Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Ein modifiziertes Postfixationsverfahren erhöht den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe. Dieses Papier bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das beschreibt, wie man mit dem Gewebe umgeht, die Bildgebung durchführt und sterelorische Methoden verwendet, um unvoreingenommene und quantitative Daten über die fasertypspezifische subzelluläre Glykogenverteilung in der Skelettmuskulatur zu erhalten.

Zusammenfassung

Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie können hochauflösende Bilder von fixierten Proben mit einzelnen Muskelfasern gewonnen werden. Dies ermöglicht die Quantifizierung ultrastruktureller Aspekte wie Volumenanteile, Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisse, Morphometrie und physikalische Kontaktstellen verschiedener subzellulärer Strukturen. In den 1970er Jahren wurde ein Protokoll zur verstärkten Färbung von Glykogen in Zellen entwickelt, das den Weg für eine Reihe von Studien zur subzellulären Lokalisation von Glykogen und Glykogenpartikelgröße mittels Transmissionselektronenmikroskopie ebnete. Während die meisten Analysen Glykogen so interpretieren, als ob es homogen in den Muskelfasern verteilt wäre und nur einen einzigen Wert (z. B. eine durchschnittliche Konzentration) liefert, hat die Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt, dass Glykogen als diskrete Glykogenpartikel gespeichert ist, die sich in verschiedenen subzellulären Kompartimenten befinden. Hier wird das Schritt-für-Schritt-Protokoll von der Gewebeentnahme bis zur quantitativen Bestimmung des Volumenanteils und des Partikeldurchmessers von Glykogen in den verschiedenen subzellulären Kompartimenten einzelner Skelettmuskelfasern beschrieben. Überlegungen zum 1) Sammeln und Färben von Gewebeproben, 2) Durchführen von Bildanalysen und Datenverarbeitung, 3) Bewerten der Genauigkeit von Schätzungen, 4) Unterscheiden zwischen Muskelfasertypen und 5) methodische Fallstricke und Einschränkungen sind enthalten.

Einleitung

Glykogenpartikel bestehen aus verzweigten Polymeren der Glukose und verschiedenen assoziierten ^Proteinen1 und stellen einen wichtigen Brennstoff bei hohen Stoffwechselanforderungen ^dar2. Obwohl nicht allgemein anerkannt, stellen Glykogenpartikel auch einen lokalen Brennstoff dar, bei dem einige subzelluläre Prozesse trotz der Verfügbarkeit anderer und langlebigerer Brennstoffe wie Plasmaglukose und Fettsäuren bevorzugt Glykogen ^{verwenden3,4.}

Die Bedeutung der Speicherung von Glykogen als subzellulärer spezifischer lokalisierter Brennst....

Protokoll

Das vorliegende Protokoll mit humanen biopsierten Skelettmuskelproben wurde von den Regionalkomitees für Gesundheitsforschungsethik für Süddänemark genehmigt (S-20170198). Muskelbiopsien wurden durch einen Schnitt in der Haut aus dem Musculus vastus lateralis unter Verwendung einer Bergström-Nadel mit Absaugung erhalten, nachdem die Lokalanästhesie subkutan verabreicht wurde (1-3 ml Lidocain 2% pro Einschnitt). Wenn isolierte ganze Rattenmuskeln verwendet wurden, wurden die Tiere durch Zervixdislokation geopfert, bevor die Muskelbiopsien gemäß den Richtlinien der Tierethikkommission am Universitätskrankenhaus Odense, Dänemark, erhalten wurden.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Protokolls erscheinen Glykogenpartikel schwarz und deutlich (Abbildungen 1 und Abbildung 2). Die Normalwerte von Glykogen sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Daten basieren auf insgesamt 362 Ballaststoffen von 41 gesunden jungen Männern, die in verschiedenen früheren Studien gesammelt wurden19,24,29,30,31.

Diskussion

Der kritische Schritt der Methode ist die Verwendung von reduziertem Osmium durch Kaliumferrocyanid während der Postfixation. Die Selektivität dieses modifizierten Fixiermittels für den Glykogennachweis kann nicht vollständig durch die Chemie erklärt werden, sondern umfasst auch experimentelle Ergebnisse, die zeigen, dass solche Partikel in Geweben, von denen bekannt ist, dass sie frei von Glykogen sind, oder im extrazellulären Raum nicht nachgewiesen ^wurden11.

Kritisch.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,2-Propylenoxid	Merck	75-56-9
Embedding 812 Harz Medium Kit	Taab	T031
Glutaraldehydlösung 25%	Merck	1.04239.0250
ARTIKEL	Olympus		Imaging Software
Leica EM AC20	Leica		Automatisches Kontrastsystem
OSIS Veleta Digitalkamera	Olympus
Osmiumtetroxid 4%ige Lösung	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Kaliumhexacyanoferrat (II)-Trihydrat	Sigma-Aldrich	455989-245G
Natriumcacodylatpuffer 0,2 M ph 7,4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultramikrotom Leica UC7	Leica
Ultrostain Bleicitrat 3%, stabilisierte Lösung	Leica	16707235
Uranylacetat-Dihydrat	Polysciences	6159-44-0