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Methodenartikel

Gebrauchsfertige qPCR zum Nachweis von DNA aus Trypanosoma cruzi oder anderen pathogenen Organismen

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DOI:

10.3791/63316

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20. Januar 2022

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1Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LaCTAS), Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 2Pós-graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 3Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Schritte zur Herstellung einer gebrauchsfertigen qPCR für den T. cruzi-DNA-Nachweis, die auf das Reaktionsgefäß vorgeladen und mehrere Monate im Kühlschrank gelagert werden kann.

Zusammenfassung

Real-time PCR (qPCR) ist eine bemerkenswert empfindliche und präzise Technik, die es ermöglicht, winzige Mengen von Nukleinsäurezielen aus einer Vielzahl von Proben zu amplifizieren. Es wurde in vielen Forschungsbereichen umfassend eingesetzt und erreichte industrielle Anwendung in Bereichen wie der Humandiagnostik und der Merkmalsauswahl in Pflanzen gentechnisch veränderter Organismen (GVO). qPCR ist jedoch keine fehlersichere Technik. Das Mischen aller Reagenzien zu einer einzigen Mastermischung, die anschließend auf 96 Vertiefungen einer regulären qPCR-Platte verteilt wird, kann zu Bedienerfehlern wie falschem Mischen von Reagenzien oder ungenauer Dosierung in die Vertiefungen führen. Hier wird eine Technik namens Gelifikation vorgestellt, bei der der größte Teil des in der Mastermischung vorhandenen Wassers durch Reagenzien ersetzt wird, die beim Aufsetzen in ein Vakuum eine Sol-Gel-Mischung bilden. Infolgedessen werden qPCR-Reagenzien effektiv für einige Wochen bei Raumtemperatur oder einige Monate bei 2-8 °C konserviert. Details zur Herstellung jeder Lösung werden hier zusammen mit dem erwarteten Aspekt einer gelierten Reaktion zum Nachweis von T. cruzi-Satelliten-DNA (satDNA) gezeigt. Ein ähnliches Verfahren kann angewendet werden, um andere Organismen nachzuweisen. Das Starten eines gelierten qPCR-Laufs ist so einfach wie das Entfernen der Platte aus dem Kühlschrank, das Hinzufügen der Proben in ihre jeweiligen Vertiefungen und das Starten des Laufs, wodurch die Rüstzeit einer vollständigen Plattenreaktion auf die Zeit zum Laden der Proben verringert wird. Darüber hinaus können gelierte PCR-Reaktionen in Chargen erzeugt und auf Qualität kontrolliert werden, was Zeit spart und häufige Bedienfehler bei der Durchführung routinemäßiger PCR-Reaktionen vermeidet.

Einleitung

Die Chagas-Krankheit wurde Anfang des 20. Jahrhunderts in ländlichen Regionen Brasiliens entdeckt, wo Armut weit verbreitet war 1,2. Auch heute noch ist die Krankheit mit sozialen und wirtschaftlichen Determinanten von Gesundheit in Amerika verbunden. Die Chagas-Krankheit ist biphasisch und umfasst eine akute und eine chronische Phase. Es wird durch eine Infektion durch den Parasiten Trypanosoma cruzi verursacht, der durch Insektenvektoren, Bluttransfusionen auf angeborenem Weg oder die orale Einnahme kontaminierter Lebensmittel übertragenwird 3,4.

Die Diagnose der Chagas-Krankheit kann durch die Beobachtung klinischer Symptome (insbesondere des Romaña-Zeichens), Blutausstrichmikroskopie, Serologie und molekulare Tests wie real-time PCR (qPCR) oder isotherme Amplifikation 4,5,6,7,8,9 erfolgen. Klinische Symptome und Blutausstrichmikroskopie werden bei Verdacht auf akute Infektionen eingesetzt, während die Suche nach Antikörpern als Screening-Tool bei asymptomatischen Patienten eingesetzt wird. Aufgrund seiner Sensitivität und Spezifität wurde vorgeschlagen, qPCR als Überwachungsinstrument für chronische Patienten, für akute Patienten, die sich einer Behandlung zur Messung der Parasitenlast im Blut unterziehen, und als Ersatzmarker für therapeutisches Versagen verwendet zu werden 6,8,10,11,12 . Obwohl die qPCR empfindlicher und spezifischer ist als die derzeit verfügbaren Tests, wird effektiv verhindert, dass sie in benachteiligten Regionen weltweit als Diagnosewerkzeuge bekannt ist, da für Transport und Lagerung Temperaturen unter dem Gefrierpunkt erforderlich sind13,14,15.

Um dieses Hindernis zu umgehen, wurden Konservierungstechniken wie Lyophilisation und Gelierung erforscht16,17. Während die Lyophilisation jahrelang Konservierung bietet, erfordert sie speziell hergestellte Reagenzien ohne die Anwesenheit von Glycerin, das üblicherweise zur Enzymstabilisierung / -konservierung verwendet wird18. Während die Gelierung nachweislich monatelang konserviert wird, ermöglicht sie die Verwendung von regulären Reagenzien19. Die Gelierungslösung besteht aus vier Komponenten, von denen jede eine spezifische Rolle im Prozess spielt: Die Zucker Trehalose und Melezitose schützen die Biomoleküle während des Austrocknungsprozesses, indem sie freie Wassermoleküle in der Lösung reduzieren, Glykogen erzeugt eine breitere Schutzmatrix, und die Aminosäure Lysin wird als Radikalfänger verwendet, um die oxidierenden Reaktionen zwischen dem Carboxyl des Biomoleküls zu hemmen. Amino- und Phosphatgruppen. Diese Komponenten definieren eine Sol-Gel-Mischung, die den Verlust der tertiären oder quartären Struktur während des Austrocknungsprozesses verhindert und so dazu beiträgt, die Aktivität der Biomoleküle bei Rehydratation aufrechtzuerhalten19. Einmal in den Reaktionsröhrchen stabilisiert, können die Reaktionen für einige Monate bei 2-8 °C oder einige Wochen bei 21-23 °C statt der regulären -20 °C gelagert werden. Dieser Ansatz wurde bereits in Tests zur Diagnose von Krankheiten wie Chagas-Krankheit, Malaria, Leishmaniose, Tuberkulose und Cyclosporiasis aufgenommen13,14,15,20.

Die vorliegende Arbeit beschreibt alle Schritte zur Vorbereitung der erforderlichen Lösungen für das Gelierungsverfahren, die Fallstricke im Prozess und den erwarteten Endaspekt einer gebrauchsfertigen gelierten qPCR in Achtröhrchenstreifen. Das gleiche Protokoll kann für einzelne Rohre oder 96-Well-Platten angepasst werden. Schließlich wird der Nachweis von T. cruzi-DNA als Kontrolllauf gezeigt.

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Protokoll

1. Herstellung von Stammlösungen und Geliermischung

HINWEIS: Vier Stammlösungen werden hergestellt (400 mg/ml Melezitose, 400 mg/ml Trehalose, 0,75 mg/ml Lysin und 200 mg/ml Glykogen) und entsprechend dem in Tabelle 1 angegebenen Verhältnis gemischt, um die Gelifikationsmischung herzustellen. Obwohl das Protokoll die Produktion von 10 ml Stammlösungen beschreibt, kann es für kleinere oder höhere Volumina angepasst werden.

  1. Melezitose-Lösung
    1. Wiegen Sie 4 g Melezitose in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
      HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten).
    2. Das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 ml auffüllen. Etiketten und bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
  2. Trehalose-Lösung
    1. Wiegen Sie 4 g Trehalose in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
      HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten).
    2. Das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 mL auffüllen und die Lösung durch einen 0,2 μm Filter filtrieren. Etiketten und bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
  3. Glykogenlösung
    1. Wiegen Sie 2 g Glykogen in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
      HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten).
    2. Halten Sie die Lösung 8-12 h bei 2-8 °C in Ruhe, da die Solubilisierung von Glykogen viele Blasen erzeugt (Abbildung 1). Füllen Sie das Volumen auf 10 ml mit nukleasefreiem Wasser. Etiketten und bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
  4. Lysin-Lösung
    1. Wiegen Sie 7,5 mg Lysin in einem 15 ml Kunststoffröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu. Wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
      HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten).
    2. Das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 mL auffüllen und die Lösung durch einen 0,2 μm Filter filtrieren. Die Lösung wird in einen Bernsteinkolben gegeben oder vor Licht geschützt. Etikettieren und bei 2-8 °C Grad bis zu 6 Monate lagern.
  5. Geliermischung (GV)
    1. In einem 50-ml-Kunststoffröhrchen die Mengen der Stammlösungen gemäß Tabelle 1 mischen.
    2. Mischen Sie die Reagenzien durch zehn End-to-End-Inversionen des Röhrchens.
      HINWEIS: Es ist kein Filtrationsschritt erforderlich, wenn dieser Schritt in einer Laminar-Flow-Sicherheitshaube durchgeführt wird. Wenn dieser Schritt nicht in einer sauberen Umgebung durchgeführt wird, filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2-μm-Filter, bevor Sie sie in einen Bernsteinkolben geben.
    3. Die Lösung wird in einen Bernsteinkolben gegeben oder vor Licht geschützt. Etikettieren und bei 2-8 °C bis zu 3 Monate lagern.
      HINWEIS: Stellen Sie als Qualitätskontrollschritt für die Herstellung der Gelierungsmischung sicher, dass die gemessenen pH-, Leitfähigkeits- und Dichtewerte innerhalb der folgenden Bereiche liegen: pH 5,55-6,66; Leitfähigkeit 0,630-0,757 mS/cm; und Dichte 1,08-1,11 g/cm3. Alle Messungen sollten bei 25 °C durchgeführt werden.

2. Herstellung der qPCR-Mastermischung für die Gelierung

HINWEIS: In diesem Schritt wird die qPCR-Mastermischung für die Gelierung vorbereitet. Daher wird der Mischung kein Wasser, sondern die Geliermischung zugesetzt (Tabelle 2).

  1. Die Reagenzien in einem Kühlcontainer auftauen. Mischen Sie die Reagenzien in einem 1,5-ml-Röhrchen gemäß Tabelle 2. Ein Beispiel für eine Reaktion mit einem Endvolumen von 25 μL, die 5 μL DNA-Probe enthält, ist hier gezeigt.
    HINWEIS: Die DNA-Probe wird in diesem Schritt nicht zu der Mischung hinzugefügt; es wird hier ausschließlich zur Berechnung der Endvolumina jedes Reagenzes des qPCR-Mastermixes verwendet. DNA-Proben sollten direkt vor Beginn des Laufs hinzugefügt werden (siehe Schritt 4 unten).

3. Gelierung der Reagenzien an den Reaktionsgefäßen

  1. Die in Tabelle 2 angegebenen Volumina für die Herstellung eines Streifens mit acht Rohren oder einer 96-Well-Platte sind entsprechend zu multiplizieren.
  2. 18,5 μL der in Tabelle 2 gezeigten Geliermastermischung werden auf jede Reaktionsmulde pipet.
    HINWEIS: Dieses Volumen stellt die Volumina der Oligonukleotidmischung, des PCR-Puffers und der Gelierungsmischung dar, die für eine Reaktion verwendet werden (gemäß Tabelle 2) und variiert in Abhängigkeit von der Konzentration der Reagenzien und dem für eine Reaktion benötigten Volumen. Das Endvolumen in der Geliermastermischung unterscheidet sich von dem Volumen in einer normalen Mastermischung, da kein Wasser hinzugefügt wird.
  3. Legen Sie die Rohre/Platte in den wärmeleitenden Träger (z. B. Aluminium) im Vakuumofen.
    HINWEIS: Die wärmeleitende Unterstützung ist optional. Der Bediener muss sicherstellen, dass der Boden der Rohre in Kontakt mit dem Vakuumofenregal steht, um ein schnelles thermisches Gleichgewicht zu ermöglichen.
  4. Platzieren Sie einen Bentonit-Tonbeutel für jeweils zwei 96-Well-Platten.
    HINWEIS: Bentonit-Tonbeutel werden verwendet, um das entfernte Wasser aus der Geliermastermischung durch den Differenzdruck des Vakuums zu absorbieren. Bentonit-Tonsäcke erwiesen sich für weniger als zwei 96-Well-Platten als unnötig.
  5. Die Röhrchen/Platten mit der Geliermastermischung werden drei Vakuumzyklen (30 ± 5 mBar) von jeweils 30 min ausgesetzt, abwechselnd mit Vakuumfreisetzung, bis der atmosphärische Druck (900-930 mBar) erreicht ist, unter kontrollierter Temperatur (30 °C ± 1 °C) (Abbildung 2).
    HINWEIS: Das Gerät verwendet Software zur Steuerung der Parameter, und ein Beispiel für den Zyklus ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Benutzer muss das Profil für den Lauf unter Angabe der ausgewählten Parameter erstellen.
  6. Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Röhrchen/Platten auf ordnungsgemäße Gelierung der Reagenzien, indem Sie sicherstellen, dass das Volumen sichtbar reduziert ist (Abbildung 3) und dass sich die Flüssigkeiten beim Klopfen der Röhrchen/Platten mit den Fingern nicht bewegen.
    HINWEIS: Wenn keine Gelierung stattgefunden hat, spritzt die Lösung auf die Rohrwände, wenn Röhrchen angeklopft werden (Abbildung 3).
  7. Verschließen und lagern Sie die Röhrchen/Platten vor Gebrauch bei 2-8 °C für 8-12 h.

4. Verwendung einer gelierten qPCR

  1. Entfernen Sie den Schlauchstreifen oder die Platte aus dem Kühlschrank und öffnen Sie ihn zur Probenmanipulation an einer Arbeitsstation. Fügen Sie jedem Reaktionsgefäß 15 μL nukleasefreies Wasser hinzu.
    HINWEIS: Das Volumen der gelierten Reagenzien wird auf etwa 5 μL geschätzt. Zusammen mit dem DNA-Probenvolumen (siehe unten) beträgt das endgültige Reaktionsvolumen 25 μL.
  2. Fügen Sie 5 μL DNA-Probe hinzu.
    HINWEIS: Jede DNA-Vorlage in qPCR-Qualität kann verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde DNA aus 108T. cruzi epimastigotes (Stamm Dm28c) extrahiert und unter Verwendung von TE-Puffer im Verhältnis 1:10 seriell verdünnt.
  3. Verschließen Sie die Rohre/Platten und fahren Sie mit dem Gerät Ihrer Wahl fort. Führen Sie das Experiment aus und fahren Sie mit der regulären Datenanalyse fort.

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Ergebnisse

Drei der Reagenzien, die die Geliermischung bilden, lassen sich bei starkem Wirbeln leicht auflösen. Glykogen erfordert jedoch ein sorgfältiges Wirbeln, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst wurde. Leider erzeugt starkes Wirbeln viele Blasen, was es schwierig macht, das tatsächliche Volumen der Lösung zu bestimmen (Abbildung 1A-B). Daher ist es wichtig, die Glykogenlösung im Kühlschrank ruhen zu lassen, bis der größte Teil der in den Blasen ...

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Diskussion

Die letzten Jahre haben gezeigt, dass empfindlichere und spezifischere Technologien gefunden werden müssen, um tropische und vernachlässigte Krankheiten zu diagnostizieren. Obwohl für die epidemiologische Kontrolle wichtig, haben parasitologische (optische Mikroskopie) und serologische Tests Einschränkungen, insbesondere in Bezug auf Empfindlichkeit und Point-of-Care-Anwendbarkeit. DNA-Amplifikationstechniken wie PCR, isotherme Amplifikation und entsprechende Variationen werden seit langem im Labor eingesetzt, aber techn...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren danken Aline Burda Farias für die technische Unterstützung beim Vakuumofen sowie der Verwaltung des Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasilien) für den Zugang zu den genannten Geräten. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Zuschuss CNPq 445954/2020-5 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bentonit-Tonsäcke (aktiviert)Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spanien)026157/STDNicht zu verwechseln mit Kieselgelpackungen
GlykogenAmersham BioscienceCat# US16445
LysinAcros OrganicCat# 365650250
MelezitozeSigma-AldrichCat# 63620
Nukleasefreies Wasserbevorzugter Anbieter
Oligonukleotidebevorzugter Anbieter
PCR-Mastermixbevorzugter Anbieter oder Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasilien)Chagas NAT Kit
PCR ThermocyclerPreferred Vendor
Software für VakuumofenMemmert GmbhCelsius v10.0
TrehaloseSigma-AldrichCat# T9531
Trypanosoma cruzi DNAvon selbst gezüchteten Parasiten, oder gekauft von akkreditierten Anbietern wie ATCC
VakuumschrankMemmert GmbhVO-400
: , , ,

Referenzen

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