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Methodenartikel

Facettenreiche massenspektrometrische Untersuchung von Neuropeptiden in Callinectes sapidus

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DOI:

10.3791/63322

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31. Mai 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die massenspektrometrische Charakterisierung von Neuropeptiden liefert Sequenz-, Quantifizierungs- und Lokalisierungsinformationen. Dieser optimierte Workflow ist nicht nur für Neuropeptidstudien nützlich, sondern auch für andere endogene Peptide. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben die Probenvorbereitung, die MS-Akquisition, die MS-Analyse und die Datenbankgenerierung von Neuropeptiden unter Verwendung von LC-ESI-MS, MALDI-MS-Spotting und MALDI-MS-Bildgebung.

Zusammenfassung

Neuropeptide sind Signalmoleküle, die fast alle physiologischen und Verhaltensprozesse wie Entwicklung, Fortpflanzung, Nahrungsaufnahme und Reaktion auf externe Stressoren regulieren. Dennoch sind die biochemischen Mechanismen und die vollständige Ergänzung der Neuropeptide und ihre funktionellen Rollen noch wenig verstanden. Die Charakterisierung dieser endogenen Peptide wird durch die immense Vielfalt innerhalb dieser Klasse von Signalmolekülen behindert. Darüber hinaus sind Neuropeptide in Konzentrationen von 100x - 1000x niedriger als die von Neurotransmittern bioaktiv und neigen nach der synaptischen Freisetzung zum enzymatischen Abbau. Die Massenspektrometrie (MS) ist ein hochempfindliches Analysewerkzeug, das Analyten ohne umfassende A-priori-Kenntnisse identifizieren, quantifizieren und lokalisieren kann. Es eignet sich gut für die globale Profilierung von Neuropeptiden und die Unterstützung bei der Entdeckung neuartiger Peptide. Aufgrund der geringen Häufigkeit und hohen chemischen Vielfalt dieser Peptidklasse wurden mehrere Probenvorbereitungsmethoden, MS-Akquisitionsparameter und Datenanalysestrategien aus Proteomiktechniken angepasst, um eine optimale Neuropeptidcharakterisierung zu ermöglichen. Hier werden Methoden zur Isolierung von Neuropeptiden aus komplexen biologischen Geweben zur Sequenzcharakterisierung, -quantifizierung und -lokalisierung mittels Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS und matrixgestützter Laserdesorption/-ionisation (MALDI)-MS beschrieben. Ein Protokoll zur Erstellung einer Neuropeptid-Datenbank aus der blauen Krabbe, Callinectes sapidus, einem Organismus ohne umfassende genomische Informationen, ist enthalten. Diese Arbeitsabläufe können angepasst werden, um andere Klassen von endogenen Peptiden in verschiedenen Spezies mit einer Vielzahl von Instrumenten zu untersuchen.

Einleitung

Das Nervensystem ist komplex und benötigt ein Netzwerk von Neuronen, um Signale durch einen Organismus zu übertragen. Das Nervensystem koordiniert sensorische Informationen und biologische Reaktionen. Die komplizierten und komplizierten Wechselwirkungen, die an der Signalübertragung beteiligt sind, erfordern viele verschiedene Signalmoleküle wie Neurotransmitter, Steroide und Neuropeptide. Da Neuropeptide die vielfältigsten und stärksten Signalmoleküle sind, die eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung physiologischer Reaktionen auf Stress und andere Reize spielen, ist es von Interesse, ihre spezifische Rolle in diesen physiologischen Prozessen zu bestimmen. Die Funktion von Neuropeptiden hängt mit ihrer Aminosäurestruktur zusammen, die die Mobilität, die Rezeptorinteraktion und die Affinitätbestimmt 1. Techniken wie die Histochemie, die wichtig ist, weil Neuropeptide in verschiedenen Regionen des Gewebes synthetisiert, gespeichert und freigesetzt werden können, und die Elektrophysiologie wurden eingesetzt, um die Struktur und Funktion von Neuropeptiden zu untersuchen 2,3,4, aber diese Methoden sind durch Durchsatz und Spezifität begrenzt, um die enorme Sequenzvielfalt von Neuropeptiden aufzulösen.

Die Massenspektrometrie (MS) ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der Neuropeptidstruktur und -häufigkeit. Dies kann durch verschiedene MS-Techniken durchgeführt werden, am häufigsten durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisation MS (LC-ESI-MS)5 und matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation MS (MALDI-MS)6. Durch hochgenaue Massenmessungen und MS-Fragmentierung bietet MS die Möglichkeit, Neuropeptiden aus komplexen Mischungen ohne A-priori-Kenntnisse den Status einer Aminosäuresequenz und posttranslationalen Modifikation (PTM) zuzuweisen, um ihre Funktion zu bestimmen 7,8. Neben qualitativen Informationen ermöglicht MS die quantitative Information von Neuropeptiden durch markierungsfreie Quantifizierung (LFQ) oder markierungsbasierte Methoden wie isotopische oder isobare Markierung9. Zu den Hauptvorteilen von LFQ gehören die Einfachheit, die niedrigen Analysekosten und die Verringerung der Probenvorbereitungsschritte, wodurch der Probenverlust minimiert werden kann. Zu den Nachteilen von LFQ gehören jedoch erhöhte Gerätezeitkosten, da mehrere technische Replikate erforderlich sind, um quantitative Fehler aufgrund von Run-to-Run-Variabilität zu beheben. Dies führt auch zu einer verminderten Fähigkeit, kleine Variationen genau zu quantifizieren. Markierungsbasierte Methoden unterliegen weniger systematischen Variationen, da mehrere Proben mit einer Vielzahl stabiler Isotope differenziell markiert, zu einer Probe kombiniert und gleichzeitig durch Massenspektrometrie analysiert werden können. Dies erhöht auch den Durchsatz, obwohl die Synthese oder der Kauf von Isotopenmarkierungen zeitaufwändig und kostspielig sein kann. Die spektrale Komplexität der Full Scan-Massenspektren (MS1) nimmt mit zunehmendem Multiplexing ebenfalls zu, was die Anzahl der einzigartigen Neuropeptide verringert, die fragmentiert und daher identifiziert werden können. Umgekehrt erhöht die isobare Markierung die spektrale Komplexität auf MS1-Ebene nicht, obwohl sie Herausforderungen für Analyten mit geringer Häufigkeit wie Neuropeptide mit sich bringt. Da die isobare Quantifizierung auf der Ebene der Fragmentionen-Massenspektren (MS2) durchgeführt wird, können Neuropeptide mit geringer Häufigkeit möglicherweise nicht quantifiziert werden, da reichlichere Matrixkomponenten für die Fragmentierung ausgewählt werden können und die ausgewählten möglicherweise nicht hoch genug sind, um quantifiziert zu werden. Mit der Isotopenmarkierung kann die Quantifizierung an jedem identifizierten Peptid durchgeführt werden.

Zusätzlich zur Identifizierung und Quantifizierung können Lokalisierungsinformationen von MS durch MALDI-MS-Bildgebung (MALDI-MSI)10 erhalten werden. Durch Rasten eines Lasers über eine Probenoberfläche können MS-Spektren zu einem Heatmap-Bild für jeden m/z-Wert kompiliert werden. Die Kartierung der transienten Neuropeptidsignalintensität in verschiedenen Regionen über Bedingungen hinweg kann wertvolle Informationen für die Funktionsbestimmungliefern 11. Die Lokalisation von Neuropeptiden ist besonders wichtig, da die Neuropeptidfunktion je nach Standort12 unterschiedlich sein kann.

Neuropeptide kommen in vivo in geringerer Häufigkeit vor als andere Signalmoleküle wie Neurotransmitter und erfordern daher empfindliche Methoden zum Nachweis13. Dies kann durch die Entfernung von Matrixkomponenten mit höherer Häufigkeit, wie z.B. Lipiden11,14, erreicht werden. Zusätzliche Überlegungen für die Analyse von Neuropeptiden müssen im Vergleich zu herkömmlichen Proteomik-Workflows angestellt werden, vor allem, weil die meisten neuropeptidomischen Analysen die enzymatische Verdauung auslassen. Dies schränkt die Softwareoptionen für die Neuropeptid-Datenanalyse ein, da die meisten mit Algorithmen erstellt wurden, die auf Proteomik-Daten und Proteinübereinstimmungen basieren, die durch Peptiddetektion informiert sind. Viele Software wie PEAKS15 eignet sich jedoch aufgrund ihrer De-novo-Sequenzierungsfunktionen besser für die Neuropeptidanalyse. Für die Analyse von Neuropeptiden müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden, angefangen von der Extraktionsmethode bis zur MS-Datenanalyse.

Die hier beschriebenen Protokolle umfassen Methoden zur Probenvorbereitung und Dimethylisotopenmarkierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Neuropeptiden durch LC-ESI-MS, MALDI-MS und MALDI-MSI. Durch repräsentative Ergebnisse aus mehreren Experimenten wird der Nutzen und die Fähigkeit dieser Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden aus blauen Krabben, Callinectes sapidus, demonstriert. Um das Nervensystem besser zu verstehen, werden häufig Modellsysteme verwendet. Vielen Organismen steht kein vollständig sequenziertes Genom zur Verfügung, was eine umfassende Entdeckung von Neuropeptiden auf Peptidebene verhindert. Um diese Herausforderung zu mildern, ist ein Protokoll zur Identifizierung neuartiger Neuropeptide und zum Transkriptom-Mining zur Generierung von Datenbanken für Organismen ohne vollständige Genominformationen enthalten. Alle hier vorgestellten Protokolle können für Neuropeptidproben aus beliebigen Spezies optimiert sowie für die Analyse beliebiger endogener Peptide angewendet werden.

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Protokoll

Alle beschriebenen Gewebeproben wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Wisconsin-Madison durchgeführt.

1. LC-ESI-MS-Analyse von Neuropeptiden

  1. Neuropeptidextraktion und Entsalzung
    1. Vor der Gewebeentnahme ist angesäuertes Methanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:Wasser:Essigsäure) wie in16 beschrieben herzustellen.
    2. Sammeln Sie Hirngewebe aus dem Krustentier17 und verwenden Sie eine Pinzette, um sofort jeweils ein Gewebe in eine 0,6-ml-Röhre mit 20 μL acMeOH zu legen.
      HINWEIS: Die Protokolle zur Gewebedissektion variieren stark für verschiedene Tiere und Gewebetypen. Der Leser wird auf Protokoll17 verwiesen, um eine detaillierte Beschreibung der Sezierung von Hirngewebe und mehreren anderen Gewebetypen aus dem Krebstier zu erhalten. Die Proben können bis zur Verwendung (idealerweise innerhalb von 6 Monaten) bei -80 °C gelagert werden. Die beschriebenen Volumina werden für ein einzelnes Gehirn von Callinectes sapidus verwendet. Volumina sollten für die Gewebegröße skaliert werden. Gewebe kann sofort ohne Lösungsmittel schockgefroren werden, obwohl dies nicht empfohlen wird, da endogene proteolytische Enzyme nicht gehemmt werden und aktiv bleiben, wenn auch langsamer, wenn sie kalt sind.
    3. 150 μL acMeOH in die Probe geben. Stellen Sie die Gesamtbeschallungszeit auf 24 s, die Pulszeit auf 8 s, die Pausenzeit auf 15 s und die Amplitude auf 50% auf einem Ultraschallhomogenisator ein und homogenisieren Sie die Proben auf Eis.
      HINWEIS: Es stehen verschiedene Homogenisierungssysteme zur Verfügung. Passen Sie die Einstellungen und Bedingungen je nach Probentyp und Ausrüstung an.
    4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 4 °C bei 20.000 x g für 20 min. Mit einer Pipette den Überstand in ein Rohr geben und in einem Vakuumkonzentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bei ca. 35 °C trocknen.
      HINWEIS: Die getrockneten Proben können bis zur Verwendung (idealerweise innerhalb von 6 Monaten) bei -80 °C gelagert werden. Die Erwärmung des Vakuumkonzentrators muss mit Vorsicht erfolgen. Während Hitze die Trocknungszeit verkürzt, muss die Probe sofort nach dem Verdampfen der gesamten Flüssigkeit aus dem Konzentrator entfernt werden, um den Peptidabbau zu minimieren. Um dies zu vermeiden, kann auf die Heizung bei diesem und allen nachfolgenden Schritten verzichtet werden.
    5. Zum Entsalzen die extrahierte Gewebeprobe in 20 μL 0,1% Ameisensäure (FA), Wirbelgut rekonstituieren und in einem Wasserbad bei Raumtemperatur für 1 min beschallen.
      HINWEIS: Es stehen verschiedene Entsalzungsmaterialien zur Verfügung. Passen Sie die Lösungen und Volumina entsprechend der Harzidentität und der Neuropeptidmenge an. Die Gesamtpeptidmenge kann unter Verwendung eines kommerziellen Peptidquantifizierungstests geschätzt werden (siehe Materialtabelle).
    6. Tragen Sie 0,5 μL Probe auf einen pH-Streifen auf, um zu bestätigen, dass der pH-Wert 4 <. Wenn der pH-Wert höher ist, fügen Sie 1 μL Aliquots von 10% FA hinzu, bis der pH-Wert 4 <.
    7. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers zum Entsalzen18. Es ist eine Benetzungslösung mit 100 μL 50 % Acetonitril (ACN), einer Gleichgewichtslösung mit 100 μL 0,1 % FA, einer Waschlösung mit 100 μL 0,1 % FA und Elutionslösungen mit 20 μL 25 % ACN/0,1 % FA, 20 μL 50 % ACN/0,1 % FA und 20 μL 75 % ACN/0,1 % FA herzustellen.
    8. Erhalten Sie eine 10 μL Entsalzungsspitze mit C18-Harz (siehe Materialtabelle).
    9. Legen Sie die Entsalzungsspitze auf eine 20-μL-Pipette, die auf 15 μL eingestellt ist. Sobald die Entsalzungsspitze nass ist, verhindern Sie, dass Luft durchdringt, indem Sie die Pipette gedrückt halten, wenn sie keine Lösung mehr hat, bis sie entsorgt wird.
    10. Saugen Sie die Spitze 3x mit Benetzungslösung und 3x mit Gleichgewichtslösung ab. 10x in der Probe abpumpen, gefolgt von 3x Waschen in Waschlösung, wobei jede Wäsche verworfen wird. Eluieren Sie, indem Sie 10x in jeder der Elutionslösungen in der Reihenfolge der Erhöhung von ACN absaugen.
      HINWEIS: Elutionfraktionen können für weitere Analysen getrennt oder kombiniert werden.
    11. Die verwendete Entsalzungsspitze entsorgen und die eluierten Neuropeptide in einem Vakuumkonzentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bei ca. 35 °C trocknen.
      HINWEIS: Dieser kann bis zum Gebrauch (idealerweise innerhalb von 6 Monaten) bei -80 °C gelagert werden.
  2. Isotopenmarkierung von Neuropeptiden im Gewebeextrakt
    HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und wird nur verwendet, wenn eine Quantifizierung gewünscht wird.
    1. Es wird die 2-Plex-Isotopen-Dimethyl-Markierungslösung in einem Abzug hergestellt: 1%CH2OH2(13,5 μL Stamm 37 Gewichts-/Gewichtsprozentsatz (Gew.-%) in Wasserlösung in 486,5 μL Wasser), 1% CH2OD2 (25 μL Stammlösung mit 20 Gew.-% in 475 μl Wasser) und 0,03 M Boranpyridin (3,75 μL Stammlösung 8 M in 996,25 μL Wasser).
      ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig, daher sollten alle Lösungen in einer belüfteten Haube aufbewahrt werden. Tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel, Augenschutz und undurchlässiges Schuhwerk. Kontaktlinsen sollten bei der Arbeit mit diesem Material nicht getragen werden.
      HINWEIS: Es gibt verschiedene Isotopenreagenzien; Wählen Sie die entsprechenden basierend auf dem Probentyp und der Anzahl der gewünschten Etikettierkanäle aus.
    2. Roher Neuropeptidextrakt in 10 μL Wasser und Ultraschall für 10 min auflösen.
    3. 10 μL einer anderen Isotopen-Formaldehydlösung (d. h. CH2OH2, CH2OD2 usw.) zu jeder anderen experimentellen Bedingung hinzufügen,die quantitativ gemessen werden soll. Vortex, um gut zu mischen und jede Probe kurz bei 2.000 x g zentrifugieren.
    4. 10 μL 0,03 M Boranpyridin in jedes Probenröhrchen geben. Vortex, um gut zu mischen und jede Probe kurz bei 2.000 x g zentrifugieren.
    5. Die Proben 15 min bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.
    6. Entfernen Sie die Proben aus dem Wasserbad und fügen Sie 10 μL 100 mM Ammoniumbicarbonat hinzu. Vortex, um gut zu mischen und jede Probe kurz bei 2.000 x g zentrifugieren.
    7. Kombinieren Sie die markierten Proben zu einer 2-Plex-Probe und trocknen Sie die Neuropeptide in einem Vakuumkonzentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bei ca. 35 °C.
    8. Entsalzen Sie die markierten Neuropeptide, indem Sie die Schritte 1.1.5 - 1.1.10 wiederholen und lagern Sie sie, bis sie für die Datenerfassung bereit sind.
  3. Datenerfassung
    1. Rekonstituieren Sie die getrockneten entsalzten Neuropeptide in 12 μL von 3% ACN / 0,1% FA, wirbeln Sie gut, beschallen Sie in 37 ° C Wasserbad für 1 min und zentrifugieren Sie kurz bei 2.000 x g. Übertragen Sie jede Probe in Autosampler-Fläschchen.
      HINWEIS: Stellen Sie das Probenvolumen entsprechend der Neuropeptidmenge auf eine Konzentration von ~ 1 μg Peptid pro μL ein. Die Gesamtpeptidmenge kann unter Verwendung eines kommerziellen Peptidquantifizierungstests geschätzt werden (siehe Materialtabelle).
    2. Verwenden Sie einen Autosampler, um 1 μL Probe in ein hochauflösendes Nano-LC-MS/MS-Gerät zu injizieren (siehe Materialtabelle).
    3. Verwenden Sie eine ca. 15 cm lange C18-Säule mit umgekehrter Phase (RP) (siehe Materialtabelle), um die Probe mit 0,1% FA in Wasser als mobile Phase A und 0,1% FA in ACN als mobile Phase B auszuführen. Führen Sie die Proben mit einem Gradienten von 3% - 95% von B mit einer Rate von 300 nL/min für mehr als 11 min aus.
    4. Verwenden Sie für das hier verwendete MS-Gerät die üblichen MS-Bedingungen von 2,00 kV für die Sprühspannung und 275 °C für die Kapillartemperatur.
    5. Erfassen Sie MS-Spektren im Bereich von 200 - 2.000 m/z mit einer Auflösung von 60.000, einem Automatic Gain Control (AGC)-Target von 1 x 106 und einer maximalen Ioneninjektionszeit (IT) von 150 ms.
    6. Wählen Sie die 15 intensivsten Ionen (Mindestintensität von 3,2 x 104) für eine HCD-Fragmentierung (Collision Dissociation) mit höherer Energie unter Verwendung einer normalisierten Kollisionsenergie von 30, eines Isolationsfensters von 2,0 m/z, einer Auflösung von 15.000, eines AGC-Ziels von 2 x 105 und einer maximalen IT von 250 ms.
    7. Legen Sie ein dynamisches Ausschlussfenster von 30 s fest. Schließen Sie Ionen mit einer Ladung von 1 oder ≥ 8 und Ionen mit nicht erkannten Ladungszuständen aus.
  4. Identifizierung und Quantifizierung von Neuropeptiden
    HINWEIS: Viele Software für die Datenbanksuche und Peptidquantifizierung (sowohl Open-Source als auch kommerziell) ist verfügbar. Hier kommt PEAKS Studio (Proteomik-Software)15 zum Einsatz.
    1. Führen Sie die Datenbanksuche mit den in 1.4.2 - 1.4.6 beschriebenen Schritten durch.
    2. Erstellen Sie ein neues Projekt und fügen Sie die LC-MS-Daten hinzu, indem Sie Keine für das Enzym, Orbitrap für das Instrument, HCD für das Fragment und datenabhängige Erfassung (DDA) für die Erfassung auswählen.
      HINWEIS: Wählen Sie die entsprechenden Parameter basierend auf den Datenerfassungsparametern aus.
    3. Wählen Sie Identifikationen und dann Korrekter Vorläufer [DDA] und Nur Masse aus.
    4. Wählen Sie Datenbanksuche und legen Sie eine Fehlertoleranz von 20,0 ppm fest, wobei die Monoisotopenmasse für die Vorläufermasse und 0,02 Da für die Fragmentionenmasse, Keine für den Enzymtyp, Unspezifisch für den Aufschlussmodus, 100 für die maximal verpassten Spaltungen und die folgenden variablen PTMs mit der maximal zulässigen Variablen PTM pro Peptid von 3 verwendet werden: Amidation, Oxidation (M), Pyro-Glu von E, und Pyro-glu von Q.
    5. Wählen Sie die Neuropeptid-Datenbank, schätzen Sie die False-Discovery-Rate (FDR) mit Lockvogel-Fusion.
      HINWEIS: Der Massentoleranzfehler sollte an die erfassten Daten angepasst werden. Verwenden Sie die entsprechende Datenbank für den Beispieltyp. Wenn kein Enzym ausgewählt ist, hat der Parameter max missed cleavages keinen Einfluss auf die Suche. Eine große Anzahl von verpassten Spaltungen ist jedoch erforderlich, wenn die Software nicht über den nicht spezifizierten Digest-Modus als Option verfügt.
    6. Wenn eine kennzeichnungsfreie Quantifizierung gewünscht ist, wählen Sie Quantifizierung, wählen Sie Etikettenfrei und legen Sie eine Fehlertoleranz von 20,0 ppm und eine Verweilzeittoleranz von 1,0 min fest.
    7. Führen Sie eine Vorläuferionenquantifizierung durch, wenn Schritt 1.2 für die Isotopenmarkierung durchgeführt wurde.
      1. Wählen Sie Quantifizierung, wählen Sie Vorläufer-Ionenquantifizierung, verwenden Sie einen Aufbewahrungszeitbereich von 1,0 min und verwenden Sie einen FDR-Schwellenwert von 1 %.
      2. Wählen Sie im Dropdown-Menü Methode auswählen eine voreingestellte oder benutzerdefinierte Quantifizierungsmethode aus.
      3. Um eine neue benutzerdefinierte Methode zu erstellen, klicken Sie auf Fenster > Konfiguration > Label Q-Methode > Neu. Benennen Sie die neue Methode, und wählen Sie Vorläufer-Ionenquantifizierung für Methodentyp aus. Wählen Sie Zeile hinzufügen und dann Änderung aus der Liste PTM-Optionen aus.
      4. Fügen Sie die LC-MS-Daten hinzu und wählen Sie Referenzbedingung, um die Modifikation von Neuropeptiden aus der Kontrollbedingung des Experiments zu sein.
    8. Werten Sie die Suchergebnisse wie in den Schritten 1.4.9 - 1.4.11 beschrieben aus.
    9. Filtern Sie die Ergebnisse über die Registerkarte Zusammenfassung für Peptide und Proteine mit -10lgP ≥ 20, wählen Sie ≥ 1 einzigartiges Peptid aus und wählen Sie das Feld mit der Bezeichnung Mit signifikanten Peptiden aus.
    10. Bewerten Sie die Suchergebnisse der Datenbank, wobei Protein.csv für Neuropeptididentifikationen und Peptid.csv für Neuropeptidfragmentidentifikationen steht.
    11. Überprüfen Sie die Datenbanksuche auf Protein- und Peptidwerte, Massengenauigkeit und Sequenzabdeckung.
      HINWEIS: Jede Datenbanksuchsoftware verwendet eindeutige Bewertungsalgorithmen und muss möglicherweise entsprechend bewertet werden. Die Identifizierungen können durch manuelle Inspektion der beobachteten Spektren auf identifizierte Peptide, die die vollständige Fragmentionenreihe enthalten, ausgewertet werden.

2. MALDI-MS-Spotting-Analyse von Neuropeptiden

  1. Probenvorbereitung
    1. Befolgen Sie Schritt 1.1 oder die Schritte 1.1 - 1.2, wenn eine Quantifizierung gewünscht ist, mit Ausnahme von Schritt 1.2.8 (eine Entsalzung nach der Isotopenmarkierung ist vor der MALDI-MS-Analyse nicht erforderlich).
    2. Rekonstituieren Sie die getrockneten entsalzten Neuropeptide in 5 μL von 0,1% FA, wirbeln Sie gut, beschallen Sie in einem 37 ° C Wasserbad für 1 min und zentrifugieren Sie kurz bei 2.000 x g.
    3. Zur Schmierblutung von Neuropeptiden in Krebstiergeweben werden 150 mg/ml 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) in 50% Methanol (MeOH)/0,1% FA (v/v) als Matrix hergestellt.
    4. Pipettieren Sie einen 3 μL-Tropfen der Probe auf einen hydrophoben Film (siehe Materialtabelle) und pipettieren Sie 3 μL der Matrix direkt auf den Probentropfen. Pipette auf und ab zum Mischen.
    5. Pipette 1 μL der 1:1 Probe: Matrixmischung in eine Vertiefung der MALDI Edelstahl-Zielplatte. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um jede Mischung an den Rändern der Probe gut zu verteilen. Die Probe muss die Kanten der Bohrlochgravur berühren, um eine gleichmäßige Verteilung zu ermöglichen (Abbildung 4A).
    6. Spot 1 μL 1:1 Kalibrat:Matrix-Gemisch (kommerzielle oder kundenspezifische Kalibriermischung, Polymermaterialien (d. h. roter Phosphor, der in MeOH gelöst ist) oder übliche Matrix-Cluster-Ionen)12 in eine Vertiefung in der Nähe der Probe.
      HINWEIS: Roter Phosphor muss vor dem Spotten nicht mit Matrix gemischt werden.
  2. Datenerfassung
    1. Setzen Sie die Zielplatte mit getrockneten Probenflecken in das MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF)-Instrument ein (siehe Materialverzeichnis).
    2. Stellen Sie für die DHB-Matrix die Laserleistung auf 95 % ein, wählen Sie den Bewegungsmodus "Automatic Optimal Detector Gain" und "Smart - Complete Sample Carrier". Erfassen Sie MS-Spektren im Bereich von 200 - 3200 m/z und addieren Sie mehrere Spektren von jedem Punkt zusammen, um das Signal-Rausch-Verhältnis von Neuropeptiden zu erhöhen.
      HINWEIS: Optimieren Sie die prozentuale Laserleistung, die Detektorverstärkung und wählen Sie den geeigneten Probenträgerbewegungsmodus, damit jede Aufnahme ungefähr den gesamten Punkt abdeckt und nachfolgende Erfassungen nicht an die vorherigen Positionen gehen.
    3. Kalibrieren Sie das Instrument.
      HINWEIS: Passen Sie den Massenbereich so an, dass er den gewünschten Neuropeptidbereich umfasst.
  3. Datenanalyse
    1. Öffnen Sie die Datei MALDI-MS in der Datenanalysesoftware (siehe Materialverzeichnis) und klicken Sie auf Baseline Subtraction für die hier verwendete Software.
    2. Führen Sie die Spitzenauswahl durch, indem Sie auf Massenliste suchen klicken. Wenn es zu wenige Spitzen gibt, bearbeiten Sie die Massenliste manuell, indem Sie Massenliste bearbeiten auswählen und auf Spitzen im Spektrum klicken, um sie der Massenliste hinzuzufügen.
    3. Führen Sie einen genauen Massenabgleich durch, indem Sie die Massenliste mit der Neuropeptiddatenbank vergleichen, die [M + H] + m / z-Werte enthält (± 200 ppm Fehler). 
      HINWEIS: Gewöhnliche Salzaddukte wie [M+K]+, [M+Na]+ und [M+NH4]+, sollten ebenfalls in die Liste der genauen Massenanpassungsziele aufgenommen werden.
    4. Um die identifizierten Spitzen zu überprüfen, generieren Sie eine Liste von m/z von Interesse und führen Sie MS/MS-Experimente durch.

3. MALDI-MS bildgebende Analyse von Neuropeptiden

  1. Probenvorbereitung
    HINWEIS: Einbettungs- und Schnittschritte sind für Gewebe, die zu dünn sind, um geschnitten zu werden, nicht erforderlich.
    1. Füllen Sie einen halben Kryostatenbecher mit Gelatine (37 °C, 100 mg/ml in entionisiertem Wasser) und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur erstarren. Übrig gebliebene flüssige Gelatine in einem 37 °C warmen Wasserbad aufbewahren.
    2. Sammeln Sie das gewünschte neuronale Gewebe vom Tier und verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe sofort in eine 0,6 ml Röhre mit deionisiertem Wasser für 1 s zu tauchen.
      HINWEIS: Siehe Schritt 1.1.2 HINWEIS für die Dissektion von neuronalem Gewebe.
    3. Legen Sie das Gewebe auf die feste Gelatine und füllen Sie den Rest des Kryostatbechers mit flüssiger Gelatine. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu positionieren.
    4. Den Kryostatenbecher auf eine ebene Fläche stellen und mit Trockeneis einfrieren.
      HINWEIS: Lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung (idealerweise innerhalb von 6 Monaten).
    5. Für die Schnittvorbereitung trennen Sie die in Gelatine eingebettete Probe von der Kryostatform, indem Sie die Form wegschneiden.
    6. Montieren Sie das eingebettete Gewebe auf ein Kryostat-Futter, indem Sie ein 1 ml Tröpfchen deionisiertes Wasser auf das Futter pipettieren und das eingebettete Gewebe sofort auf das Tröpfchen drücken.
    7. Nach dem Einfrieren pipettieren Sie mehr deionisiertes Wasser um das Gewebe, um es weiter am Spannfutter zu befestigen. Führen Sie diese Schritte in der Kryostatenbox (siehe Materialtabelle) aus, die auf -20 °C eingestellt ist.
    8. Schneiden Sie das Gewebe mit einer ungefähren Dicke von einer Zelle (8-20 μm je nach Probentyp) und montieren Sie jeden Abschnitt auf einem mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichteten Glasobjektträger, indem Sie eine Seite des Objektträgers in der Nähe des Abschnitts platzieren und einen Finger auf die andere Seite des Objektträgers legen, um das Glas langsam zu erwärmen und den Abschnitt am Objektträger haften zu lassen.
      HINWEIS: Gewebeschnitte können auch aufgetaut werden, indem eine Kante der Gelatine mit einer Pinzette (gekühlt auf -20 ° C) aufgenommen wird, sie auf den ITO-beschichteten Glasträger gelegt und ein Finger auf die andere Seite des Objektträgers gelegt wird, um das Glas langsam zu erwärmen und den Abschnitt am Objektträger haften zu lassen.
    9. Erkennen Sie die Probe, die als Kalibrant verwendet werden soll (siehe Schritt 2.1.6 für Kalibrantoptionen), indem Sie mit einem hydrophoben Pen einen kleinen Kreis in der Nähe des Gewebeabschnitts zeichnen und das Kalibrant innerhalb des Kreises erkennen.
    10. Markieren Sie jede Ecke der Folie mit einem Whiteout-Stift mit einer kleinen Form, die scharfe Kanten (z. B. x) enthält, die als Teach-Punkte verwendet werden sollen.
    11. Legen Sie das Glasdia in die MALDI Diaadapterplatte und machen Sie einen hochauflösenden (≥2400 DPI) optischen Bildscan mit einem Scanner.
    12. Sprühmatrix auf den Gewebeschnitt mit einem automatisierten Sprühgerät (siehe Materialtabelle für Sprühdetails und Anweisungen).
    13. Für MSI von Neuropeptiden in Krebstiergeweben verwenden Sie 40 mg / ml DHB in 50% Methanol / 0,1% FA (v / v) als Matrix, stellen Sie die Düsentemperatur auf 80 ° C, die Geschwindigkeit auf 1.250 mm / min, die Durchflussrate auf 0,1 ml / min, die Anzahl der Durchgänge auf 12 und 30 s zwischen jedem Durchgang für das automatische Sprühgerät ein.
  2. Datenerfassung
    1. Setzen Sie die vollständig getrocknete Zielplatte ein, die aufgetaute Gewebeabschnitte enthält, die mit der Matrix besprüht wurden.
    2. Richten Sie die Parameter der MS-Bildaufnahmedatei so ein, dass der Laserdurchmesser kleiner als die Rasterschrittgröße ist.
    3. Laden Sie das gescannte optische Bild und kalibrieren Sie die Probenplatte mit den x Teach-Punkten. Definieren Sie die interessierenden Gewebebereiche, die etwas größer als der tatsächliche Gewebeabschnitt gemessen werden sollen, um auch Bereiche einzubeziehen, die nur Matrix enthalten.
    4. Kalibrieren Sie das Gerät und erfassen Sie Spektren im Bereich von 200 - 3200 m/z. Passen Sie den Massenbereich so an, dass er den gewünschten Neuropeptidbereich umfasst.
  3. Datenanalyse
    1. Um Daten zu verarbeiten, importieren Sie den MS-Imaging-Datensatz in die gewünschte Software, wählen Sie einen Algorithmus zum Entfernen der Baseline aus und normalisieren Sie die Daten mithilfe der Gesamtzahl der Ionen.
      HINWEIS: Die Auswahl verschiedener Normalisierungsalgorithmen, wie z. B. Median, RMS-Wert (Root Mean Square) oder die Intensität eines m/z-Referenzwerts, wird wahrscheinlich die räumliche Verteilung vieler m/z-Werte verändern. Wählen Sie den Normalisierungsalgorithmus, der für die gewünschten Analyten am besten geeignet ist.
    2. Um ein Bild für jeden m/z-Wert aus einer theoretischen Peakliste zu generieren, laden Sie eine CSV-Datei (Comma-Separated Values) hoch, die Neuropeptide [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ usw. enthält. Rufen Sie m/z-Werte ab, indem Sie auf Datei > > Spitzenliste importieren klicken. Nennen Sie die Peak-Liste.
    3. Um die geeignete ppm-Fehlerschwelle abzuschätzen, identifizieren Sie zunächst manuell einen Neuropeptid-Peak im MS-Spektrum und vergleichen Sie ihn mit der theoretischen Masse des Neuropeptids. Berechnen Sie den ppm-Fehler, und klicken Sie auf Datei- > Dateieigenschaften > Intervallbreite und ppm-Eingabefehler.
    4. Wählen Sie die Peak-Liste aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf m/z-Bilder für jedes Intervall der Peak-Liste erstellen.
    5. Speichern Sie jedes m/z-Bild, indem Sie auf Screenshot jedes m/z-Bildes speichern klicken.
      HINWEIS: Die mutmaßliche Identifizierung von Neuropeptiden kann durchgeführt werden, indem m / z-Bilder identifiziert werden, bei denen das Analytsignal nur innerhalb des Gewebes und nicht in der umgebenden Matrix lokalisiert ist.
    6. Um die Spitzenidentität zu überprüfen, generieren Sie eine Liste interessanter m/z und führen Sie MS/MS-Experimente durch.

4. Entdeckung neuartiger mutmaßlicher Neuropeptide mittels De-novo-Sequenzierung

  1. Führen Sie die Schritte 1.4.2 - 1.4.5 aus.
  2. Exportieren Sie de novo only Peptide.csv aus der PEAKS-Software mit einem durchschnittlichen ALC-Score (Local Confidence) von ≥ 75.
    HINWEIS: Es gibt viele Software, um De-novo-Sequenzierung durchzuführen, jede mit ihren eigenen Scoring-Algorithmen und sollte entsprechend bewertet werden.
  3. Durchsuchen Sie die Peptidliste nach bekannten Sequenzmotiven, die auf Neuropeptide hinweisen, die zu bestimmten Neuropeptidfamilien gehören19.
    HINWEIS: Während Motive in der Regel artübergreifend gut konserviert sind, sollten die gesuchten Motive unter Berücksichtigung des Probenorganismus ausgewählt werden.

5. Transkriptom-Mining für vorhergesagte Neuropeptidsequenzen

HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und wird nur verwendet, um eine vorhandene Neuropeptiddatenbank hinzuzufügen oder eine neue Neuropeptiddatenbank zu erstellen.

  1. Wählen Sie eine bekannte Preprohormon-Aminosäuresequenz von Interesse und verwenden Sie tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome), um die Präprohormonsequenz der Abfrage anhand von Datenbanken wie nr/nt, Refseq_genomes, EST und TSA zu durchsuchen.
    HINWEIS: Um Abfragesequenzen anhand der Proteindatenbank zu durchsuchen, verwenden Sie BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Wählen Sie den Zielorganismus (Steuer-ID) aus und ändern Sie die Parameter des Algorithmus "Schwellenwert erwarten" in 1000, um Low-Score-Ausrichtungen einzubeziehen.
    2. Führen Sie das BLAST-Programm aus, und überprüfen Sie dann die Ergebnisse auf hohe Homologiewerte zwischen Abfrage- und Subjektsequenzen, die zu signifikanten Ausrichtungen führen. Speichern Sie die FASTA-Datei mit der Nukleotidsequenz.
      HINWEIS: Wenn es mehrere Subjektsequenzen mit ähnlichen Homologiewerten gibt, führen Sie eine MAFT-Ausrichtung durch, um die mutmaßlichen Sequenzen20,21 einzugrenzen.
  2. Übersetzen Sie die Präprohormon-Nukleotidsequenz in Präprohormon-Peptidsequenzen mit dem Expasy Translate-Tool (https://web.expasy.org/translate/). Für C. sapidus wählen Sie Invertebrate Mitochondrial für genetischen Code.
  3. Überprüfen Sie die Signalpeptidsequenz und die Prohormonspaltungsstellen in den Peptidsequenzen mit SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    HINWEIS: Die Homologie zu bekannten Präprohormon-Verarbeitungsschemata kann auch verwendet werden, um Prohormon-Spaltungsstellen zu identifizieren. Mögliche posttranslationale Modifikationen für Signalpeptide können auf Wunsch vorhergesagt werden. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) kann verwendet werden, um den Sulfatierungszustand von Tyrosinresten vorherzusagen. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) kann verwendet werden, um die Konnektivität von Disulfidbindungen vorherzusagen.

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Ergebnisse

Der Workflow für die Probenvorbereitung und MS-Analyse ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Dissektion von neuronalem Gewebe werden Homogenisierung, Extraktion und Entsalzung durchgeführt, um Neuropeptidproben zu reinigen. Ist eine isotopenmarkierungsbasierte Quantifizierung gewünscht, werden die Proben markiert und erneut entsalzt. Die resultierende Probe wird mittels LC-MS/MS zur Identifizierung und Quantifizierung von Neuropeptiden analysiert.

Neuropeptide,...

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Diskussion

Die genaue Identifizierung, Quantifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden und endogenen Peptiden im Nervensystem sind entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion23,24. Die Massenspektrometrie ist eine leistungsstarke Technik, mit der all dies auch in Organismen ohne vollständig sequenziertes Genom erreicht werden kann. Die Fähigkeit dieses Protokolls, Neuropeptide aus Gewebe, das von C. sapidus durch eine Kombination von LC-ESI- und MALDI-MS ge...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der National Science Foundation (CHE-1710140 und CHE-2108223) und den National Institutes of Health (NIH) durch den Zuschuss R01DK071801 unterstützt. A.P. wurde zum Teil durch den NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505) unterstützt. N.V.Q. wurde zum Teil von den National Institutes of Health im Rahmen des Ruth L. Kirschstein National Research Service Award des National Heart Lung and Blood Institute an das University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936) unterstützt. L.L. möchte die NIH-Zuschüsse R56 MH110215, S10RR029531 und S10OD025084 sowie die finanzielle Unterstützung durch eine Vilas Distinguished Achievement Professorship und eine Charles Melbourne Johnson Professorship mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation und der University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy anerkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemikalien, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien
2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) MatrixSupelco39319
EssigsäureFisher ChemicalA38S-500
Acetonitril Optima LC/MS-QualitätFisher ChemicalA955-500
AmmoniumbicarbonatSigma-Aldrich9830
BoranpyridinSigma-Aldrich179752
Bruker Peptid-KalibrierungsmischungBruker DaltonicsNC9846988
CapillaryPolymicro1068150019zur Herstellung von Nanoflow-Säulen (75 &; Mikro; m Innendurchmesser x 360 µ m Außendurchmesser)
Kryostat-BecherSigma-AldrichE6032jeder Becher oder jede Form sollte funktionieren
  MikrozentrifugenröhrchenEppendorf30108434
FormaldehydSigma-Aldrich252549
Formaldehyd - D2Sigma-Aldrich492620
Ameisensäure Optima LC/MS-QualitätFisher ChemicalA117-50
GelatineDifco214340Platz in 37 > C-Wasserbad zum Schmelzen
Hydrophober BarrierestiftVector Labs15553953
Indiumzinnoxid (ITO) beschichtete ObjektträgerDelta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0,8 mm (Breite x Länge x Dicke)
LC-MS-FläschchenThermoTFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS GradeFisher ChemicalA456-500
ParafilmSigma-AldrichP7793Hydrophobe Folie
pH-IndikatorstreifenSupelco109450
Rote PhosphorclusterSigma-Aldrich343242
Umkehrphase C18 MaterialWasser186002350manuell in Nanoflow-Säule verpackt
Ohne StiftBIC150810
ZipTipMilliporeZ720070
Instrumente und Werkzeuge
Automatisches Matrixsprühsystem - M5HTX Technologies, LLC
Zentrifuge - 5424 REppendorf05-401-205
Kryostat - HM 550Thermo Fisher Scientific956564A
TrockenmittelDrierit2088701
PinzetteWPI501764
MALDI Edelstahl ZielplatteBruker Daltonics8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391200 µ L
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupol-OrbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics
SpeedVac - SVC100SavantSVC-100D
UltraschallreinigerBransonic2510R-MTHfür die Beschallung
Ultraschall-HomogenisatorFisher ScientificFB120110FB120 Sonic Dismembrator mit CL-18 Sonde
Vakuumpumpe - Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976Enddruck = 1 x 10-4 Torr
Vortex MixerCorning6775
Wasserbad (37C) - Isotemp 110Fisher Scientific15-460-10
Datenanalysesoftware
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysisBruker Daltonics
FlexControlBruker Daltonics
FlexImagingBruker Daltonics
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Labhttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn& PAGE_
TYPE=BlastSearch& SHOW_
STANDARDEINSTELLUNGEN=AN& LINK_LOC
=Sprengheim
mit

Referenzen

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Neuropeptid-CharakterisierungMassenspektrometrieendogene PeptideMALDI-MSFlüssigchromatographie-MSPeptidquantifizierungGewebeextraktionBiomarker-EntdeckungDe-novo-Sequenzierung
Facettenreiche massenspektrometrische Untersuchung von Neuropeptiden in Callinectes sapidus
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