Die vorliegende Arbeit beschreibt die Schritte zur Herstellung einer gebrauchsfertigen qPCR für den T. cruzi-DNA-Nachweis, die auf das Reaktionsgefäß vorgeladen und mehrere Monate im Kühlschrank gelagert werden kann.
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Methodenartikel
Gebrauchsfertige qPCR zum Nachweis von DNA aus Trypanosoma cruzi oder anderen pathogenen Organismen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Real-time PCR (qPCR) ist eine bemerkenswert empfindliche und präzise Technik, die es ermöglicht, winzige Mengen von Nukleinsäurezielen aus einer Vielzahl von Proben zu amplifizieren. Es wurde in vielen Forschungsbereichen umfassend eingesetzt und erreichte industrielle Anwendung in Bereichen wie der Humandiagnostik und der Merkmalsauswahl in Pflanzen gentechnisch veränderter Organismen (GVO). qPCR ist jedoch keine fehlersichere Technik. Das Mischen aller Reagenzien zu einer einzigen Mastermischung, die anschließend auf 96 Vertiefungen einer regulären qPCR-Platte verteilt wird, kann zu Bedienerfehlern wie falschem Mischen von Reagenzien oder ungenauer Dosierung in die Vertiefungen führen. Hier wird eine Technik namens Gelifikation vorgestellt, bei der der größte Teil des in der Mastermischung vorhandenen Wassers durch Reagenzien ersetzt wird, die beim Aufsetzen in ein Vakuum eine Sol-Gel-Mischung bilden. Infolgedessen werden qPCR-Reagenzien effektiv für einige Wochen bei Raumtemperatur oder einige Monate bei 2-8 °C konserviert. Details zur Herstellung jeder Lösung werden hier zusammen mit dem erwarteten Aspekt einer gelierten Reaktion zum Nachweis von T. cruzi-Satelliten-DNA (satDNA) gezeigt. Ein ähnliches Verfahren kann angewendet werden, um andere Organismen nachzuweisen. Das Starten eines gelierten qPCR-Laufs ist so einfach wie das Entfernen der Platte aus dem Kühlschrank, das Hinzufügen der Proben in ihre jeweiligen Vertiefungen und das Starten des Laufs, wodurch die Rüstzeit einer vollständigen Plattenreaktion auf die Zeit zum Laden der Proben verringert wird. Darüber hinaus können gelierte PCR-Reaktionen in Chargen erzeugt und auf Qualität kontrolliert werden, was Zeit spart und häufige Bedienfehler bei der Durchführung routinemäßiger PCR-Reaktionen vermeidet.
Einleitung
Die Chagas-Krankheit wurde Anfang des 20. Jahrhunderts in ländlichen Regionen Brasiliens entdeckt, wo Armut weit verbreitet war 1,2. Auch heute noch ist die Krankheit mit sozialen und wirtschaftlichen Determinanten von Gesundheit in Amerika verbunden. Die Chagas-Krankheit ist biphasisch und umfasst eine akute und eine chronische Phase. Es wird durch eine Infektion durch den Parasiten Trypanosoma cruzi verursacht, der durch Insektenvektoren, Bluttransfusionen auf angeborenem Weg oder die orale Einnahme kontaminierter Lebensmittel übertragenwird 3,4
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Protokoll
1. Herstellung von Stammlösungen und Geliermischung
HINWEIS: Vier Stammlösungen werden hergestellt (400 mg/ml Melezitose, 400 mg/ml Trehalose, 0,75 mg/ml Lysin und 200 mg/ml Glykogen) und entsprechend dem in Tabelle 1 angegebenen Verhältnis gemischt, um die Gelifikationsmischung herzustellen. Obwohl das Protokoll die Produktion von 10 ml Stammlösungen beschreibt, kann es für kleinere oder höhere Volumina angepasst werden.
- Melezitose-Lösung
- Wiegen Sie 4 g Melezitose in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit de....
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Ergebnisse
Drei der Reagenzien, die die Geliermischung bilden, lassen sich bei starkem Wirbeln leicht auflösen. Glykogen erfordert jedoch ein sorgfältiges Wirbeln, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst wurde. Leider erzeugt starkes Wirbeln viele Blasen, was es schwierig macht, das tatsächliche Volumen der Lösung zu bestimmen (Abbildung 1A-B). Daher ist es wichtig, die Glykogenlösung im Kühlschrank ruhen zu lassen, bis der größte Teil der in den Blasen .......
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Diskussion
Die letzten Jahre haben gezeigt, dass empfindlichere und spezifischere Technologien gefunden werden müssen, um tropische und vernachlässigte Krankheiten zu diagnostizieren. Obwohl für die epidemiologische Kontrolle wichtig, haben parasitologische (optische Mikroskopie) und serologische Tests Einschränkungen, insbesondere in Bezug auf Empfindlichkeit und Point-of-Care-Anwendbarkeit. DNA-Amplifikationstechniken wie PCR, isotherme Amplifikation und entsprechende Variationen werden seit langem im Labor eingesetzt, aber techn.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren danken Aline Burda Farias für die technische Unterstützung beim Vakuumofen sowie der Verwaltung des Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasilien) für den Zugang zu den genannten Geräten. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Zuschuss CNPq 445954/2020-5 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bentonit-Tonsäcke (aktiviert) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spanien) | 026157/STD | Nicht zu verwechseln mit Kieselgelpackungen |
| Glykogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysin | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nukleasefreies Wasser | bevorzugter Anbieter | ||
| Oligonukleotide | bevorzugter Anbieter | ||
| PCR-Mastermix | bevorzugter Anbieter oder Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasilien) | Chagas NAT Kit | |
| PCR Thermocycler | Preferred Vendor | ||
| Software für Vakuumofen | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | von selbst gezüchteten Parasiten, oder gekauft von akkreditierten Anbietern wie ATCC | ||
| Vakuumschrank | Memmert Gmbh | VO-400 |
Referenzen
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
