Summary
Det nuvarande protokollet beskriver utvecklingen av en öppen källkod 5-val seriell reaktionstid uppgiftslåda för gnagare djurmodeller, med hjälp av Arduino och relaterad hårdvara och en mångsidig Matlab verktygslåda, inklusive ett valfritt skript för automatiserad beteendeträning. Skripten är anpassningsbara och underlättar implementeringen av olika test- och testdesigner.
Abstract
5-vals seriell reaktionstidsuppgift (5-CSRTT) är ett beteendetest som ofta används för att studera visuospatial uppmärksamhet och impulsivitet hos gnagare. Uppgiften kräver att djur uppmärksammar en horisontell uppsättning av fem små öppningar utrustade med ljuskällor och, inom ett begränsat tidsfönster, näspetar en upplyst målöppning för att få en matbelöning vid matmagasinet som ligger i kammarens motsatta vägg. Uppgiften tar hänsyn till beteendekontrollåtgärder som svarsnoggrannhet och reaktionstider och gör det möjligt att härleda selektiv uppmärksamhet och impulsivitet. Uppgiftssvårigheter kan kontrolleras genom att ändra stimulansvaraktigheten och uppgiftsdesignen i allmänhet. Kommersiellt tillgängliga apparater består vanligtvis av en experimentell kammare och särskild programvara för att specificera uppgiftsparametrar, men på grund av fast hård- och programvara utgör de många begränsningar för förändringar i den allmänna experimentella designen och specifika uppgiftskrav och relaterad datautgång. Den här artikeln förklarar ett helt anpassningsbart alternativ baserat på en lättanvänd mikrokontroller med en kort och elektrotekniska standardkomponenter, ett Arduino-skript med öppen åtkomst och en Matlab-verktygslåda för hårdvarukontroll respektive beteendeuppgiftsspecifikationer. Verktygslådan innehåller en valfri trappprocedur som möjliggör automatiserad beteendeträning. Den kompletta hårdvaruinställningen, som kan installeras i anpassade kamrar, och den fritt anpassningsbara programvaran uppmuntrar icke-standardiserad uppgift och kammardesign. Systemets utformning och öppen källkod för hårdvarukontroll och experimentell installation beskrivs.
Introduction
5-CSRTT är ett beteendetest, som ofta används hos gnagare för att studera visuella uppmärksamhetsprocesser och impulsivitet 1,2,3,4,5,6, såsom att bestämma det kolinerga systemets roll i uppmärksamhet och påverkan av noradrenalinåterupptagshämmare på impulsiva beteenden 7 . Standardapparaten möjliggör observation av olika kontrollåtgärder såsom svarsnoggrannhet, reaktionstider, impulsivt och tvångsmässigt beteende, motorisk förmåga och motivation 1,2,3,4,5. Den består av en horisontell uppsättning av fem LED-utrustade bländare, ett matmagasin på kammarväggarna som motsätter sig öppningarna och huslampor 2,5. I en typisk uppgift tänds husljuset, och början av en session markeras av belysningen av matmagasinet, där en fri pellets levereras. Försökskursen inleds när djuret nosar på magasinet för att hämta pelletsen1. Därefter släcks matmagasinlampan och interförsöksintervallet (ITI) startar, under vilket djuret ska rikta sin uppmärksamhet mot öppningarna. När ITI har gått presenteras en stimulansbelysning i en av öppningarna 1,2,5. Stimulansen ges för en specifik längd som kallas stimulansvaraktigheten (StD). Djuret kan reagera på stimulansen medan den presenteras eller under ett begränsat tidsfönster efter att StD är över, känd som begränsat håll (LH). För att svara måste djuret nosa på målöppningen och om det görs korrekt släpps en belöning i mattidningen 1,2,5. Annars resulterar alla felaktiga svar, liksom eventuella svar före stimulanspresentation (förutseende eller för tidigt) eller underlåtenhet att svara (utelämnande) i en timeout (TO), under vilken huslampan stängs av under en viss varaktighet 1,2,5 (Figur 1). I allmänhet mäter den diskriminerande stimulansnoggrannheten uppmärksamhetsfunktion, medan för tidiga och uthålliga svar (upprepade svar vid bländarna efter stimulanspresentation) betraktas som mått på impulsivt beteende respektive tvångsmässighet 1,4,5,6.
Figur 1: Möjliga försökssekvenser av en typisk 5-CSRTT. Efter intertrialintervallet tänds stimuluslampan under en viss varaktighet och stängs sedan av under det begränsade hållintervallet. Råttan kan antingen svara rätt och få en belöning eller svara fel och få en timeout under denna tid. Om råttan inte svarar i tid, resulterar dess utelämnande i en timeout. På samma sätt, om den svarar före presentationen av ljusstimulansen, resulterar dess för tidiga svar i en timeout. En annan utvärderingsversion startar efter insamlingen av belöningen eller slutet av tidsgränsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5-CSRTT används ofta på grund av dess flexibilitet: genom att ändra parametrar för försöksdesignen kan olika underkategorier av uppmärksamhet undersökas. Till exempel, medan djuret ska dela sin uppmärksamhet över de fem olika öppningarna (visuospatial uppmärksamhet), möjliggör användningen av irrelevanta stimuli (t.ex. hörselstimuli) testning av selektiv eller ihållande uppmärksamhet 1,2,5,6. För detta ändamål kan den experimentella installationen utökas genom att inkludera högtalare, som kan användas som distraherande eller till och med förstärkande stimuli 1,2,5,6. Dessutom kan uppmärksamhetsbelastningen moduleras direkt genom att ändra stimulanspresentationen eller randomisera ITI-varaktigheten10. 5-CSRTT används inte bara hos gnagare 3,7, utan har nyligen anpassats för att testa icke-mänskliga primater 1,7,8 och fisk 7,9, vilket ytterligare visar dess genomförbarhet. En helt anpassningsbar 5-CSRTT verktygslåda möjliggör enkel anpassning av standardgnagarparadigmet till andra djurmodeller. Dessutom uppmuntrar anpassningsflexibiliteten hos 5-CSRTT-verktygslådan också forskning med hjälp av icke-standardiserade uppgiftsdesigner.
Den helt anpassningsbara 5-CSRTT-verktygslådan som presenteras här innehåller ett Arduino-skript för hårdvarukontroll, programmerat i en integrerad utvecklingsmiljö. Den består också av en Matlab-verktygslåda (version R2019b eller yngre) för experimentkontroll. Följande protokoll förklarar hur du konfigurerar verktygslådan 5-CSRTT med det allmänt använda standardparadigmet och visar valfria konfigurationer för icke-standardiserade paradigmer.
Protocol
Försöksförfarandet i detta protokoll utfördes enligt rekommendationerna i EU-direktivet 2010/63 för försöksdjurens välbefinnande och i enlighet med djurskyddslagen som utfärdats av Tysklands federala regering och godkändes av de lokala myndigheterna. Eftersom forskningen endast krävde beteendeträning avlivades inga djur och alla hölls i djurhållningen efter att forskningen genomfördes. Forskningen genomfördes med hjälp av tio manliga Lister hooded råttor (4 månaders ålder i början av beteendeträning).
1. Djurhållning, djurhållning och hantering
- Husråttor tillsammans med upp till fem kullkamrater i en standardbur med lämpligt strömaterial, enligt din djurskyddskommittés rekommendationer.
- Förvara råttorna i ett ventilerat rum med en kontrollerad temperatur på 20 ± 2 °C och en relativ luftfuktighet på högst 50 % med en ljus/mörk cykel på 12:12 timmar, eller i enlighet med djurskyddskommitténs rekommendationer. Begränsa tillgången till mat (12 g chow per dag per råtta, se Materialtabell) och ge obegränsad tillgång till vatten.
- Markera djurens svansar med en permanent giftfri bläckmarkör.
- Innan du börjar beteendeexperimentet, hantera råttorna i minst en vecka tills de är vana vid att hanteras av experimenter och introducera råttorna till de givande matpelletsna för att minska matneofobi.
2. Förberedelse av hårdvara och styrprogramvara
- Öppna den fritt tillgängliga programvaran Integrated Development Environment (IDE) (se Materialtabell). Klicka på Arkiv > Öppna och klicka på skriptet för hårdvarukontroll (Tilläggsfil 1).
- Anslut mikrokontrollerns USB till datorn. Kontrollera om den automatiskt valda informationen om kort och processor motsvarar det anslutna mikrokontrollerkortet genom att klicka på Verktyg längst upp till vänster på skärmen. Välj motsvarande information om styrelse och processor och klicka på Port för att välja den tillgängliga porten.
- Längst upp till vänster på skärmen klickar du på Sketch > Include Library > Manage Libraries. I det nyöppnade library manager-fönstret skriver du termen "Adafruit Motor Shield V2" i sökfältet och klickar på installera-knappen på motsvarande bibliotek. Upprepa samma process för söktermen "Adafruit Neopixel".
- På den övre vänstra halvan av skärmen klickar du på Verifiera (knappen med en bock) för att säkerställa att det inte finns några misstag i skriptet. Klicka på Ladda upp (knappen med en pil till höger) för att ladda upp skriptet till mikrokontrollerkortet.
3. Förberedelse av experimentkontrollprogramvaran
- Kontrollera att alla fyra skript och funktioner för experimentkontroll finns i samma mapp.
- Öppna programmeringsplattformen, klicka på fliken HOME-verktygsfältet längst upp på skärmen och klicka på Ange sökväg. Klicka på Lägg till mapp och välj mappen som innehåller alla experimentkontrollskript.
- Klicka på Spara och stäng fönstret Ange sökväg . Klicka på Öppna på fliken HOME verktygsfält på den övre halvan av skärmen och öppna följande skript och funktioner: Användare (Kompletterande fil 2), Trappa (Kompletterande fil 3) och DataProc (Kompletterande fil 4).
- Följ instruktionerna för nedladdning och installation av programvaran Psychtoolbox för att aktivera ESC-knappfunktionen som används av verktygslådan (se Materialtabell för åtkomstlänken).
4. Konfiguration av parametrar som används i verktygslådan 5-CSRTT
- Förbered verktygslådan för tillvänjning.
OBS: Figur 2 representerar 5-CSRTT-apparaten som används för den aktuella studien.- Välj det öppnade användarskriptet . Se till att tillvänjningsvariabeln på rad 7 är inställd på "true". Skriv ett tal på några minuter (t.ex. "30" i 30 min) på rad 8 för att ställa in en tidsgräns för tillvänjningen. På rad 9 skriver du ett tal mellan 0,01 och 1 (full ljusstyrka) för att välja en ljusstyrka för stimulansljuset.
OBS: Ljusstyrkan som används i detta projekt är inställd på 0,2. - Utför beteendeexperimentet (steg 5).
- Välj det öppnade användarskriptet . Se till att tillvänjningsvariabeln på rad 7 är inställd på "true". Skriv ett tal på några minuter (t.ex. "30" i 30 min) på rad 8 för att ställa in en tidsgräns för tillvänjningen. På rad 9 skriver du ett tal mellan 0,01 och 1 (full ljusstyrka) för att välja en ljusstyrka för stimulansljuset.
- Förbered verktygslådan för experimentsessionen.
- Välj det öppnade användarskriptet . Se till att variabeln på rad 7 definieras som "falsk".
- På rad 12 skriver du in katalogsökvägen där experimentdata sparas automatiskt (t.ex. "C:\Users\trainer\Desktop\5CSRTT"). Kontrollera att det finns en katalog med det här exakta namnet.
- Skriv in ämnesidentifieringen på rad 13 (t.ex. "röd1").
- Kontrollera att variabeln på rad 14 definieras som "true", så att de data som genereras sparas automatiskt i katalogsökvägen.
- Se till att variabeln på rad 15 definieras som "true" och skriv in ett tal på raderna 16 och 17 för att ställa in en test- respektive tidsgräns (i min), varefter programmet automatiskt stoppas.
- Konfigurera parametrarna för ett standardparadigm för 5-CSRTT.
- Kontrollera om variabeln på rad 32 är inställd på "true" för en gratis pelletsleverans före den första prövningen. Definiera variabeln på rad 33 som "true" för att säkerställa en tidningspost innan varje försök startar. Kontrollera om variabeln på rad 34 är inställd som "definierad" och skriv in ett tal på rad 35 för att ange längden på ITI i sekunder.
- Kontrollera att variabeln som definierats på rad 37 är inställd på "true" så att utvärderingsversioner med för tidiga svar inte påverkar utvärderingsgränsen för sessionen. Skriv ett numeriskt värde på rad 38 som definierar den begränsade hålllängden (LH) i sekunder.
- Se till att variabeln på rad 39 är inställd på "ingen" och variabeln på rad 40 definieras som "falsk". Skriv ett tal på rad 41 för att definiera TO-längden i sekunder och se till att variabeln på rad 42 är inställd på "false".
- Skriv in ett numeriskt värde på rad 45 som motsvarar antalet bländare som kan belysas (t.ex. "5"). Se till att variabeln på rad 46 definieras som "pseudoslumpmässig" eller "slumpmässig" och skriv in ett tal på rad 47 och ställ in StD-längden i sekunder. Kontrollera om variabeln på rad 48 definieras som "singel" och det numeriska värdet på rad 49 är "1". På rad 50 skriver du in ett tal för att definiera ljusstyrkan för målstimulansen.
- Kontrollera om variablerna på raderna 64 och 65 definieras som "binära" respektive "icke-beroende". Skriv ett numeriskt värde på rad 71 som motsvarar antalet livsmedelspellets som ska släppas efter en korrekt näspetning.
- Utför beteendeexperimentet (steg 5).
- Konfigurera parametrarna för ett icke-standardiserat 5-CSRTT-paradigm.
OBS: Alla steg som beskrivs i detta underkapitel är valfria.- Om en automatisk prestationskontroll önskas för att använda det automatiska trappträningsförfarandet, se till att variabeln på rad 18 definieras som "true" och skriv in ett numeriskt värde på rad 20 som definierar frekvensen för prestationskontrollen. Skriv ett nummer på rad 21 för att definiera det minsta antalet prövningar som ska slutföras under den aktuella sessionen innan du beräknar försökspersonens prestanda. Se till att variabeln på rad 21 definieras som "alla" så att alla försök i den aktuella sessionen ingår i prestandakontrollen.
- Se till att variabeln på rad 22 är inställd på "true" så att programmet uppdaterar parametrarna för den aktuella sessionen så att de matchar en tidigare avslutad session. På rad 23 skriver du in "senaste" för att fastställa att den senaste sessionen kommer att laddas upp.
OBS: Programmet kommer att uppdatera parametrarna baserat på specifikationer i funktionen "Trappa" och hoppa till den tidigare slutförda nivån. En specifik datauppsättning som ska laddas upp kan också väljas genom att skriva in den exakta sökvägen till datafilen med ".mat" -ändelsen. - Om den automatiserade beteendeträningen önskas, se till att variabeln på rad 26 är inställd på "true". Skriv in ett numeriskt värde på raderna 27 och 28 för att definiera träningsnivån som ska börja med respektive det totala antalet tillgängliga nivåer. Om en uppdelning av kohorter är önskvärd, skriv in ett namn (t.ex. "grupp1") på rad 29 som anger gruppen.
OBS: Varje grupp kan använda sin egen uppsättning träningsnivåer och kriterier för nivåuppdateringar. Parametrarna för varje grupp definieras i funktionen "Trappa" (steg 4.2.8.). - På rad 34 skriver du in "slumpmässig" om en slumpmässig ITI-varaktighet önskas. Skriv in ett numeriskt intervall (t.ex. "[0,2]") för att definiera intervallet som innehåller ett slumpmässigt tal som ska läggas till den fasta ITI-varaktigheten.
- För att säkerställa att prövningar med för tidiga svar påverkar sessionens utvärderingsgräns skriver du in "false" på rad 37.
- Om du vill definiera ett tidsfönster under vilket ytterligare näspetningar räknas som uthålliga svar skriver du in ett numeriskt värde på rad 39. Skriv in "sant" på rad 40 så att för tidiga svar framkallar en timeout.
- Om du vill definiera olika grupperingar av målöppningarna skriver du in "granne", "förskjuten" eller "alla" på rad 48. Skriv in ett numeriskt värde på rad 49 och definiera det totala antalet målöppningar. Om nedtonade stimuli önskas, skriv in ett numeriskt värde på raderna 51 och 52 och definiera det totala antalet nedtonade bländare respektive dess ljusstyrka.
- Om utsläpp av en kort ton (Tone C4, 262 Hz (Scientific Pitch Notation)) före stimuluspresentation önskas, se till att variabeln på rad 55 är inställd på "true". Skriv in numeriska värden på raderna 56, 57 och 58 för att definiera tidsfönstret (i millisekunder) mellan talarens ton- och stimulanspresentation, tonens varaktighet (i millisekunder) och tonens volym (siffror mellan 0 (ingen ton) och 1 (full volym) är tillåtna).
- Om en kort ton (Tone C6, 1047 Hz) efter en lyckad nospetning önskas, se till att variabeln på rad 59 är inställd på "true". Skriv in ett numeriskt värde på raderna 60 och 61 som definierar tonens varaktighet (i millisekunder) och tonens volym (siffror mellan 0 (ingen ton) och 1 (full volym) är tillåtna).
- Om svar i nedtonade bländare ska belönas, se till att variabeln på rad 64 är inställd på "icke-binär". Skriv ett numeriskt värde på rad 73 för att definiera antalet matpellets som levereras för näspetningar i nedtonade tända bländare.
- Om du använder mer än en pelletsdispenser, skriv in motsvarande motornummer på linjerna 70 och 72 för näspetningar i målöppningar och nedtonade tända bländare.
OBS: Motornumret kan vara antingen 1 eller 2. Motsvarande motorskölds skruvplintar M3 och M4 definieras i skriptet för hårdvarustyrning. - Om du vill gradera belöningen baserat på reaktionstid, se till att variabeln på rad 65 är inställd på "beroende".
- Definiera beroendet av näspetningar i målöppningar genom att skriva in numeriska värden på rad 67 som delar reaktionstiden (i sekunder), motornummer och antalet matpellets som ska levereras i olika kategorier, så att ett specifikt reaktionstidsintervall motsvarar ett valt motornummer och antal pellets.
- Skriv in siffror på rad 68 för att definiera olika kategorier för reaktionstid (i sekunder), motornummer och antal matpellets som ska levereras för näspetningar i nedtonade bländare.
- Konfigurera trappfunktionen genom att följa stegen nedan.
OBS: Det här steget är valfritt.- Välj den öppnade trappfunktionen . På rad 4 anger du namnet på den första gruppen (t.ex. "grupp1"). Ange i tillämpliga fall namnet på den andra gruppen (t.ex. "grupp2") på rad 77.
- För att ändra parametrarna för den andra träningsnivån för den första gruppen, skriv en av parametrarna som beräknas i prestationskontrollen på rad 17 (t.ex. PerformanceCheck.NumCorrect > = 30 om kriterierna svarar 30 näspetningar korrekt).
OBS: Ändra inte parametern "Config_trigger == 2" när du använder automatisk laddning av föregående session (steg 4.2.7.2.). - På rad 19 skriver du en variabel som du vill uppdatera och ett numeriskt värde om tillämpligt (t.ex. "Config.LED.StimDuration = 30" för att ställa in StD-längden på 30 s).
OBS: Antalet parametrar som ska ändras och deras nya värde kan väljas fritt. Det enda kravet är att parametern som ska uppdateras måste skrivas in efter variabeln 'UpdateTrigger = 1' i varje nivå som uppdateringen önskas.
- Konfigurera funktionen "DataProc".
- Välj den öppnade DataProc-funktionen . Om ett diagram med sessionens översikt måste ritas upp och sparas automatiskt skriver du in kommandona för önskat diagram från rad 83 och framåt.
OBS: De aktuella kommandona på rad 83 och framåt plottar en översikt över sessionens resultat och några nödvändiga kontrollåtgärder som det totala antalet för tidiga svar eller antalet matpaneltryck under en ITI.
- Välj den öppnade DataProc-funktionen . Om ett diagram med sessionens översikt måste ritas upp och sparas automatiskt skriver du in kommandona för önskat diagram från rad 83 och framåt.
5. Beteendeexperiment
- Transportera råttburen från vivarium till försöksrummet minst 30 minuter före tillvänjningen eller experimentsessionen för att bekanta djuren med testrummet.
- För tillvänjningssessionen, förbered den operanta kammaren genom att placera två belöningsmatpellets i var och en av öppningarna och fem matpellets i magasindörren. Konfigurera parametrarna för sessionen genom att följa steg 2–4.1.
OBS: Den operanta kammaren som användes för detta protokoll var en modifierad Skinner PVC-låda med måtten 30 x 30 x 45 cm.
OBS: För det första tillvänjningssteget, tejpa magasinluckan för att förbli öppen. För det andra tillvänjningssteget, ta bort tejpen på magasinluckan. - Välj det öppnade användarskriptet . Se till att COM-beskrivningen på rad 75 matchar den valda tillgängliga porten i steg 2.2. Om det inte stämmer överens ändrar du det numeriska värdet i experimentkontrollskriptet (t.ex. från "COM3" till "COM4").
- Placera försiktigt råttorna i kammaren.
- I det öppnade användarskriptet klickar du på fliken EDITOR verktygsfält på den övre halvan av skärmen och klickar sedan på den gröna uppspelningsknappen Kör. Kontrollera om programmet körs korrekt genom att läsa informationen "Kommandofönster".
- Om du vill stoppa experimentet när som helst trycker du på escape-tangenten ESC på datorns tangentbord. Vänta tills ett meddelande visas på kommandofönstrets display. Skriv in "y" och tryck på Enter-tangenten på datorns tangentbord för att stoppa den aktuella sessionen och spara de förvärvade data.
- När tillvänjnings-, sessionstids- eller testgränsen har nåtts (steg 4.1.1 respektive 4.2.5) kontrollerar du meddelandet som visas på kommandofönstrets display. Skriv in "y" och tryck på Enter-tangenten på datorns tangentbord för att stoppa den aktuella sessionen.
OBS: Meddelandet visas bara i början av en ny utvärderingsversion och stoppar den pågående sessionen tills ett svar skrivs in ("y" för att stoppa sessionen eller "n" för att fortsätta experimentet). - Vid en tillvänjningssession, kontrollera om råttan konsumerade alla matpellets. Upprepa tillvänjningssteget tills alla pellets förbrukas innan du går vidare till nästa tillvänjningssteg eller, efter det andra steget, starta 5-CSRTT-träningen.
- Rengör väggarna och golvet i den operanta kammaren efter sessionen, t.ex. med en 70% etanollösning och pappershandduk. Innan du introducerar nästa råtta, vänta i 2-3 minuter tills etanollukten försvinner.
- När experimentdagen är över kopplar du bort mikrokontrollerns USB från datorn. Du kan också stänga båda skripten för maskinvaru- och experimentkontroll.
Representative Results
Figur 2: 5-CSRTT-apparaten som används för den aktuella studien. Apparaten körs på en bärbar dator utrustad med 5-CSRTT-verktygslådan, som ger ett skript för att styra mikrokontrollern och all relaterad utrustning och flera skript för att styra 5-CSRTT-experimentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Den helt anpassningsbara verktygslådan är enkel att använda och baserad på en enkorts mikrokontroller och elektrotekniska standardkomponenter. Figur 3 visar ett förenklat krets- och kopplingsschema. Hela bländaren består av 5 lysdioder som ljusstimuli och fem infraröda sensorer för att upptäcka näspetningar. Husbelysningen består av en remsa med åtta lysdioder, och matmagasinet är tillverkat av en bländare med en klaffdörr med en mikrobrytare, en motordriven pelletsdispenser och en remsa med åtta lysdioder för belysning. Kretsen exemplifierar också anslutningar för valfria komponenter som den passiva summerhögtalaren för hörselåterkoppling och en digital potentiometer för volymjustering. För en lista över den utrustning som används för att utveckla denna verktygslåda, se Materialtabell.
Figur 3: Förenklad krets för mikrokontrollerns hårdvara. För att enkelt och snabbt kunna anpassas är mikrokontrollerutrustningen ansluten via en breadboard. Uppifrån vänster till nere till vänster, medurs: Ett mikrokontrollerkort är anslutet till en motorsköld och en likströmsmotor (som representerar pelletsdispensermotorn). Till höger finns LED-remsorna för både hus- och matmagasinlamporna, och i mitten finns alla fem vita lysdioder för stimulansljuset och de fem infraröda sensorparen som används i bländarna. Under mikrokontrollerkortet finns en enkel mikrobrytare (som representerar omkopplaren som används i matmagasinets klaffdörr). Slutligen avbildas en passiv summerhögtalare och en digital potentiometer i mitten. Denna bild gjordes med hjälp av programvaran Fritzing med öppen källkod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Länkning och funktioner för alla komponenter i experimentkontrollskripten och förenklat diagram över funktionen "Kod". (A) Skriptet "Användare" skickar sina parametrar till funktionen "Kod", som i sin tur länkar direkt till funktionen "Trappa", så att den kan uppdatera alla parametrar som används i funktionen "Kod" medan experimentet pågår. Funktionen "Kod" skickar sedan sina resultat till funktionen "DataProc" i slutet av sessionen. (B) Innan en experimentsession påbörjas kontrollerar funktionen "Kod" först om den är tänkt att starta tillvänjningsprotokollet. Om inte, ställer den in parametrarna baserat på de definitioner som valts i skriptet "Användare". Innan varje testversion börjar kontrollerar funktionen sedan om ESC-tangenten på tangentbordet har tryckts in. Om inte, fortsätter det med en ny rättegång. Annars stoppas experimentsessionen och de insamlade data skickars till funktionen DataProc. Denna kritiska kontroll före varje teststart gör att programmet kan stoppas innan någon vald tidsgräns uppnås. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Interaktioner mellan de olika experimentkontrollskripten kan ses i figur 4A. Skriptet "Användare" innehåller alla parametrar som definierar experimentet. Där kan variabler som bestämmer experimentets timing, antal och ljusstyrka för upplysta stimuli, ITI-varaktighet och liknande väljas fritt. Kodfunktionen (tilläggsfil 5) innehåller en detaljerad beskrivning av en enda prövning och alla möjliga resultat, vilket upprepas under hela experimentet, vilket visas i figur 4B. Dessutom består den av ett protokoll för djurets tillvänjning till apparaten. Kodfunktionen kontrollerar också regelbundet djurets prestanda. Dessutom är trappfunktionen tillval. Ämnets prestanda jämförs med tidigare fastställda kriterier, och önskade parametrar uppdateras automatiskt om djurets prestanda uppfyller dessa kriterier. Trappfunktionen kan också ta hänsyn till de förvärvade resultaten från föregående dags session. Medan experimentet körs kommer en prestandakontroll i slutet av en utvärderingsversion att beräkna noggrannhet, utelämnanden och det totala antalet korrekta svar från de slutförda försöken och jämföra resultatet med önskade kriterier för en nivåuppdatering, enligt vad som anges i trappfunktionen. Slutligen bearbetar DataProc-funktionen alla insamlade data och genererar enkla grafer för snabb analys. I slutet av en session sparar verktygslådan automatiskt all data i en *.mat-fil och genererar en extra * .xlsx fil med väsentlig information från experimentet.
Figur 5: Exempel på olika stimuluskonfigurationer i verktygslådan 5-CSRTT. Diagrammet exemplifierar möjliga kombinationer av målstimuli i beroende av den valda konfigurationen. Både "alla" och "enda" konfigurationer används i standardparadigmet (för tillvänjnings- och beteendeexperimentet). Konfigurationerna "granne" och "skiftade" visar icke-standardiserade stimulanskonfigurationer, vilket möjliggör användning av andra antal tända stimuli, vilket också kan ha en annan kontrast än målstimulansen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I protokollsteg 4.2.7.7 nämns en valfri funktion: att ändra grupperingen av målöppningar. Standard 5-CSRTT-paradigmet använder sig av en enda målstimulans. Här exemplifierar vi hur verktygslådan som presenteras möjliggör modifieringar av standardparadigmet. Figur 5 visar några möjliga gruppkombinationer av totalt fem bländare avseende den valda konfigurationen. "Alla" -konfigurationen lyser upp alla tillgängliga bländare så att varje bländare nu är en målöppning, vilket kan vara till hjälp i de inledande träningsstadierna. Grannkonfigurationen ser till att det (fritt valda) antalet målöppningar kommer att ligga intill varandra. Inställningar kan specificeras så att grannarna inte kommer att vara identiska med målöppningen utan belysas vid lägre (eller till och med högre) kontrast. Användningen av bländare med olika belysningskontraster gör det möjligt att testa nya paradigmer, till exempel att använda olika graderade belöningar för näspetningar i bländare med hög eller låg kontrast. Figur 5 visar ett exempel med tre målöppningar med identisk belysning. Den enda konfigurationen används vanligtvis i standard 5-CSRTT, där endast ett enda mål är upplyst. Slutligen utökar den skiftade konfigurationen grannkonfigurationen. Den förskjuter grannstimulansen mot den sista eller första bländaren om målöppningen är vid den första respektive sista positionen. Som i grannkonfigurationen kan grannarnas belysningsstyrka väljas fritt, antingen densamma eller annorlunda än målöppningen. Antalet övergripande upplysta stimuli kan också väljas fritt. Verktygslådan beräknar sedan alla möjliga stimuli automatiskt. Parametern "Config.LED.NumHighLED" måste dock ställas in på "1" för den här konfigurationen.
Efter protokollet utfördes träningen av råttor (N = 10) för 5-CSRTT enligt de träningsstadier som presenteras i tabell 1.
Tabell 1: 5-CSRTT-träningsschema och kriterier för att gå vidare till nästa nivå. (A) Intervallet mellan försöken hölls konstant vid 5 s på varje träningsnivå. (B) Stimulanstid för varje utbildningsnivå. (C) Tidsfönster för begränsat håll (LH), den maximala tiden som tolereras mellan stimulans av och eventuellt näspetande svar. (D) Det totala antalet korrekta svar som krävs för att klara respektive utbildningsnivå. (E) Noggrannhetsprocenten beräknas som 
. (F) Procentandelen utelämnande fel definieras som 
. Detta kriterium omfattar inte för tidiga svar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Råttornas prestationer jämfördes med antalet träningsdagar (pass) som krävdes för att slutföra varje utbildningsnivå som anges i tabell 1. Alla djuren började på träningsnivå 1 med en StD och LH på 60 s vardera. Vissa råttor (N = 5) fick dock förbättrad tillvänjningsträning för att testa några av de ytterligare stimulansalternativen som rapporterats tidigare, vilket förklarar skillnaden i antalet sessioner som de enskilda djuren stannade i träningsnivå 1. Slutförandet av nivån markerades genom att nå totalt 30 eller fler korrekta svar. StD och LH minskade under följande nivåer, medan kriterierna för att avancera till nästa träningsnivå blev tuffare, vilket ökade det uppmärksammade kravet på uppgiften 1,6.
Tabell 2 visar det automatiskt genererade *.xlsx kalkylbladet för en exempelråtta under en session. Råttan började med den konfiguration som anges i träningsnivå 5. Efter fyra försök avancerade råttan till nivå 6, med tanke på de försök som utfördes under den aktuella sessionen plus den noggrannhet som uppnåtts under föregående session. Hur många utvärderingsversioner som måste utföras minst under den aktuella sessionen för att gå vidare till nästa träningsnivå anges i variabeln "Config.Experiment.MinNumTrials". I samma session avancerade råttan till träningsnivå 7 efter att ha slutfört 66 försök på nivå 6 och uppnått kravet på > 80% noggrannhet och < 20% utelämnande. Totalt tränades råttor i 26 dagar med hjälp av den konfiguration av träningsnivåer som anges i tabell 1. Antalet sessioner som spenderas per utbildningsnivå anges i figur 6A. Den svarta linjen visar genomsnittet för alla ämnen, och varje färgad linje visar data för en råtta. Alla råttor nådde den åttonde nivån inom 14-22 sessioner (figur 6B). Figur 6C visar försökspersonernas genomsnittliga prestanda per utbildningsnivå och under alla utbildningsdagar i 5-CSRTT-apparaten. Den streckade svarta linjen representerar noggrannhetsprocenten och den raka svarta linjen representerar utelämnandeprocenten. Noggrannheten beräknades som förhållandet mellan antalet korrekta svar och det totala antalet svar. Utelämnanden beräknades som förhållandet mellan antalet utelämnanden och det totala antalet försök (dvs. summan av korrekta svar, felaktiga svar och utelämnanden). Den grå linjen anger det genomsnittliga totala antalet korrekta svar i alla försök på varje nivå. Figur 6D visar den slutliga noggrannheten som uppnåtts av varje ämne på den åttonde och sista träningsnivån.
I genomsnitt tillbringade råttor 5,9 (±1,03 SEM) sessioner för att slutföra nivå 1, mellan 1,5 (±0,17) och 3,5 (±0,5) sessioner för att slutföra nivå 2 till 6 och 1,7 (±0,16) sessioner för att slutföra nivå 7 innan de nådde den slutliga nivån 8. Som framgår av figur 6A var variansen mellan försökspersonerna mest signifikant i de initiala nivåerna (SD = 3,25 i nivå 1, 1,58 i nivå 2) och minskade i senare nivåer (0,47 och 0,48 i nivå 6 respektive 7). På nivå 4, när stimulansvaraktigheten reducerades ytterligare, ökade det genomsnittliga antalet sessioner som spenderades (2,6 ± 0,52) och variansen mellan råttor (1,64), med två råttor som tog 5 och 6 dagar för att avsluta nivån.
Figur 6: Resultat av beteendeexperimentet med verktygslådan 5-CSRTT. (A) Antalet sessioner som utförs på varje träningsnivå. Den svarta linjen visar det genomsnittliga antalet sessioner för alla ämnen för varje nivå (medelvärde ± SEM) och färgade linjer representerar enskilda ämnens data. (B) Det absoluta antalet sessioner som behövs för att nå den slutliga nivån, per ämne. (C) Genomsnittliga prestationsmått under hela utbildningen (medelvärde ± SEM). Den prickade svarta linjen visar noggrannheten för alla ämnen i alla givna svar i alla sessioner per träningsnivå, och den svarta linjen visar motsvarande utelämnandeprocent. Den grå linjen visar det genomsnittliga absoluta antalet korrekta svar för alla ämnen på varje träningsnivå. (D) Noggrannhet per ämne under den åttonde och sista utbildningsnivån. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 2: Samlade in data från en exempelråtta under ett träningspass. Kolumn A visar antalet utvärderingsversioner under träningspasset avseende den aktuella träningsnivån, som du ser i kolumn B. Kolumn C visar ITI-varaktigheten och kolumn D visar provperiodens starttid. Kolumnerna E till I visar ljusstyrkan för LED-stimulansen i bländare 1 till 5. En ljusstyrka på 0 betyder att stimulansen var avstängd, och en ljusstyrka på 0,2 betyder att stimulansen slogs på med 20% av sin maximala intensitet. Kolumnerna J och K visar den exakta tiden då stimulansen slogs på respektive av. Kolumn L visar resultatet av försöket: 0 betyder "utelämnande", 1 betyder "korrekt svar", 3 betyder "felaktigt svar" (näsan sticker in i icke-målöppning) och 4 betyder "för tidigt". Kolumn M visar vilken bländare som nosades under försöket, medan kolumn N visar den exakta tiden för näspetningen. Kolumnerna O, P och Q visar tiden då pelletsdispensermotorn slogs på, motsvarande motornummer och den tid då råttan öppnade pelletsdispensern för att få sin belöning. Kolumn R visar provperiodens sluttid. Kolumnerna S, T, U, V och W visar det totala antalet för tidiga svar, tidsgräns, paneltryck under en ITI, det totala antalet uthålliga svar respektive den totala körningen av sessionen i minuter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande fil 1: Skript för hårdvarukontroll av IDE-programvaran (Arduino-kod). Detta inkluderar alla kommandon för att styra hårdvaran och elektrotekniska komponenter i verktygslådan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Skript för funktionen "Användare" i experimentkontrollprogramvaran. Detta inkluderar alla parametrar som definierar experimentet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Skript för funktionen "Trappa" i experimentkontrollprogramvaran. Detta övervakar ämnets prestanda och jämför det med de tidigare fastställda kriterierna. De önskade parametrarna uppdateras automatiskt om djurets prestanda uppfyller dessa kriterier. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: Skript för funktionen "DataProc" i experimentkontrollprogramvaran. Detta bearbetar all insamlad data och genererar enkla grafer för snabb analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 5: Skript för funktionen "Kod". Detta inkluderar en detaljerad beskrivning av en enda prövning och alla möjliga resultat, vilket upprepas under hela experimentet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det nuvarande protokollet syftar till att utveckla och testa ett billigt och helt anpassningsbart alternativ till den vanliga, kommersiellt tillgängliga 5-vals seriella reaktionstidsuppgiftsapparaten. Vanligtvis tillhandahåller kommersiellt tillgängliga typer av apparater en begränsad uppsättning funktioner efter behov för att köra standardforskningen 5-CSRTT. På grund av detta är icke-standardiserade modifieringar i den specifika försöksdesignen, såsom förändringar i försökssekvensen eller målstimulanskombinationerna, vanligtvis inte möjliga. Dessutom kommer många av de tillgängliga typerna av apparater med specifik, sluten programvara som kanske inte ger tillgång till alla beteendedata i experimentet, såsom tidpunkten och bländarantalet för för tidiga och uthålliga svar. Däremot är den viktiga fördelen med verktygslådan som presenteras här - förutom dess låga kostnad - möjligheten att implementera många olika försöksdesigner och forskningsparadigmer. För närvarande stöder verktygslådan definitionen av flera stimulansdesigner, såsom att tillåta nedtonade stimuli och använda två pelletsleveranssystem och belöna beroende av reaktionstid. Den stöder också användningen av en miniatyrhögtalare för hörselåterkoppling. Det primära syftet är dock att möjliggöra enkla modifieringar av testsekvensen enligt användarens mål, till exempel att införa nedtonade tända bländare och belöna scheman för beslutsfattande uppgifter eller integrera toppmoderna positiva förstärkningsträningsmetoder11. Dessutom görs alla rådata som förvärvats under sessionen tillgängliga för vidare analys. Verktygslådan tillhandahåller en trappfunktion för automatiserad beteendeträning, som också är helt anpassningsbar och gör det möjligt för användaren att ändra kriterierna för varje nivåuppdatering, antalet träningsnivåer och parametrarna som ska uppdateras. Dessutom är själva apparaten mycket anpassningsbar, och förändringar i försöksdesignen och kammarlayouten är lätt genomförbara, vilket gör det möjligt att tillämpa 5-CSRTT-paradigmet på djurarter som behöver en annan forskningsdesign än vad de kommersiellt tillgängliga typerna av apparater erbjuder.
Specifika delar av protokollet för programvarukonfigurationen är avgörande för att säkerställa ett smidigt arbetsflöde: särskilt för experimentets första dag är förberedelsen av både hårdvaru- och experimentkontrollprogramvaran (steg 2 och 3) och konfigurationen av steg 5.3 avgörande. Att säkerställa att den seriella portanslutningen mellan mikrokontrollerns hårdvara, dess programvara och experimentkontrollprogramvaran fungerar korrekt är avgörande för att upprätta en fullt fungerande 5-CSRTT-verktygslåda. I början av varje experimentdag är det lämpligt att upprepa de tre stegen som nämns ovan för att säkerställa att maskinvaru- och experimentkontrollskripten är korrekt konfigurerade.
Slutligen är den nuvarande begränsningen av verktygslådan dess implementering till en exklusiv programmeringsplattform, vilket tyvärr äventyrar dess användning som en komplett verktygslåda med öppen källkod. Ändå bör verktygslådan i princip vara lätt att anpassa till andra programmeringsspråk som Python eftersom en prövning förblir oförändrad.
I jämförelse med befintliga alternativa metoder tillåter 5-CSRTT-verktygslådan som introduceras här implementeringen av standard 5-CSRTT-paradigmet och modifieringar av det som att definiera ett inställt tidsfönster för uthålliga svar eller införa distraherande eller förstärkande stimuli som högtalare eller blinkande lampor. Förutom att den är lätt att använda och mycket anpassningsbar, är apparaten billig och kan enkelt replikeras, och den stimulerar forskning med hjälp av djurmodeller som inte är gnagare.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av DFG WE 5469/3-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1200 Ohm Resistor | Already available in the lab | ||
| 8-bit 10 kΩ digital potentiometer | Microchip | MCP42010-I/P | From Conrad.de: 1083205 |
| ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 Lernset | JOY-IT | ARD-Set01 | From Reichelt.de: ARD MEGA2560 KIT |
| ARD SHD MOTOR Arduino Shield - Motor | Adafruit | 1438 | From Reichelt.de: ARD SHD MOTOR |
| ARDUINO STACKABLE HEADER KIT - R3 | Sparkfun Electronics | PRT-11417 | From Antratek.de: PRT-11417 |
| Chow | Altromin | 1324 N | Altromin chow products |
| Euro-Gehäuse | Hammond Electronics | 1591EBK | From Conrad.de: 520691 |
| Food pellets | Bio-Serv | F0021 | From Bio-serv.com: Dustless Precision Pellets Rodent |
| Fritzing | Interaction Design Lab Potsdam | Fritzing Software download | |
| Integrated Development Environment | Arduino | Arduino IDE download (Freely available) | |
| IR Break Beam Sensor - 3mm LEDs | Adafruit | 2167 | From Mouser.de: 485-2167 |
| Laptop or Computer | |||
| LED white round 5mm 2000mcd 20mA | TruComponents | 1573731 | From Conrad.de: 1573731 |
| Microswitch | Hartmann | MBB1 01 A 01 C 09 A | From Conrad.com: 707243 |
| NeoPixel Stick - 8 WS2812 5050 RGB LEDs | Adafruit | 1426 | From Reichelt.de: DEBO LED NP8 2 |
| Passive buzzer Speaker | Conrad Components | 93038c213a | From Conrad.de: 1511468 |
| Pellet release disk | Already available in the lab. Similar products depicted below. Keep in mind that some of these products make use of different (and stronger) motors and infrared sensors. The use of the microswitch (row 7) and the Arduino Motor Shield (row 3) need to be adapted to fit these new specifications. We recommend 3d printing the disk to work with the provided materials and software. Carbatec universal base plate Open Science Framework Open Feeder Open Ephys 3d Model Food Pellet Dispenser Campden Instruments 45mg pellet dispenser |
||
| Programming platform | Mathworks | R2019b or younger | |
| Psychtoolbox Software | V3 | Psychtoolbox-3 download | |
| Spur GEAR-MOTOR with DC brush motor | Micromotors | B138F.12.208 | Micromotos Series B138F Technical data |
References
- Bari, A., Dalley, J. W., Robbins, T. W. The application of the 5-choice serial reaction time task for the assessment of visual attentional processes and impulse control in rats. Nature Protocols. 3 (5), 759-767 (2008).
- Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-choice serial reaction time task: a task of attention and impulse control for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51574 (2014).
- Higgins, G. A., Silenieks, L. B. Rodent Test of Attention and Impulsivity: The 5-Choice Serial Reaction Time Task. Current Protocols in Pharmacology. 78 (1), 1-34 (2017).
- Humby, T., Wilkinson, L., Dawson, G. Assaying aspects of attention and impulse control in mice using the 5-choice serial reaction time task. Current Protocols in Neuroscience. 31 (1), 1-15 (2005).
- Robbins, T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. 163 (3-4), 362-380 (2002).
- Amitai, N., Markou, A. Disruption of performance in the five-choice serial reaction time task induced by administration of N-methyl-D-aspartate receptor antagonists: relevance to cognitive dysfunction in schizophrenia. Biological Psychiatry. 68 (1), 5-16 (2010).
- Fizet, J., Cassel, J. C., Kelche, C., Meunier, H. A review of the 5-Choice Serial Reaction Time (5-CSRT) task in different vertebrate models. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 71, 135-153 (2016).
- Spinelli, S., et al. Performance of the marmoset monkey on computerized tasks of attention and working memory. Cognitive Brain Research. 19 (2), 123-137 (2004).
- Parker, M. O., et al. Development and automation of a test of impulse control in zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 65 (2013).
- Birtalan, E., Bánhidi, A., Sanders, J. I., Balázsfi, D., Hangya, B. Efficient training of mice on the 5-choice serial reaction time task in an automated rodent training system. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Fischer, B., Wegener, D. Emphasizing the "positive" in positive reinforcement: using nonbinary rewarding for training monkeys on cognitive tasks. Journal of Neurophysiology. 120 (1), 115-128 (2018).
