Summary
En modificeret postfikseringsprocedure øger kontrasten mellem glykogenpartikler i væv. Dette papir giver en trinvis protokol, der beskriver, hvordan man håndterer vævet, udfører billeddannelsen og bruger stereologiske metoder til at opnå upartiske og kvantitative data om fibertypespecifik subcellulær glykogenfordeling i skeletmuskulaturen.
Abstract
Ved brug af transmissionselektronmikroskopi kan der opnås billeder i høj opløsning af faste prøver indeholdende individuelle muskelfibre. Dette muliggør kvantificeringer af ultrastrukturelle aspekter såsom volumenfraktioner, overfladeareal til volumenforhold, morfometri og fysiske kontaktsteder for forskellige subcellulære strukturer. I 1970'erne blev der udviklet en protokol til forbedret farvning af glykogen i celler og banede vejen for en række undersøgelser af den subcellulære lokalisering af glykogen og glykogenpartikelstørrelse ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi. Mens de fleste analyser fortolker glykogen, som om det er homogent fordelt i muskelfibrene, hvilket kun giver en enkelt værdi (f.eks. En gennemsnitlig koncentration), har transmissionselektronmikroskopi afsløret, at glykogen opbevares som diskrete glykogenpartikler placeret i forskellige subcellulære rum. Her beskrives den trinvise protokol fra vævsopsamling til kvantitativ bestemmelse af volumenfraktionen og partikeldiameteren af glykogen i de forskellige subcellulære rum i individuelle skeletmuskelfibre. Overvejelser om, hvordan man 1) indsamler og pletter vævsprøver, 2) udfører billedanalyser og datahåndtering, 3) evaluerer estimaternes præcision, 4) diskriminerer mellem muskelfibertyper, og 5) metodiske faldgruber og begrænsninger indgår.
Introduction
Glykogenpartikler består af forgrenede polymerer af glucose og forskellige associerede proteiner1 og udgør et vigtigt brændstof under høje metaboliske krav2. Selvom de ikke er bredt anerkendt, udgør glykogenpartikler også et lokalt brændstof, hvor nogle subcellulære processer fortrinsvis bruger glykogen på trods af tilgængeligheden af andre og mere langvarige brændstoffer som plasmaglukose og fedtsyrer3,4.
Betydningen af at lagre glykogen som et subcellulært specifikt lokaliseret brændstof er blevet diskuteret i flere anmeldelser5,6 hovedsageligt baseret på nogle af de tidligste dokumentationer af den subcellulære fordeling af glykogen ved transmissionselektronmikroskopi (TEM)7,8. De første undersøgelser brugte forskellige protokoller til at øge glykogens kontrast fra histokemiske farvningsteknikker til negative og positive farvninger9,10. En vigtig metodologisk udvikling var den raffinerede postfikseringsprotokol med det kaliumferrocyanidrerede osmium11,12,13,14, hvilket signifikant forbedrede kontrasten mellem glykogenpartikler. Denne raffinerede protokol blev ikke brugt i noget af det banebrydende arbejde med træningsinduceret glykogenudtømning15, men blev genindført af Graham og kolleger16,17.
Baseret på de 2-dimensionelle billeder beskrives den subcellulære fordeling af glykogen oftest som glykogenpartikler placeret i tre puljer: subsarcolemmal (lige under overflademembranen), intermyofibrillær (mellem myofibrillerne) eller intramyofibrillær (inden for myofibrillerne). Glykogenpartikler kan dog også beskrives som associeret med for eksempel sarkoplasmatiske retikulum7 eller kerner18. Ud over den subcellulære fordeling er fordelen ved TEM-estimeret glykogenindhold også, at kvantificering kan udføres på enkeltfiberniveau. Dette muliggør undersøgelse af fiber-til-fiber variabilitet og korrelative analyser med fibertyper og cellulære komponenter som mitokondrier og lipiddråber.
Her beskrives protokollen for det TEM-estimerede fibertypespecifikke volumetriske indhold af de tre almindelige subcellulære puljer af glykogen (subsarcolemmal, intermyofibrillar og intramyofibrillar) i skeletmuskelfibre. Metoden er blevet anvendt på skeletmuskler fra mennesker19, rotter20 og mus21; samt fugle og fisk22; og kardiomyocytter fra rotter23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nærværende protokol med humane biopsierede skeletmuskelprøver er godkendt af Regionernes Sundhedsavistiske Komitéer for Syddanmark (S-20170198). Muskelbiopsier blev opnået gennem et snit i huden fra vastus lateralis-musklen ved hjælp af en Bergström-nål med sugning, efter at lokalbedøvelse blev givet subkutant (1-3 ml lidokain 2% pr. Snit). Hvis der blev anvendt isolerede hele rottemuskler, blev dyrene ofret ved cervikal forskydning, inden muskelbiopsierne blev opnået, i overensstemmelse med retningslinjerne fra den dyreetiske komité på Odense Universitetshospital.
1. Primær fiksering, efterfiksering, indlejring, sektionering og kontrastering
- Forbered 1,6 ml primær fikseringsopløsning (2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkacodylatbuffer (pH 7,3)) i et 2 ml mikrocentrifugeringsrør. Opbevar det ved 5 °C i højst 14 dage.
- Fra muskelbiopsi eller hele musklen isoleres en lille prøve, som har en maksimal diameter på 1 mm i enhver retning og er lidt længere i længderetningen end tværsnit (til orienteringsformål).
- Prøven anbrings i røret, der indeholder den kolde primære fikseringsopløsning. Opbevar den ved 5 °C i 24 timer.
- Prøven vaskes fire gange (15 minutter mellem hver vask) i 0,1 M natriumkacodylatbuffer (pH 7,3). Brug overførselspipetter til at fjerne den brugte buffer fra røret og lade prøven være uberørt, og tilsæt derefter den friske buffer.
BEMÆRK: Efter den endelige vask kan prøven opbevares i 0,1 M natriumkacodylatbufferen ved 5 °C i flere måneder11. Protokollen kan sættes på pause her. - Postfix med 1 % osmiumtetroxid (OsO4) og 1,5 % kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) i 0,1 M natriumkacodylatbuffer (pH 7,3) i 120 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Anvendelsen af 1,5% kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) er afgørende for en optimal kontrast af glykogenpartikler11,12,13. - Skyl to gange i dobbeltdestilleret vand ved stuetemperatur (RT).
- Dehydrer ved at nedsænke i en gradueret serie af alkohol (ethanol) ved RT ved hjælp af følgende koncentrationer: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) og 100% (10 min).
BEMÆRK: I hvert trin nedsænkes prøven i ethanol, som efterfølgende kun fjernes delvist for at undgå tørring af prøven. Til sidst kasseres den resterende ethanol. - Infiltreres med klassificerede blandinger af propylenoxid og epossidisk harpiks ved RT ved hjælp af følgende volumenforhold (propylenoxid/epossidisk harpiks): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (natten over). Den følgende dag indlejres prøver i 100% frisk epossidisk harpiks i forme og polymeriseres ved 60 ° C i 48 timer.
BEMÆRK: Denne graduerede metode er i henhold til de tidligere protokoller11,12. Protokollen kan sættes på pause her. - Skær ultratynde (60-70 nm) sektioner af langsgående orienterede fibre og saml dem på et-huls kobbergitter som følger.
- Monter blokken af en prøve på ultramikrotomholderen.
- Trim blokken på overfladen med et barberblad for at nå vævets niveau.
- Monter en diamantkniv (ultrasnit 45) foran prøven, og juster prøveoverfladen parallelt med kniven.
- Fremstil en halvtynd (1 μm) sektion med diamantkniven for at kontrollere prøvens retning. Plet den halvtynde sektion med toluidinblå til observation med lysmikroskopi.
- Trim blokken yderligere for at reducere interesseområdet for at få ordentlige ultratynde sektioner.
- Skær ultratynde (60-70 nm) sektioner med en anden diamantkniv (ultraslebne 45).
- Saml 1-2 sektioner på et-hullers kobbergitter ved hjælp af en Perfect Loop.
BEMÆRK: Et-huls kobbergitter har et enkelt hul i midten med Formvar understøttende membran.
- Kontrastsektioner med uranylacetat og blycitrat ved at nedsænke ovennævnte gitter i uranylacetatopløsning (0,5 % i dobbeltdestilleret vand) i 20 minutter og derefter i blycitratopløsning (1 % i dobbeltdestilleret vand) i 15 minutter. Vask gitterene i dobbeltdestilleret vand mellem og efter de to pletter.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
2. Billeddannelse
- Tænd transmissionselektronmikroskopet (betjenes ved en accelererende spænding på 80 kV), computer og billedoptagelsessoftware. Optag digitale billeder med et digitalt ccd-kamera med langsom scanning på 2 k x 2 k og den tilhørende billedbehandlingssoftware.
- Indsæt gitteret med flere sektioner i mikroskopfasen.
- Skærm gitteret i første omgang ved lav forstørrelse (f.eks. x100) for at bestemme kvaliteten af sektioner (dvs. huller i understøtningsmembranen, snavs osv.), Og vælg sektioner af bedste kvalitet. Ved lav forstørrelse bestemmes muskelfibrenes retning.
- Øg derefter forstørrelsen med strålen centreret på en perifer fiber i sektionen. Fokuser billedet ved forstørrelse over 30 k for at sikre tilstrækkelige fine detaljer i billedet, styret af en Real-Time Fast Fourier Transformation, hvis tilgængelig. Til sidst skal du optage billeder med 1 s eksponeringstid ved den ønskede forstørrelse.
- Erhverv i alt 24 billeder af en tilfældigt udvalgt fiber, dvs. 12 billeder af det myofibrillære rum og 12 billeder af det subsarkolemmale rum ved en forstørrelse mellem 10 k og 40 k. Sørg for, at billederne fordeles over fiberens længde og bredde i en randomiseret, men systematisk rækkefølge for at opnå upartiske resultater (figur 1A).
BEMÆRK: Den optimale forstørrelse afhænger af den tilgængelige kameraopløsning og størrelsen på mikrograferne. Målet er at opnå en endelig opløsning, hvor glykogenpartikeldiametre kan måles inden for 1 nm trin, og at inkludere et samlet areal af det myofibrillære område på mindst 70 μm2 og en samlet længde af fiberen på mindst 25 μm fordelt på 12 billeder af det myofibrillære rum og 12 billeder af det subsarkolemmale rum pr. fiber, henholdsvis. De 24 billeder pr. fiber vil sandsynligvis give en præcision (fejlkoefficient) af det volumetriske indhold i de forskellige glykogenpuljer mellem 0,1 og 0,2 i individuelle fibre fra menneske-, rotte- og museskeletmuskler20,21,24 (figur 2E). - Gentag trin 2.4 og 2.5, indtil i alt 6-10 fibre er afbildet. Hvis det er nødvendigt, skal du skære yderligere sektioner (adskilt af mindst 150 μm for at undgå overlapning af allerede afbildede fibre) og gentage trin 1,9-2,5.
3. Billedanalyser
- Importer billeder til ImageJ ved at klikke på Filer > Åbn.
- Indstil global skala, så den passer til billedets oprindelige størrelse, ved at klikke på Analysér > Indstil skala.
- Zoom 100% ind ved at klikke på Billede > Zoom > ind.
- Mål tykkelsen af en Z-disk pr. billede af det myofibrillære rum (12 pr. fiber) ved hjælp af værktøjet Lige linje i menuen Funktioner (figur 1D). Beregn den gennemsnitlige Z-skivetykkelse for hver af de 6-10 fibre.
- Definer 2-3 fibre med den tykkeste gennemsnitlige Z-skive som type 1-fibre og 2-3 fibre med den tyndeste gennemsnitlige Z-skive som type 2-fibre. Se bort fra de mellemliggende 2-4 fibre for yderligere analyser (figur 1E).
BEMÆRK: Følgende trin gentages for hver af de 4-6 fibre fra prøven. Glykogenvolumenfraktionerne estimeres ved punkttælling som beskrevet andetsteds25,26. Størrelsen af gitterene vælges for at opnå en tilfredsstillende høj præcision af estimaterne. Dette opnås ofte ved at opnå 250 hits, som derefter dikterer det samlede antal nødvendige point og igen arealet pr. Punkt. - Brug værktøjet Segmenteret linje til at måle længden af den yderste myofibriller, der er synlig lige under det subsarkolemmale område (figur 2A).
BEMÆRK: Denne længde bruges til at udtrykke subsarcolemmal glykogen pr. overfladeareal (dvs. længden af den yderste myofibriller ganget med sektionens tykkelse (60 nm); se trin 4.5). Derfor er kun den subsarcolemmale region, som er repræsenteret af denne længde, inkluderet i analysen. - Indsæt et gitter ved at klikke på Analysér > værktøjer > gitter , og indstil areal pr. punkt til 32.400 nm2. Tæl antallet af hits inden for den tilgængelige længde i de 12 subsarcolemmale billeder, hvor et kryds rammer det subsarkolemmale glykogen (figur 2A). Et hit defineres som en glykogenpartikel, der er til stede i øverste højre hjørne af et kryds.
- Indsæt et gitter ved at klikke på Analysér > værktøjer > gitter , og indstil areal pr. punkt til 160.000 nm2. Tæl antallet af hits i de 12 myofibrillære billeder, hvor et kryds rammer det intramyofibrillære rum (figur 2B).
- Indsæt et gitter ved at klikke på Analysér > værktøjer > gitter , og indstil areal pr. punkt til 3.600 nm2. Tæl antallet af hits i de 12 myofibrillære billeder, hvor et kryds rammer det intramyofibrillære glykogen (figur 2C).
- Indsæt et gitter ved at klikke på Analysér > værktøjer > gitter , og indstil areal pr. punkt til 32.400 nm2. Tæl antallet af hits i de 12 myofibrillære billeder, hvor et kryds rammer det intermyofibrillære glykogen (figur 2D).
- Ved hjælp af Straight Line-værktøjet måles diameteren af fem tilfældigt udvalgte glykogenpartikler i hver pool for hvert af de 12 billeder for at opnå et gennemsnit på 60 partikler pr. Pool pr. Fiber.
BEMÆRK: Gennemsnittet på 60 partikler dækker stort set variationen i fiberen (figur 2F).
4. Beregninger
- Beregn den tilsyneladende arealfraktion (AA) af det intramyofibrillære rum pr. myofibrillært rum som summen af alle hits divideret med summen af alle punkter fra de 12 billeder (fra trin 3.8).
- Beregn den tilsyneladende arealfraktion af intramyofibrillært glykogen pr. myofibrillært område, intermyofibrillært glykogen pr. myofibrillært område og subsarcolemmal glykogen pr. Billedområde som summen af alle hits divideret med summen af alle punkter fra de 12 billeder (fra trin 3.7, 3.9 og 3.10).
- Beregn volumenfraktionen (VV) af henholdsvis intramyofibrillært, intermyofibrillært og subsarcolemmalt glykogen som den tilsyneladende arealfraktion (AA) minus produktet af overfladetæthed (SV) med sektionstykkelse (t), hvor overfladetætheden er den numeriske masse af partikler ganget med den gennemsnitlige partikeloverflade:
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
hvor
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
t = 0,06 μm
H = partiklernes gennemsnitlige diameter (μm)
BEMÆRK: Volumenfraktionen er mindre end den tilsyneladende arealfraktion på grund af bidraget fra hætter fra partikler med deres centrum uden for skiven25. - For at udtrykke intramyofibrillært glykogen pr. intramyofibrillært rum divideres arealfraktionen af intramyofibrillært glykogen (trin 4.2) med arealfraktionen af det intramyofibrillære rum (trin 4.1). Det intermyofibrillære glykogen udtrykkes pr. myofibrillært rum som beregnet i det foregående trin (trin 4.3).
- For at udtrykke subsarcolemmal glykogen pr. overfladeareal af fiberen (VS) (yderste myofibriller) skal volumenfraktionen af glykogen konverteres til en absolut mængde ved at multiplicere med billedets volumen (produkt af areal- og sektionstykkelse) og dividere med produktet af gennemsnitlig tilgængelig længde (fra trin 3.6) med sektionstykkelse (t).
- Det samlede volumetriske glykogenindhold anslås ved hjælp af værdierne fra trin 4.1, 4.4 og 4.5 som følger:
Myofibrillært glykogen = Intermyofibrillært glykogen + (intramyofibrillært glykogen · arealfraktion af intramyofibrillært rum)
Ved at antage en gennemsnitlig fiberradius på 40 μm27 er volumen til overfladeforholdet 20: 1, så total glykogen er:
Total glykogen (VV) = Myofibrillært glykogen + (subsarcolemmalt glykogen (VS) / 20)
BEMÆRK: Volumen-til-overflade-forholdet på 20:1 kan variere fra fiber til fiber afhængigt af den faktiske fiberstørrelse og størrelsen af det subsarkolemmale område. Dette tages ikke i betragtning med denne protokol. - Herfra beregnes det relative bidrag fra hver pulje som brøkdele af total glykogen:
Intermyofibrillært glykogen / Total glykogen = Intermyofibrillært glykogen / Total glykogen
Intramyofibrillært glykogen / Total glykogen = (Intramyofibrillært glykogen · arealfraktion af intramyofibrillært rum) / Total glykogen
Subsarcolemmal glykogen / Total glykogen = Subsarcolemmal glykogen / 20 / Total glykogen - For hver glykogenpulje beregnes fejlkoefficienten (CE), som udtrykker usikkerheden ved glykogenestimatet på fiberniveau baseret på antallet af billeder (n), det samlede antal kryds i hvert billede (x) og antallet af kryds, der rammer glykogen i den relevante pool i hvert billede (y) som følger28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol fremstår glykogenpartikler sorte og tydelige (figur 1 og figur 2). De normale værdier af glykogen er afbildet i figur 3. Disse data er baseret på i alt 362 fibre fra 41 raske unge mænd som indsamlet i forskellige tidligere undersøgelser19,24,29,30,31. Her kan det ses, at intermyofibrillære glykogenværdier fordeles tæt på det normale, mens både intramyofibrillært og subsarcolemmalt glykogen viser en skæv fordeling, hvor fibre undertiden har en for stor mængde glykogen. Det er vigtigt at bemærke, at i muskelfibre i normal størrelse (diameter på 60-80 μm) er intermyofibrillær glykogen den største pool, der udgør omkring 80% af det samlede glykogenindhold. Intramyofibrillært og subsarkolemmalt glykogen udgør hver især ca. 10 % af det samlede indhold.
Figur 1: Billeddannelse og fibertypning. (A) Hver fiber er afbildet i en randomiseret systematisk rækkefølge. (B) Eksempel på et billede fra det subsarkolemmale rum. (C) Eksempel på et billede fra det myofibrillære rum. (D) I hvert myofibrillært billede måles bredden af en Z-skive (røde linjer). Målingerne af i alt 12 Z-skiver (én pr. billede) giver en fejlkoefficient på ca. 0,03. (E) Den typiske fordeling af den gennemsnitlige fiber Z-skivebredde i 6-10 fibre af hver af de 10 biopsier. Fra hver biopsi defineres 2-3 fibre som type 1 og 2 baseret på den inden-biopsifordeling. Billederne stammer fra en biopsi af m. vastus lateralis af en styrkeløfter, der indgår i en tidligere undersøgelse29. m: mitokondrier og Z: Z-skive. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Glykogenanalyser. (A) Subsarcolemmal glykogenvolumen pr. overfladeareal estimeres ved punkttælling ved hjælp af en gitterstørrelse på 180 nm x 180 nm inden for et område defineret ved længden af den yderste myofibr og det subsarkolemmale område vinkelret på denne længde (blå prikkede linjer). (B) Den myofibrillære volumenfraktion anslås ved punkttælling ved hjælp af en gitterstørrelse på 400 nm x 400 nm. (C) Volumenfraktionen af intramyofibrillært glykogen estimeres ved punkttælling ved hjælp af en gitterstørrelse på 60 nm x 60 nm. D) Volumenfraktionen af intermyofibrillært glykogen anslås ved punkttælling ved hjælp af en gitterstørrelse på 180 nm x 180 nm. I A-D angiver de røde cirkler hits (et kryds, der rammer en glykogenpartikel). (E) Den estimerede fejlkoefficient for et stereologisk forholdsestimat24 for 2 til 12 analyserede billeder. Fejlkoefficienten anslås på grundlag af antallet af optællinger og varierer derfor mellem prøverne baseret på glykogenkoncentrationen. Det er ofte relativt lavt, når glykogenindholdet er højt og omvendt. (F) Variationskoefficienten for glykogenpartikeldiameter efter måling af 2-99 partikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Normale værdier af de tre subcellulære puljer af glykogen i skeletmuskulaturen. Violinplottene er baseret på 362 fibre fra 41 raske unge mænd (18-39 år). Fibrene stammer fra tidligere undersøgelser, hvor biopsier fra m. vastus lateralis i hvile- eller kontroltilstand blev opnået19,24,29,30,31. Værdier vises som et boksplot med en markør for medianen og en boks, der angiver det interkvartile område. Linjerne repræsenterer øvre og nedre tilstødende værdier. Kasserne er overlejret af kernetæthedsplots. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det kritiske trin i metoden er anvendelsen af reduceret osmium med kaliumferrocyanid under postfiksering. Selektiviteten af dette modificerede fikseringsmiddel til glykogendetektion kan ikke forklares fuldt ud af kemi, men omfatter også eksperimentelle fund, der ikke viser nogen påvisning af sådanne partikler i væv, der vides at være fri for glykogen eller i det ekstracellulære rum11.
Kritiske parametre er præcisionen af estimaterne og fiber-til-fiber-variationen. Ved at følge den nuværende protokol til billeddannelse opnås en fejlkoefficient mellem 0,1 og 0,2 af estimaterne af de forskellige puljer af glykogen pr. Fiber. Denne fejlforekomst ligger et godt stykke under variationen mellem de enkelte fibre (figur 3). Det opfordres til at indberette sådanne præcisionsestimater ved estimering af det volumetriske indhold af glykogen. Den præsenterede fibertypemetode er valideret mod myosin ATPase isoform29. Z-skivetykkelsen og mitokondrievolumenfraktionen kan også anvendes i kombination til at indikere fibertype, men ikke mitokondrievolumenfraktion alene32.
De største begrænsninger ved metoden er manglende evne til at detektere de meget små glykogenpartikler, og at profiler af glykogenpartikler kan overlappe hinanden i det projicerede billede28. Den første begrænsning ugyldiggør et sandt mål for den gennemsnitlige partikelstørrelse. Dette bliver en alvorlig bias, når glykogenpartiklerne nedbrydes under høje metaboliske krav, mens bias kan være ubetydelig, når glykogenpartiklerne vokser fra medium til en større størrelse under glykogenresyntese eller superkompensation. Selvom dette kan have enorme konsekvenser for estimatet af den gennemsnitlige glykogenpartikelstørrelse ved lave glykogenniveauer, er estimaterne af volumetriske glykogenkoncentrationer robuste, da små, uobserverede glykogenpartikler bidrager meget lidt til det samlede glykogenindhold. Den anden begrænsning stammer fra tilstanden, hvor glykogenpartiklerne er meget mindre end tykkelsen af sektionerne. Denne bias er for det meste til stede ved meget høje glykogenkoncentrationer og kunne undersøges ved at sammenligne glykogenvolumenfraktionerne af sektioner med forskellige tykkelser. Hvis en tykkere sektion ikke er parallelt med en fraktion med højt glykogenvolumen, skal det skyldes en undervurdering på grund af mere overlappende partikler i det tykkeste afsnit. I tidligere undersøgelser korrelerer glykogenvolumenfraktionen med glykogenkoncentrationen inden for området fra 50 til 600 mmol kg dw-1 , hvilket indikerer ingen udtalt overlapning af partikler. Men hvis glykogenkoncentrationen stiger over dette niveau, er der ingen stigning i intermyofibrillært glykogen, der indikerer overlapning33. Dette kan løses ved at ekstrapolere forholdet mellem glykogenvolumenfraktionen og koncentrationen ved de lavere glykogenkoncentrationer.
Baseret på nm-opløsningen fra TEM er denne protokol i øjeblikket den eneste metode til at estimere den subcellulære fordeling af glykogen. Derudover tillader metoden også en storstilet kvantitativ tilgang (som beskrevet her), hvor kvantitative værdier kan opnås på enkeltfiberniveau. Dette er af enorm betydning i skeletmuskler med høj heterogenitet i fiberrekruttering under forskellige former for træning2, hvor glykogenafhængige træthedsmekanismer kun forekommer i nogle fibre. Metoden har også potentiale for andre excitable væv som kardiomyocytter, hvor glykogen er kendt for at være afgørende for normal hjertefunktion og kritisk under iskæmi23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den svenske olympiske komité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
