En open source, fuldt tilpasselig 5-valgs seriel reaktionstidsopgaveværktøjskasse til automatiseret adfærdsmæssig træning af gnavere

Summary

Den nuværende protokol beskriver udviklingen af en open source 5-choice seriel reaktionstidsopgavekasse til gnaverdyrsmodeller ved hjælp af Arduino og relateret hardware og en alsidig Matlab-værktøjskasse, herunder et valgfrit script til automatiseret adfærdstræning. Scriptene kan tilpasses og letter implementeringen af forskellige trial-and-test-designs.

Abstract

Den 5-valgs serielle reaktionstidsopgave (5-CSRTT) er en adfærdstest, der ofte bruges til at studere visuospatial opmærksomhed og impulsivitet hos gnavere. Opgaven kræver, at dyrene tildeler opmærksomhed til et vandret udvalg af fem små åbninger udstyret med lyskilder og inden for et tidsbegrænset vindue næsestikker en oplyst målblænde for at få en madbelønning på madmagasinet placeret i den modsatte væg af kammeret. Opgaven overvejer adfærdsmæssige kontrolforanstaltninger såsom responsnøjagtighed og reaktionstider og giver mulighed for at udlede selektiv opmærksomhed og impulsivitet. Opgavevanskeligheder kan styres ved at ændre stimulusvarigheden og opgavedesignet generelt. Kommercielt tilgængelige apparater består normalt af et eksperimentelt kammer og særlig software til at specificere opgaveparametre, men på grund af fast hard- og software udgør de mange begrænsninger for ændringer i det generelle eksperimentelle design og specifikke opgavekrav og det relaterede dataoutput. Denne artikel forklarer et fuldt tilpasseligt alternativ baseret på en brugervenlig single-board mikrocontroller og standard elektrotekniske komponenter, et open access Arduino script og en Matlab-værktøjskasse til henholdsvis hardwarekontrol og adfærdsmæssige opgavespecifikationer. Værktøjskassen indeholder en valgfri trappeprocedure, der muliggør automatiseret adfærdstræning. Den komplette hardwareopsætning, som kan installeres i tilpassede kamre, og den frit tilpasningsdygtige software tilskynder til ikke-standardiseret opgave- og kammerdesign. Systemets design og open source-koden til hardwarestyring og eksperimentel opsætning er beskrevet.

Introduction

5-CSRTT er en adfærdstest, der ofte bruges hos gnavere til at studere visuelle opmærksomhedsprocesser og impulsivitet 1,2,3,4,5,6, såsom bestemmelse af det kolinerge systems rolle i opmærksomhed og indflydelsen af noradrenalinoptagelseshæmmere på impulsiv adfærd 7 . Standardapparatet gør det muligt at observere forskellige kontrolforanstaltninger såsom responsnøjagtighed, reaktionstider, impulsiv og tvangsmæssig adfærd, motorisk evne og motivation 1,2,3,4,5. Den består af et vandret udvalg af fem LED-udstyrede åbninger, et madmagasin på kammervæggene modåbningerne og huslys ^2,5. I en typisk opgave belyses husets lys, og begyndelsen af en session markeres af belysningen af fødevaremagasinet, hvor en fri pellet leveres. Forsøgsforløbet igangsættes, når dyret næsestikker magasinet for at hente pellet¹. Derefter slukkes madmagasinlyset, og inter-trial-intervallet (ITI) starter, hvor dyret skal rette sin opmærksomhed mod blændeåbningerne. Når ITI er gået, præsenteres en stimulusbelysning i en af åbningerne ^1,2,5. Stimulus er givet for en bestemt længde kendt som stimulus varighed (StD). Dyret kan reagere på stimulansen, mens den præsenteres eller i et begrænset tidsvindue, efter at StD er forbi, kendt som begrænset hold (LH). For at reagere skal dyret næse-stikke målblænden, og hvis det gøres korrekt, frigives en belønning i fødevaremagasinet ^1,2,5. Ellers resulterer ethvert forkert svar samt eventuelle svar før stimuluspræsentation (foregribende eller for tidligt) eller manglende reaktion (udeladelse) i en timeout (TO), hvor husets lys slukkes i en vis varighed ^1,2,5 (figur 1). Generelt måler den diskriminerende stimulusnøjagtighed opmærksomhedsfunktionen, mens for tidlige og vedholdende reaktioner (gentagne reaktioner ved blændeåbningerne efter stimuluspræsentation) betragtes som mål for impulsiv adfærd og kompulsivitet, henholdsvis 1,4,5,6.

Figur 1: Mulige forsøgssekvenser af en typisk 5-CSRTT. Efter intertrialintervallet tændes stimuluslyset i en bestemt varighed og slukkes derefter under intervallet Begrænset tilbageholdelse. Rotten kan enten svare korrekt og modtage en belønning eller svare forkert og få en timeout i løbet af denne tid. Hvis rotten ikke svarer i tide, resulterer dens udeladelse i en timeout. Tilsvarende, hvis den reagerer før præsentationen af lysstimulusen, resulterer dens for tidlige respons i en timeout. En anden prøveversion starter efter indsamlingen af belønningen eller slutningen af timeoutperioden. Klik her for at se en større version af denne figur.

5-CSRTT anvendes i vid udstrækning på grund af dens fleksibilitet: Ved at ændre parametre for forsøgsdesignet kan forskellige underkategorier af opmærksomhed undersøges. For eksempel, mens dyret formodes at opdele sin opmærksomhed på tværs af de fem forskellige åbninger (visuospatial opmærksomhed), gør brugen af irrelevante stimuli (f.eks. Auditive stimuli) det muligt at teste selektiv eller vedvarende opmærksomhed 1,2,5,6. Til det formål kan forsøgsopstillingen udvides ved at inkludere højttalere, der kan bruges som distraherende eller endda forstærkende stimuli 1,2,5,6. Desuden kan den opmærksomme belastning moduleres direkte ved at ændre stimuluspræsentationen eller randomisere ITI-varigheden¹⁰. 5-CSRTT anvendes ikke kun til gnavere ^3,7, men er for nylig blevet tilpasset til at teste ikke-menneskelige primater ^1,7,8 og fisk ^7,9, hvilket yderligere viser dens gennemførlighed. En fuldt tilpasselig 5-CSRTT værktøjskasse giver mulighed for nem tilpasning af standard gnaverparadigmet til andre dyremodeller. Desuden tilskynder tilpasningsfleksibiliteten i 5-CSRTT-værktøjskassen også til forskning ved hjælp af ikke-standardiserede opgavedesign.

Den fuldt tilpasselige 5-CSRTT-værktøjskasse, der præsenteres her, indeholder et Arduino-script til hardwarestyring, programmeret i et integreret udviklingsmiljø. Den består også af en Matlab-værktøjskasse (version R2019b eller yngre) til eksperimentkontrol. Følgende protokol forklarer, hvordan du konfigurerer 5-CSRTT-værktøjskassen med det meget anvendte standardparadigme og viser valgfrie konfigurationer for ikke-standardiserede paradigmer.

Protocol

Forsøgsproceduren i denne protokol blev udført efter anbefalingerne i EU-direktiv 2010/63 for forsøgsdyrs velfærd og i overensstemmelse med dyrevelfærdsloven udstedt af Tysklands forbundsregering og blev godkendt af de lokale myndigheder. Da forskningen kun krævede adfærdsmæssig træning, blev ingen dyr aflivet, og alle blev holdt i husdyrhold, efter at forskningen blev udført. Forskningen blev udført ved hjælp af ti mandlige Lister hætterotter (4 måneder i starten af adfærdstræning).

1. Stald, husdyrhold og håndtering

1. Husrotter sammen med op til fem kuldkammerater i et standardbur med passende strøelsesmateriale i henhold til dit dyrevelfærdsudvalgs anbefalinger.
2. Opbevar rotterne i et ventileret rum med en kontrolleret temperatur på 20 ± 2 °C og en relativ luftfugtighed på maksimalt 50 % med en lys/mørk cyklus på 12:12 timer eller i overensstemmelse med din dyrevelfærdskomités anbefalinger. Begræns adgangen til mad (12 g chow om dagen pr. rotte, se Materialetabel) og giv ubegrænset adgang til vand.
3. Marker dyrenes haler ved hjælp af en permanent ikke-giftig blækmarkør.
4. Før du starter adfærdseksperimentet, skal du håndtere rotterne i mindst en uge, indtil de er vant til at blive håndteret af eksperimenter, og introducere rotterne til de givende madpiller for at reducere fødevareneofobi.

2. Forberedelse af hardware- og kontrolsoftwaren

1. Åbn den frit tilgængelige IDE-software (Integrated Development Environment) (se materialetabellen). Klik på File > Open , og klik på scriptet til hardwarekontrol (Supplerende fil 1).
2. Tilslut mikrocontrolleren USB til computeren. Kontroller, om de automatisk valgte kort- og processoroplysninger svarer til det tilsluttede mikrocontrollerkort ved at klikke på Værktøjer øverst til venstre på skærmen. Vælg de tilsvarende kort- og processoroplysninger, og klik på Port for at vælge den tilgængelige port.
3. Klik på Sketch øverst til venstre på skærmen > Inkluder bibliotek > Administrer biblioteker. I det nyåbnede Library Manager-vindue skal du skrive udtrykket "Adafruit Motor Shield V2" i søgefeltet og klikke på knappen Installer på det tilsvarende bibliotek. Gentag den samme proces for søgetermen "Adafruit Neopixel".
4. Øverst til venstre på skærmen skal du klikke på Bekræft (knappen med et flueben) for at sikre, at der ikke er nogen fejl i scriptet. Klik på Upload (knappen med en pil til højre) for at uploade scriptet til mikrocontrollerkortet.

3. Forberedelse af eksperimentstyringssoftwaren

1. Sørg for, at alle fire scripts og funktioner til eksperimentkontrol er placeret i den samme mappe.
   1. Åbn programmeringsplatformen, klik på fanen HOME-værktøjslinje i øverste halvdel af skærmen, og klik på Indstil sti. Klik på Tilføj mappe, og vælg den mappe, der indeholder alle eksperimentkontrolscripts.
   2. Klik på Gem , og luk vinduet Indstil sti . Klik på Åbn på fanen HOME-værktøjslinje øverst på skærmen, og åbn følgende scripts og funktioner: Bruger (supplerende fil 2), Trappe (supplerende fil 3) og DataProc (supplerende fil 4).
2. Følg instruktionerne for download og installation af Psychtoolbox-softwaren for at aktivere ESC-knapfunktionaliteten, der bruges af værktøjskassen (se Tabel over materialer for adgangslinket).

4. Konfiguration af parametre, der anvendes i 5-CSRTT-værktøjskassen

1. Forbered værktøjskassen til tilvænning.
   BEMÆRK: Figur 2 viser det 5-CSRTT-apparat, der blev anvendt til den aktuelle undersøgelse.
   1. Vælg det åbnede brugerscript . Sørg for, at tilvænningsvariablen på linje 7 er indstillet til 'sand'. Skriv et tal på få minutter (f.eks. '30' i 30 minutter) på linje 8 for at fastsætte en tidsbegrænsning for tilvænning. På linje 9 skal du skrive et tal mellem 0,01 og 1 (fuld lysstyrke) for at vælge et lysstyrkeniveau for stimuluslyset.
      BEMÆRK: Lysstyrkeniveauet, der bruges i dette projekt, er indstillet til 0,2.
   2. Udfør adfærdseksperimentet (trin 5).
2. Forbered værktøjskassen til eksperimentsessionen.
   1. Vælg det åbnede brugerscript . Sørg for, at variablen på linje 7 er defineret som "falsk".
   2. På linje 12 skal du indtaste katalogstien, hvor eksperimentdataene automatisk gemmes (f.eks. 'C:\Users\trainer\Desktop\5CSRTT'). Sørg for, at der findes en mappe med dette nøjagtige navn.
   3. Indtast emneidentifikationen på linje 13 (f.eks. "rød1").
   4. Sørg for, at variablen på linje 14 er defineret som "sand", så de genererede data automatisk gemmes i katalogstien.
   5. Sørg for, at variablen på linje 15 er defineret som 'sand', og indtast et tal på linje 16 og 17 for at indstille henholdsvis en prøve- og tidsbegrænsning (i min),hvorefter programmet automatisk stopper.
   6. Konfigurer parametrene for et standard 5-CSRTT-paradigme.
      1. Kontroller, om variablen på linje 32 er indstillet til 'sand' for en gratis pelletslevering inden det første forsøg. Definer variablen på linje 33 som 'sand' for at sikre en magasinpost, før hver prøve starter. Kontroller, om variablen på linje 34 er indstillet som 'defineret', og indtast et tal på linje 35 for at angive længden af ITI i sekunder.
      2. Sørg for, at den variabel, der er defineret på linje 37, er indstillet til "sand", så forsøg med for tidlige svar ikke påvirker sessionens prøvegrænse. Skriv en numerisk værdi på linje 38, der definerer den begrænsede holdlængde (LH) i sekunder.
      3. Sørg for, at variablen på linje 39 er indstillet til 'ingen', og variablen på linje 40 er defineret som 'falsk'. Skriv et tal på linje 41 for at definere TO-længden i sekunder, og sørg for, at variablen på linje 42 er indstillet til 'falsk'.
      4. Indtast en numerisk værdi på linje 45, der svarer til antallet af blændeåbninger, der kan belyses (f.eks. '5'). Sørg for, at variablen på linje 46 er defineret som 'pseudotilfældig' eller 'tilfældig', og indtast et tal på linje 47, og angiv StD-længden i sekunder. Kontroller, om variablen på linje 48 er defineret som 'enkelt', og den numeriske værdi på linje 49 er '1'. På linje 50 skal du indtaste et tal for at definere lysstyrken af målstimulus.
      5. Kontroller, om variablerne på linje 64 og 65 er defineret som henholdsvis 'binær' og 'ikke-afhængig'. Skriv en numerisk værdi på linje 71 svarende til antallet af fødevarepiller, der skal frigives efter en korrekt næsestik.
      6. Udfør adfærdseksperimentet (trin 5).
   7. Konfigurer parametrene for et ikke-standardiseret 5-CSRTT-paradigme.
      BEMÆRK: Alle de trin, der er beskrevet i dette underkapitel, er valgfrie.
      1. Hvis der ønskes en automatisk præstationskontrol ved hjælp af den automatiserede trappetræningsprocedure, skal du sikre dig, at variablen på linje 18 er defineret som »sand«, og indtaste en numerisk værdi på linje 20, der definerer hyppigheden af præstationskontrollen. Skriv et tal på linje 21 for at definere det mindste antal forsøg, der skal gennemføres i løbet af den aktuelle session, før du beregner forsøgspersonens ydeevne. Sørg for, at variablen på linje 21 er defineret som "alle", så alle forsøg i den aktuelle session er inkluderet i præstationskontrollen.
      2. Sørg for, at variablen på linje 22 er indstillet til 'true', så programmet opdaterer parametrene for den aktuelle session, så de matcher en tidligere afsluttet session. På linje 23 skal du indtaste 'seneste' for at fastslå, at den sidste session vil blive uploadet.
         BEMÆRK: Programmet opdaterer parametrene baseret på specifikationer i funktionen "Trappe" og hopper til det tidligere afsluttede niveau. Et specifikt datasæt, der skal uploades, kan også vælges ved at indtaste den nøjagtige sti til datafilen med ".mat"-slutning.
      3. Hvis den automatiserede adfærdstræning ønskes, skal du sikre dig, at variablen på linje 26 er indstillet til 'sand'. Indtast en numerisk værdi på linje 27 og 28 for at definere henholdsvis uddannelsesniveauet til at begynde med og det samlede antal tilgængelige niveauer. Hvis en opdeling af kohorter er ønskelig, skal du indtaste et navn (f.eks. 'gruppe1') på linje 29, der angiver gruppen.
         BEMÆRK: Hver gruppe kan bruge sit eget sæt træningsniveauer og kriterier til niveauopdateringer. Parametrene for hver gruppe er defineret i funktionen "Trappe" (trin 4.2.8.).
      4. På linje 34 skal du indtaste 'tilfældig', hvis der ønskes en randomiseret ITI-varighed. Indtast et numerisk interval (f.eks. "[0,2]") for at definere intervallet, der indeholder et randomiseret tal, der føjes til den faste ITI-varighed.
      5. For at sikre, at forsøg med for tidlige svar påvirker sessionens forsøgsgrænse, skal du indtaste 'falsk' på linje 37.
      6. For at definere et tidsvindue, hvor yderligere næse-pokes tælles som perseverative svar, skal du indtaste en numerisk værdi på linje 39. Indtast 'sand' på linje 40, så for tidlige svar fremkalder en timeout.
      7. For at definere forskellige grupper af målåbningerne skal du indtaste "nabo", "forskudt" eller "alle" på linje 48. Indtast en numerisk værdi på linje 49, der definerer det samlede antal målåbninger. Hvis der ønskes dæmpede stimuli, skal du indtaste en numerisk værdi på linjerne 51 og 52, der definerer henholdsvis det samlede antal dæmpede åbninger og dens lysstyrke.
      8. Hvis der ønskes udsendelse af en kort tone (Tone C4, 262 Hz (Scientific Pitch Notation)) før stimuluspræsentation, skal du sikre dig, at variablen på linje 55 er indstillet til 'true'. Indtast numeriske værdier på linjerne 56, 57 og 58 for at definere tidsvinduet (i millisekunder) mellem højttalerens tone og stimuluspræsentation, tonens varighed (i millisekunder) og tonens lydstyrke (tal mellem 0 (ingen tone) og 1 (fuld lydstyrke) er tilladt).
      9. Hvis der ønskes emission af en kort tone (Tone C6, 1047 Hz) efter et vellykket næsestik, skal du sørge for, at variablen på linje 59 er indstillet til 'sand'. Indtast en numerisk værdi på linjerne 60 og 61, der definerer tonens varighed (i millisekunder) og tonens lydstyrke (tal mellem 0 (ingen tone) og 1 (fuld lydstyrke) er tilladt).
      10. Hvis svar i dæmpede oplyste blændeåbninger skal belønnes, skal du sikre dig, at variablen på linje 64 er indstillet til 'ikke-binær'. Skriv en numerisk værdi på linje 73 for at definere antallet af madpiller, der leveres til næsestik i dæmpede oplyste åbninger.
      11. Hvis du bruger mere end én pilledispenser, skal du indtaste det tilsvarende motornummer på linje 70 og 72 for næsestik i målåbninger og dæmpede oplyste åbninger.
          BEMÆRK: Motornummeret kan være enten 1 eller 2. Det tilsvarende motorskjolds skrueterminaler M3 og M4 er defineret i scriptet til hardwarestyring.
      12. Hvis der ønskes en klassificering af belønningen baseret på reaktionstid, skal du sørge for, at variablen på linje 65 er indstillet til 'afhængig'.
          1. Definer afhængigheden af næse-pokes i målåbninger ved at indtaste numeriske værdier på linje 67, der vil opdele reaktionstiden (i sekunder), motornummeret og antallet af fødevarepiller, der skal leveres i forskellige kategorier, således at et specifikt reaktionstidsinterval svarer til et valgt motorantal og antal pellets.
          2. Indtast tal på linje 68 for at definere forskellige kategorier for reaktionstid (i sekunder), motornummer og antal madpiller, der skal leveres til næse-pokes i dæmpede oplyste åbninger.
   8. Konfigurer trappefunktionen ved at følge nedenstående trin.
      BEMÆRK: Dette trin er valgfrit.
      1. Vælg den åbnede trappefunktion . Skriv navnet på den første gruppe på linje 4 (f.eks. "gruppe1"). Hvis det er relevant, skriv navnet på den anden gruppe (f.eks. »gruppe2«) på linje 77.
      2. Hvis du vil ændre parametrene for det andet uddannelsesniveau for den første gruppe, skal du skrive en af de parametre, der er beregnet i præstationstjekket på linje 17 (f.eks. PerformanceCheck.NumCorrect >= 30, hvis kriterierne besvarer 30 næsestik korrekt).
         BEMÆRK: Du må ikke ændre parameteren "Config_trigger == 2", når du bruger den automatiske indlæsning af den foregående session (trin 4.2.7.2.).
      3. På linje 19 skal du skrive en variabel, som du vil opdatere, og en numerisk værdi, hvis det er relevant (f.eks. 'Config.LED.StimDuration = 30' for at indstille StD-længden til 30 s).
         BEMÆRK: Antallet af parametre, der skal ændres, og deres nye værdi kan frit vælges. Det eneste krav er, at den parameter, der skal opdateres, skal indtastes efter variablen 'UpdateTrigger = 1' i hvert niveau, som opdateringen ønskes.
   9. Konfigurer funktionen "DataProc".
      1. Vælg den åbnede DataProc-funktion . Hvis en graf med sessionens oversigt skal tegnes og gemmes automatisk, skal du indtaste kommandoerne for det ønskede plot fra linje 83 og fremefter.
         BEMÆRK: De nuværende kommandoer på linje 83 og fremefter tegner et overblik over sessionens resultat og nogle nødvendige kontrolforanstaltninger såsom det samlede antal for tidlige svar eller antallet af fødevarepanelskub under en ITI.

5. Adfærdsmæssigt eksperiment

1. Transporter rotteburet fra vivarium til forsøgsrummet mindst 30 minutter før tilvænningen eller forsøgssessionen for at gøre dyrene bekendt med forsøgsrummet.
2. Til tilvænningssessionen skal du forberede operantkammeret ved at placere to belønningsmadpiller i hver af blændeåbningerne og fem madpiller i magasindøren. Konfigurer parametrene for sessionen ved at følge trin 2-4.1.
   BEMÆRK: Det operantkammer, der blev brugt til denne protokol, var en modificeret Skinner PVC-kasse med dimensioner 30 x 30 x 45 cm.
   BEMÆRK: I den første tilvænningsfase skal du tape magasinklapdøren for at forblive åben. I det andet tilvænningsstadium skal du fjerne båndet på magasinklapdøren.
3. Vælg det åbnede brugerscript . Sørg for, at »COM«-beskrivelsen på linje 75 svarer til den valgte tilgængelige port i trin 2.2. Hvis det ikke stemmer overens, skal du ændre den numeriske værdi i scriptet til eksperimentkontrolelementet (f.eks. fra "COM3" til "COM4").
4. Placer forsigtigt rotterne i kammeret.
5. I det åbnede brugerscript skal du klikke på fanen EDITOR-værktøjslinje i øverste halvdel af skærmen og derefter klikke på den grønne afspilningsknap Kør. Kontroller, om programmet kører korrekt ved at læse oplysningerne "Kommandovindue".
6. For at stoppe eksperimentet når som helst skal du trykke på escape-tasten ESC på computerens tastatur. Vent på, at en meddelelse vises på kommandovinduets display. Indtast "y", og tryk på Enter-tasten på computerens tastatur for at stoppe den aktuelle session og gemme de erhvervede data.
7. Når tilvænnings- eller sessionstids- eller prøvegrænsen er nået (henholdsvis trin 4.1.1 eller 4.2.5), skal du kontrollere den meddelelse, der vises på kommandovinduets display. Indtast "y", og tryk på Enter-tasten på computerens tastatur for at stoppe den aktuelle session.
   BEMÆRK: Meddelelsen vises kun i begyndelsen af en ny prøveversion og stopper den igangværende session, indtil der indtastes et svar ("y" for at stoppe sessionen eller "n" for at fortsætte eksperimentet).
8. I tilfælde af en tilvænningssession skal du kontrollere, om rotten indtog alle madpillerne. Gentag tilvænningsfasen, indtil alle pellets er forbrugt, før du går videre til næste tilvænningsfase, eller efter anden fase starter 5-CSRTT-træningen.
9. Efter sessionen skal du rengøre væggene og gulvet i operakammeret, f.eks. med en 70% ethanolopløsning og papirhåndklæde. Før du introducerer den næste rotte, skal du vente i 2-3 minutter, indtil ethanollugten forsvinder.
10. Når eksperimentdagen er slut, skal du tage mikrocontrolleren USB ud af computeren. Du kan også lukke begge scripts til hardware og eksperimentkontrol.

Representative Results

Figur 2: Det 5-CSRTT-apparat, der blev anvendt til den aktuelle undersøgelse. Apparatet kører på en bærbar computer udstyret med 5-CSRTT-værktøjskassen, som giver et script til styring af mikrocontrolleren og alt relateret udstyr og flere scripts til styring af 5-CSRTT-eksperimentet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den fuldt tilpasselige værktøjskasse er nem at bruge og baseret på en enkelt-board mikrocontroller og standard elektrotekniske komponenter. Figur 3 viser et forenklet kredsløbs- og ledningsdiagram. Hele blænden består af 5 lysdioder som lysstimuli og fem infrarøde sensorer til at detektere næsestik. Husets lys består af en strimmel med otte lysdioder, og madmagasinet er lavet af en blænde med en klapdør med en mikrokontakt, en motordrevet pilledispenser og en strimmel med otte lysdioder til belysning. Kredsløbet eksemplificerer også forbindelser til valgfrie komponenter såsom den passive summerhøjttaler til auditiv feedback og et digitalt potentiometer til lydstyrkejustering. For en liste over det udstyr, der anvendes til at udvikle denne værktøjskasse, se tabel over materialer.

Figur 3: Forenklet kredsløb af mikrocontrollerhardwaren. For nemt og hurtigt at kunne tilpasses, er mikrocontrollerudstyret forbundet via et breadboard. Fra øverst til venstre til nederst til venstre med uret: Et mikrocontrollerkort er forbundet til et motorskærm og en DC-motor (der repræsenterer pelletsdispensermotoren). Til højre er LED-strimlerne til både husets og madmagasinets lys, og i midten er alle fem hvide lysdioder til stimuluslyset og de fem infrarøde sensorpar, der bruges i blændeåbningerne. Under mikrocontrollerkortet er en simpel mikrokontakt (der repræsenterer kontakten, der bruges i døren til fødevaremagasinklappen). Endelig er en passiv summerhøjttaler og et digitalt potentiometer afbildet i midten. Dette billede blev lavet ved hjælp af open source-softwaren Fritzing. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Sammenkædning og funktioner af alle komponenter i eksperimentkontrolscripts og forenklet diagram over funktionen "Kode". (A) Scriptet "Bruger" sender sine parametre til funktionen "Kode", som igen linker direkte til funktionen "Trappe", så den kan opdatere enhver parameter, der bruges i funktionen "Kode", mens eksperimentet er i gang. Funktionen "Kode" sender derefter sine resultater til funktionen "DataProc" i slutningen af sessionen. (B) Inden en eksperimentsession påbegyndes, kontrollerer funktionen "Kode" først, om den skal starte tilvænningsprotokollen. Hvis ikke, opretter den parametrene baseret på de definitioner, der er valgt i scriptet "Bruger". Før hver prøveversion begynder, kontrollerer funktionen derefter, om der blev trykket på ESC-tasten på tastaturet. Hvis ikke, fortsætter det med et nyt forsøg. Ellers stopper den eksperimentsessionen og sender de indsamlede data til DataProc-funktionen. Denne kritiske kontrol før hver prøvestart gør det muligt for programmet at stoppe, før en valgt tidsgrænse er nået. Klik her for at se en større version af denne figur.

Interaktioner mellem de forskellige eksperimentelle kontrolscripts kan ses i figur 4A. Scriptet "Bruger" indeholder alle de parametre, der definerer eksperimentet. Der kan variabler, der bestemmer eksperimentets timing, antal og lysstyrke af belyste stimuli, ITI-varighed og lignende, frit vælges. Kodefunktionen (supplerende fil 5) omfatter en detaljeret beskrivelse af et enkelt forsøg og alle mulige resultater, som gentages i hele forsøget, som vist i figur 4B. Desuden består den af en protokol til tilvænning af dyret til apparatet. Kodefunktionen kontrollerer også regelmæssigt dyrets præstationer. Desuden er trappefunktionen valgfri. Forsøgspersonens præstation sammenlignes med tidligere fastsatte kriterier, og de ønskede parametre opdateres automatisk, hvis dyrets præstation opfylder disse kriterier. Trappefunktionen kan også tage højde for de erhvervede resultater fra den foregående dags session. Mens eksperimentet kører, vil en præstationskontrol i slutningen af et forsøg beregne nøjagtighed, udeladelser og det samlede antal korrekte svar fra de afsluttede forsøg og sammenligne resultatet med de ønskede kriterier for en niveauopdatering som angivet i funktionen Trappe. Endelig behandler DataProc-funktionen alle de indsamlede data og genererer enkle grafer til hurtig analyse. Ved afslutningen af en session gemmer værktøjskassen automatisk alle data i en *.mat-fil og genererer en ekstra *.xlsx-fil med de væsentlige oplysninger fra eksperimentet.

Figur 5: Eksempel på forskellige stimuluskonfigurationer af 5-CSRTT-værktøjskassen. Diagrammet eksemplificerer mulige kombinationer af målstimuli i afhængighed af den valgte konfiguration. Både "alle" og "enkelte" konfigurationer anvendes i standardparadigmet (til tilvænning og adfærdseksperiment). Konfigurationerne "nabo" og "forskudt" viser ikke-standardiserede stimuluskonfigurationer, hvilket gør det muligt at bruge andre antal oplyste stimuli, som også kan have en anden kontrast end målstimulus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protokoltrin 4.2.7.7 nævner en valgfri funktion: ændring af gruppering af målåbninger. Standard 5-CSRTT-paradigmet gør brug af et enkelt målstimulus. Her eksemplificerer vi, hvordan den præsenterede værktøjskasse giver mulighed for ændringer af standardparadigmet. Figur 5 viser nogle mulige gruppekombinationer ud af i alt fem blændeåbninger vedrørende den valgte konfiguration. Konfigurationen "alle" lyser alle de tilgængelige blændeåbninger op, så hver blænde nu er en målblænde, hvilket kan være nyttigt i de indledende træningsfaser. Nabokonfigurationen sørger for, at det (frit valgte) antal målåbninger vil være nabo til hinanden. Indstillinger kan specificeres således, at naboerne ikke vil være identiske med målblænden, men blive belyst ved lavere (eller endnu højere) kontrast. Brugen af blændeåbninger med forskellige belysningskontraster gør det muligt at teste nye paradigmer, såsom at bruge forskelligt klassificerede belønninger til næse-pokes i blændeåbningerne med høj eller lav kontrast. Figur 5 viser et eksempel med tre målåbninger med identisk belysning. Den enkelte konfiguration bruges typisk i standard 5-CSRTT, hvor kun et enkelt mål er belyst. Endelig udvider den skiftede konfiguration nabokonfigurationen. Det skifter nabostimulus mod den sidste eller første blænde, hvis målblænden er i henholdsvis første eller sidste position. Som i nabokonfigurationen kan naboernes belysningsstyrke frit vælges, idet den enten er den samme eller forskellig fra målblænden. Antallet af samlede oplyste stimuli kan også vælges frit. Værktøjskassen beregner derefter alle mulige stimuli automatisk. Parameteren "Config.LED.NumHighLED" skal dog indstilles til "1" for denne konfiguration.

Efter protokollen blev træningen af rotter (N = 10) for 5-CSRTT udført i overensstemmelse med de træningsfaser, der er præsenteret i tabel 1.

Tabel 1: 5-CSRTT træningsplan og kriterier for at gå videre til næste niveau. (A) Inter-trial-intervallet blev holdt konstant på 5 s på hvert træningsniveau. (B) Stimulusvarighed for hvert træningsniveau. (C) Begrænset hold (LH) tidsvindue, den maksimale tid, der tolereres mellem stimulus off og enhver nose-poke respons. D) Det samlede antal korrekte svar, der er nødvendige for at bestå det respektive uddannelsesniveau. (E) Nøjagtighedsprocenten beregnes som . (F) Procentdel af udeladelsesfejl defineres som . Dette kriterium omfatter ikke for tidlige reaktioner. Klik her for at downloade denne tabel.

Rotternes præstationer blev sammenlignet med det antal træningsdage (sessioner), der kræves for at gennemføre hvert træningsniveau, der er angivet i tabel 1. Alle dyrene startede på træningsniveau 1 med en StD og LH på 60 s hver. Nogle rotter (N = 5) modtog dog forbedret tilvænningstræning for at teste nogle af de yderligere stimulusmuligheder, der blev rapporteret tidligere, hvilket forklarer forskellen i antallet af sessioner, de enkelte dyr forblev på træningsniveau 1. Afslutningen af niveauet blev markeret ved at nå i alt 30 eller flere korrekte svar. StD og LH faldt i løbet af de følgende niveauer, mens kriterierne for at gå videre til det næste træningsniveau blev hårdere, hvilket øgede den opmærksomme efterspørgsel efter opgaven ^1,6.

Tabel 2 viser det automatisk genererede *.xlsx regneark for en eksempelrotte under en session. Rotten startede med den konfiguration, der er angivet i træningsniveau 5. Efter fire forsøg avancerede rotten til niveau 6 i betragtning af de forsøg, der blev udført i den aktuelle session plus den nøjagtighed, der blev opnået i den foregående session. Hvor mange forsøg der skal udføres som minimum i den aktuelle session for at gå videre til næste uddannelsesniveau, er angivet i variablen "Config.Experiment.MinNumTrials". I samme session avancerede rotten til træningsniveau 7 efter at have gennemført 66 forsøg på niveau 6 og opnået kravet om > 80% nøjagtighed og < 20% udeladelse. I alt blev rotter trænet i 26 dage ved hjælp af konfigurationen af træningsniveauer som angivet i tabel 1. Antallet af anvendte sessioner pr. uddannelsesniveau fremgår af figur 6A. Den sorte linje viser gennemsnittet på tværs af alle motiver, og hver farvet linje viser dataene for en rotte. Alle rotter nåede det ottende niveau inden for 14-22 sessioner (figur 6B). Figur 6C viser den gennemsnitlige præstation af forsøgspersoner pr. uddannelsesniveau og på tværs af alle træningsdage i 5-CSRTT-apparatet. Den stiplede sorte linje repræsenterer nøjagtighedsprocenten, og den lige sorte linje repræsenterer udeladelsesprocenten. Nøjagtigheden blev beregnet som forholdet mellem antallet af korrekte svar og det samlede antal svar. Udeladelser blev beregnet som forholdet mellem antallet af udeladelser og det samlede antal forsøg (dvs. summen af korrekte svar, forkerte svar og udeladelser). Den grå linje angiver det gennemsnitlige samlede antal korrekte svar på tværs af alle forsøg på hvert niveau. Figur 6D viser den endelige nøjagtighed opnået af hvert på det ottende og sidste træningsniveau.

I gennemsnit brugte rotter 5,9 (±1,03 SEM) sessioner for at fuldføre niveau 1, mellem 1,5 (±0,17) og 3,5 (±0,5) sessioner for at fuldføre niveau 2 til 6 og 1,7 (±0,16) sessioner for at fuldføre niveau 7, før de nåede det endelige niveau 8. Som det fremgår af figur 6A, var variansen mellem forsøgspersonerne mest signifikant i de indledende niveauer (SD = 3,25 i niveau 1, 1,58 i niveau 2) og faldt i senere niveauer (henholdsvis 0,47 og 0,48 i niveau 6 og 7). I niveau 4, da stimulusvarigheden blev yderligere reduceret, steg det gennemsnitlige antal brugte sessioner (2,6 ± 0,52) og variansen mellem rotter (1,64), hvor to rotter tog 5 og 6 dage at afslutte niveauet.

Figur 6: Resultater af adfærdseksperimentet med 5-CSRTT-værktøjskassen. (A) Antallet af udførte sessioner på hvert træningsniveau. Den sorte linje viser det gennemsnitlige antal sessioner for alle emner for hvert niveau (gennemsnit ± SEM), og farvede linjer repræsenterer individuelle data. (B) Det absolutte antal sessioner, der er nødvendige for at nå det endelige niveau pr. emne. C) Gennemsnitlige præstationsmål under hele uddannelsen (gennemsnitlig ± SEM). Den prikkede sorte linje viser nøjagtigheden af alle emner på tværs af alle givne svar i alle sessioner pr. Træningsniveau, og den sorte linje viser den tilsvarende udeladelsesprocent. Den grå linje viser det gennemsnitlige absolutte antal korrekte svar for alle på hvert uddannelsesniveau. D) Nøjagtighed pr. på det ottende og sidste uddannelsesniveau. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 2: Indsamlede data fra en eksempelrotte under et træningspas. Kolonne A viser antallet af prøveversioner over træningspasset vedrørende det aktuelle uddannelsesniveau, som vist i kolonne B. Kolonne C viser ITI-varigheden, og kolonne D viser prøvestarttidspunktet. Kolonne E til I viser lysstyrkeniveauet for LED-stimulansen i henholdsvis blænde 1 til 5. Et lysstyrkeniveau på 0 betyder, at stimulansen var slukket, og et lysstyrkeniveau på 0,2 betyder, at stimulansen blev tændt med 20% af dens maksimale intensitet. Kolonne J og K viser det nøjagtige tidspunkt, hvor stimulansen blev tændt og slukket, henholdsvis. Kolonne L viser resultatet af forsøget: 0 betyder "udeladelse", 1 betyder "korrekt respons", 3 betyder "forkert respons" (næsestik i ikke-målblænde) og 4 betyder "for tidligt". Kolonne M viser, hvilken blænde der blev stukket næse under retssagen, mens kolonne N viser det nøjagtige tidspunkt for næsestikket. Kolonnerne O, P og Q viser det tidspunkt, hvor pelletsdispensermotoren blev tændt, det tilsvarende motornummer og det tidspunkt, hvor rotten åbnede pelletsdispenseren for at få sin belønning, henholdsvis. Kolonne R viser sluttidspunktet for prøveversionen. Kolonnerne S, T, U, V og W viser henholdsvis det samlede antal for tidlige svar, timeouts, panelskubs under en ITI, det samlede antal perseverative svar og den samlede runtime af sessionen i minutter. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Script til hardwarestyring af IDE-softwaren (Arduino-kode). Dette omfatter alle kommandoer til styring af hardware og elektrotekniske komponenter i værktøjskassen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Script til funktionen "Bruger" i eksperimentstyringssoftwaren. Dette omfatter alle de parametre, der definerer eksperimentet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Script til funktionen "Staircase" i eksperimentstyringssoftwaren. Dette overvåger fagets præstationer og sammenligner det med de tidligere fastsatte kriterier. De ønskede parametre opdateres automatisk, hvis dyrets præstationer opfylder disse kriterier. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Script til funktionen "DataProc" i eksperimentstyringssoftwaren. Dette behandler alle de indsamlede data og genererer enkle grafer til hurtig analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: Script til funktionen "Kode". Dette omfatter en detaljeret beskrivelse af et enkelt forsøg og alle mulige resultater, som gentages gennem hele eksperimentet. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den nuværende protokol har til formål at udvikle og teste et billigt og fuldt tilpasseligt alternativ til det standard, kommercielt tilgængelige 5-valgs serielle reaktionstidsopgaveapparat. Normalt giver kommercielt tilgængelige typer apparater et begrænset sæt funktioner efter behov for at køre standardforskningen 5-CSRTT. På grund af dette er ikke-standardiserede ændringer i det specifikke forsøgsdesign, såsom ændringer i forsøgssekvensen eller målstimuluskombinationerne, normalt ikke mulige. Derudover leveres mange af de tilgængelige typer apparater med specifik, lukket software, der muligvis ikke giver adgang til alle adfærdsmæssige data fra eksperimentet, såsom timing og blænde antal for tidlige og vedholdende svar. I modsætning hertil er den afgørende fordel ved værktøjskassen, der præsenteres her, - udover de lave omkostninger - muligheden for at implementere mange forskellige forsøgsdesign og forskningsparadigmer. I øjeblikket understøtter værktøjskassen definitionen af flere stimulusdesign, såsom at tillade dæmpede stimuli og bruge to pelletsleveringssystemer og belønne afhængighed af reaktionstid. Det understøtter også brugen af en miniaturehøjttaler til auditiv feedback. Det primære formål er dog at give mulighed for nemme ændringer af prøvesekvensen i henhold til brugerens mål, såsom at indføre dæmpede oplyste åbninger og belønne tidsplaner for beslutningsopgaver eller integrere state-of-the-art positive forstærkningstræningsmetoder¹¹. Derudover stilles alle rådata, der er erhvervet i løbet af sessionen, til rådighed for yderligere analyse. Værktøjskassen indeholder en trappefunktion til automatiseret adfærdstræning, som også kan tilpasses fuldt ud og giver brugeren mulighed for at ændre kriterierne for hver niveauopdatering, antallet af træningsniveauer og de parametre, der skal opdateres. Desuden er selve apparatet meget tilpasningsdygtigt, og ændringer i forsøgsdesignet og kammerlayoutet er let gennemførlige, hvilket gør det muligt at anvende 5-CSRTT-paradigmet på dyrearter, der har brug for et andet forskningsdesign end hvad de kommercielt tilgængelige typer apparater tilbyder.

Specifikke dele af protokollen til softwarekonfigurationen er afgørende for at sikre en jævn arbejdsgang: især for den første dag i eksperimentet er forberedelsen af både hardware- og eksperimentstyringssoftwaren (trin 2 og 3) og konfigurationen af trin 5.3 afgørende. At sikre, at den serielle portforbindelse mellem mikrocontrollerhardwaren, dens software og eksperimentstyringssoftwaren fungerer korrekt, er afgørende for at etablere en fuldt fungerende 5-CSRTT-værktøjskasse. I begyndelsen af hver eksperimentdag anbefales det at gentage de tre trin, der er nævnt ovenfor, for at sikre, at hardware- og eksperimentkontrolscripts er konfigureret korrekt.

Endelig er den nuværende begrænsning af værktøjskassen dens implementering til en eksklusiv programmeringsplatform, hvilket desværre kompromitterer brugen som en komplet open source-værktøjskasse. Ikke desto mindre bør værktøjskassen i princippet let kunne tilpasses andre programmeringssprog såsom Python, da forløbet af et forsøg forbliver uændret.

I sammenligning med eksisterende alternative metoder tillader 5-CSRTT-værktøjskassen, der introduceres her, implementering af standard 5-CSRTT-paradigmet og ændringer af det, såsom at definere et bestemt tidsvindue for udholdenhedssvar eller introducere distraherende eller forstærkende stimuli som højttalere eller blinkende lys. Ud over at være let at bruge og meget tilpasningsdygtigt er apparatet billigt og kan let replikeres, og det tilskynder til forskning ved hjælp af ikke-gnaverdyrsmodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1200 Ohm Resistor			Already available in the lab
8-bit 10 kΩ digital potentiometer	Microchip	MCP42010-I/P	From Conrad.de: 1083205
ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 Lernset	JOY-IT	ARD-Set01	From Reichelt.de: ARD MEGA2560 KIT
ARD SHD MOTOR Arduino Shield - Motor	Adafruit	1438	From Reichelt.de: ARD SHD MOTOR
ARDUINO STACKABLE HEADER KIT - R3	Sparkfun Electronics	PRT-11417	From Antratek.de: PRT-11417
Chow	Altromin	1324 N	Altromin chow products
Euro-Gehäuse	Hammond Electronics	1591EBK	From Conrad.de: 520691
Food pellets	Bio-Serv	F0021	From Bio-serv.com: Dustless Precision Pellets Rodent
Fritzing	Interaction Design Lab Potsdam		Fritzing Software download
Integrated Development Environment	Arduino		Arduino IDE download (Freely available)
IR Break Beam Sensor - 3mm LEDs	Adafruit	2167	From Mouser.de: 485-2167
Laptop or Computer
LED white round 5mm 2000mcd 20mA	TruComponents	1573731	From Conrad.de: 1573731
Microswitch	Hartmann	MBB1 01 A 01 C 09 A	From Conrad.com: 707243
NeoPixel Stick - 8 WS2812 5050 RGB LEDs	Adafruit	1426	From Reichelt.de: DEBO LED NP8 2
Passive buzzer Speaker	Conrad Components	93038c213a	From Conrad.de: 1511468
Pellet release disk			Already available in the lab. Similar products depicted below. Keep in mind that some of these products make use of different (and stronger) motors and infrared sensors. The use of the microswitch (row 7) and the  Arduino Motor Shield (row 3) need to be adapted to fit these new specifications. We recommend 3d printing the disk to work with the provided materials and software. Carbatec universal base plate Open Science Framework Open Feeder Open Ephys 3d Model Food Pellet Dispenser Campden Instruments 45mg pellet dispenser
Programming platform	Mathworks	R2019b or younger
Psychtoolbox Software		V3	Psychtoolbox-3 download
Spur GEAR-MOTOR with DC brush motor	Micromotors	B138F.12.208	Micromotos Series B138F Technical data