovaskulatur von Maus oder Mensch ist die Geometrie der mikrovaskulären Netzwerke selbstähnlich und fraktal und die Reynolds-Zahl << 1, was darauf hindeutet, dass die Gefäßgeometrie die Strömungsmuster nicht sign.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 und GM134701 (M.F.K. und L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), und Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. und L.E.K.) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mL Spritze | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetischer mikrofluidischer Assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exklusiv bei SynVivo |
| Blunt Nadel | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calciumchlorid | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250.000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukozyten-Isolationsmedien |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Humanes Fibronektin | Fisher Scientific | 33-016-015 | Verwenden Sie das vom Anbieter empfohlene ECM für verschiedene Zellen lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Mikrovaskuläres endotheliales Zellkulturmedium für die Lunge (HLMVEC). |
| Menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge | Lonza | cc-2527 | verwenden Vedor remommiertes Trypsin-EDTA und TNS |
| Magnesiumchlorid | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Mikroskop | |
| NIS-Elemente, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Bildgebungssoftware | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Spritzenpumpe | Harvard Apparatur | 70-3007 | Spritzenpumpe |
| Kaliumhydroxid | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Rekombinante humane TNF-alpha | R& D Systems | 210-TA | |
| Gleitklemme | SynVivo | ||
| Natriumchlorid | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatische Grundierung | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin-Neutralisationslösung (TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon-Schlauch | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Schlauch |
Referenzen
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
