Topische Anwendung Bioassay zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Moskitos und Fruchtfliegen

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Methodik und Bedeutung des topischen Anwendungsbioassays zur Messung der Insektizidempfindlichkeit bei Moskitos und Fruchtfliegen. Der vorgestellte Assay ist ein hoher Durchsatz, verwendet Insektenmasse - so dass eine massenrelativierte tödliche Dosis anstelle der Konzentration berechnet werden kann - und hat wahrscheinlich eine geringere Variabilität als andere ähnliche Methoden.

Zusammenfassung

Der fortgesetzte Einsatz von Insektiziden für die öffentliche Gesundheit und die Landwirtschaft hat zu einer weit verbreiteten Insektizidresistenz und Behinderung der Bekämpfungsmethoden geführt. Die Überwachung der Insektizidresistenz von Mückenpopulationen erfolgt in der Regel durch Flaschenbioassays der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) oder Tubentests der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Diese Methoden können jedoch zu einer hohen Variabilität der Mortalitätsdaten führen, da der Kontakt mit dem Insekt variabel ist, die relativ geringe Anzahl der getesteten Organismen, die große Variation der Masse zwischen den Populationen und die sich ständig ändernden Umweltbedingungen, die zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. In diesem Artikel wird der topische Anwendungsbioassay vorgestellt, der als phänotypischer Hochdurchsatz-Bioassay für Moskitos und Fruchtfliegen geeignet ist, um eine große Anzahl von Insekten entlang einer Reihe von Insektizidkonzentrationen zu testen.

Dieser Assay 1) gewährleistet eine konsistente Behandlung und den Kontakt mit Insektiziden mit jedem Organismus, 2) erzeugt hochspezifische Dosis-Wirkungs-Kurven, die Unterschiede in der Durchschnittsmasse zwischen Stämmen und Geschlechtern berücksichtigen (was besonders für im Feld gesammelte Organismen wichtig ist), und 3) ermöglicht die Berechnung statistisch strenger mittlerer tödlicher Dosen (LD₅₀ ), die für Vergleiche des Resistenzverhältnisses notwendig sind - ein alternativer Überwachungsansatz aus der diagnostischen Dosismortalität, der auch für die Überwachung der Larvizidresistenz verwendet wird. Dieser Assay wird ein ergänzendes Werkzeug für die genaue Phänotypisierung von Mückenpopulationen sein und, wie mit Fruchtfliegen veranschaulicht, leicht für die Verwendung mit anderen Insekten angepasst werden können. Wir argumentieren, dass dieser Assay dazu beitragen wird, die Lücke zwischen genotypischer und phänotypischer Insektizidresistenz bei mehreren Insektenarten zu schließen.

Einleitung

Moskitos sind jedes Jahr für über 700.000 Todesfälle aufgrund der Krankheiten verantwortlich, die sie auf den Menschen übertragen, wobei mehr als die Hälfte dieser Todesfälle allein auf Malaria zurückzuführen^{ist 1}. Die wichtigste vorbeugende Methode gegen die Übertragung von Malaria und anderen vektorübertragenen Krankheiten ist die Verwendung von Insektiziden, oft in Form von lang anhaltenden Insektizidnetzen oder Indoor-Restsprühen². Die Insektizidresistenz ist jedoch bei Moskitos und anderen Insektenvektoren sowie bei landwirtschaftlichen Schädlingen^{weit verbreitet 3,4}. Um den Widerstand effektiv zu bewältigen, ist die Überwachung von zentraler Bedeutung⁵. Dazu werden hochgenaue und hochdurchlässige Widerstandsdetektionsmethoden benötigt. Derzeit sind die am weitesten verbreiteten Überwachungsinstrumente für Insektizidresistenzen für Moskitos der WHO-Röhrentest 6 und der CDC-Flaschenbioassay^7. Für Fruchtfliegen ist die Restkontakt-Applikationsmethode (ähnlich dem CDC-Flaschen-Bioassay) ein häufig verwendeter Insektizid-Bioassay ^8,9,10. Die Variabilität der Daten aus diesen Methoden ist jedoch typischerweise hoch, wobei die Messungen desselben Labormückenstamms von ~ 20-70% Mortalität in CDC-Flaschentests und 0-50% in WHO-Röhrchentests reichen, wenn sie subletalen Dosierungen ausgesetzt sind¹¹. Eine solche Variation ist überraschend, da die begrenzte genetische Variation in den meisten Laborstämmen voraussichtlich zu einer begrenzten Variation der Insektizidanfälligkeit in der Population führen wird. Dennoch gibt es immer noch ein hohes Maß an Variation, das in den Bioassay-Ergebnissen beobachtet wird.

Mögliche Quellen dieser Variation könnten das Ergebnis einer heterogenen Insektizidexposition zwischen Proben innerhalb des Bioassays sein, die auf eine indirekte Insektizidexposition über die Oberfläche, heterogene Umweltauswirkungen, normale biologische Variationen zwischen Individuen desselben Genotyps und Variationen in der Masse von Proben derselben Population zurückzuführen^{ist 12} . Eine selten verwendete Methode mit höherer Replizierbarkeit ist der topische Applikationsbioassay. In diesem Assay wird das Insektizid direkt auf jedes Insekt^13,14 aufgetragen^, wodurch der Faktor der heterogenen Exposition verschiedener Proben innerhalb desselben Assays entfernt wird. Aufgrund des langsamen Durchsatzes dieser Methode wird sie jedoch nicht routinemäßig als Insektizid-Suszeptibilitätsüberwachungsinstrument für Mückenpopulationen verwendet. Dieses Papier stellt ein modifiziertes Protokoll für den topischen Anwendungsbioassay vor, das eine höhere Durchsatzexposition ermöglicht und gleichzeitig die Variation der Insektenmasse korrigiert, ein Parameter, der mit Änderungen der Insektizidempfindlichkeit korreliert¹². Eine Verringerung des Lärms und der massenbedingten Variation der Mortalitätsdaten aufgrund der variablen Insektizidexposition würde eine genauere Überwachung der technischen Resistenzen ermöglichen^11,15. Solche Daten könnten verwendet werden, um phänotypische Resistenzen genauer mit genetischen Markern, Fitnessparametern und/oder Vektorkompetenz in Verbindung zu bringen. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Assay leicht an andere Insektenarten angepasst werden kann, indem der topische Anwendungsbioassay an Fruchtfliegen, einer kleineren Insektenart, verwendet wird.

Die Haupteinschränkung der oben genannten Restkontaktanwendungen besteht darin, dass die Insektizidexposition von Probe zu Probe innerhalb desselben Assays variieren kann. Im Falle von CDC-Flaschenbioassays und der Kontaktmethode kann die Insektizidexposition zwischen Replikaten desselben Assays variieren. Die Insekten sind einem Insektizid ausgesetzt, das entweder auf der Innenseite einer Glasflasche (CDC-Flaschenbioassay und Kontaktmethode) oder auf imprägnierten Papieren (WHO-Röhrchentest) verteilt ist. Die Konzentration von Insektiziden auf beiden Oberflächen (Glas und Papier) ist bekannt und durch das Screening verschiedener Arten bekannter Genotypen vorbestimmt. Die Menge, die zur potenziellen Aufnahme durch das Insekt zur Verfügung steht, kann jedoch stark variieren, abhängig von der verwendeten Oberfläche, den Insektizidmischungskomponenten und der Homogenität des Insektizids über das Oberflächenmaterial^16,17. Beim CDC-Flaschenbioassay hängt die Insektizidbeschichtung auf der Innenseite der Flasche von den Verfahren ab, die von jedem Labor und Benutzer angewendet werden. Beim WHO-Tubentest werden die mit Insektiziden behandelten Papiere zentral produziert und sind damit höchstwahrscheinlich in den Labors recht homogen. Beim WHO-Tubentest ermöglicht das Belichtungsröhrchen den Proben jedoch, auf einem nicht mit Insektiziden belichteten Metallgewebe zu landen und sich dort auszuruhen, was zu einer potenziellen heterogenen Insektizidexposition unter den Proben innerhalb jedes Tests führt. Die tatsächliche Menge an Insektizid, die von Proben über jede Methode aufgenommen und absorbiert wird, muss noch weiter erforscht werden¹⁸.

Darüber hinaus werden der CDC-Flaschenbioassay, der WHO-Röhrchentest und die Kontaktmethode am häufigsten als Schwellenassays verwendet, um nur eine vorbestimmte Insektizidkonzentration zu testen. Dieser Ansatz kann das Vorhandensein von Resistenzen genau erkennen und ist wertvoll für die Widerstandsüberwachung (insbesondere wenn sich der Widerstand ausbreitet). Schwellenwert-Assays können jedoch die Stärke der Resistenz nicht quantifizieren, was die Wirksamkeit von Interventionsinstrumenten besser vorhersagen könnte. Wenn mit diesen Methoden mehrere Insektizidkonzentrationen verwendet werden, können sie als Intensitätstests verwendet werden. Intensitätstests für den CDC-Flaschenbioassay und den WHO-Röhrchentest wurden eingeführt, indem 5x und 10x der vorgegebenen diskriminierenden Dosierungen getestet wurden, um diese Lücke in der Überwachung zu schließen ^6,19. 3-5 (vorbestimmte) Dosierungen bieten zwar eine bessere Möglichkeit, zwischen resistenten Populationen zu unterscheiden, bieten jedoch eine begrenzte Auflösung zur Berechnung tödlicher Konzentrationen. Darüber hinaus werden Moskitos verschiedener Größen in solchen verwendetSays. Es ist jedoch wichtig, die Masse zu messen, da größere Proben möglicherweise eine höhere Dosis benötigen, um getötet zu werden, da die effektive Dosis pro Masseneinheit viel niedriger ist als die eines kleineren Organismus¹². Die Berechnung einer massenrelativierten tödlichen Dosis (Menge an Insektizid pro Insektenmasse) wäre eine nützlichere Metrik als die häufigere tödliche Konzentration (z. B. Menge an Insektizid pro Oberfläche), da sie die Variation der Insektenmasse zwischen Geschlechtern, Populationen und Genotypen berücksichtigt. Solche Daten würden dazu beitragen, die Lücke zwischen genotypischer und phänotypischer Resistenz innerhalb des Labors und des Feldes zu schließen, und könnten auch eine einfache Möglichkeit bieten, die erforderliche Anwendungskonzentration zur Behandlung einer Population von Insekten mit einer bekannten durchschnittlichen Masse zu berechnen.

Die Verwendung von massenrelativierten tödlichen Dosierungen, die 50% der Proben töten (LD₅₀), beinhaltet auch mehrere andere Vorteile. Die Beurteilung der Toxizität einer bestimmten Verbindung in mg/kg (= ng/mg) ist Standard in der Human- und Veterinärtoxikologie¹⁴, und LD_50-Werte sind auf Sicherheitsdatenblättern zu finden. Tödliche Dosierungen ermöglichen auch einen direkten Vergleich der Toxizität zwischen verschiedenen Chemikalien für eine bestimmte Spezies oder derselben Chemikalie gegenüber verschiedenen Spezies²⁰ sowie eine qualitativ hochwertige Bewertung neuartiger Insektizide und Chemikalien¹³. Darüber hinaus kann die LD₅₀ aussagekräftigere und genauere Resistenzverhältnisse liefern als diejenigen, die aus diagnostischen Dosismortalitätsergebnissen abgeleitet werden, was zu einer Überschätzung des in einer Population vorhandenen Resistenzniveaus führen kann. Daher wäre dieser Assay für routinemäßige Überwachungsprogramme geeignet, da er eine strengere Resistenzüberwachung auf der Grundlage von massenrelativierten tödlichen Dosen bietet, die von mehr Proben stammen, als für andere Bioassays^{empfohlen werden 21}.

Die topische Applikationsmethode wurde in der Insektizid-Suszeptibilitätsüberwachung für Moskitos und Fliegen als Alternative für die Standard-Insektizid-Suszeptibilitäts-Bioassays verwendet, wenn die Resistenz bereits bekannt ist oder vermutet^{wird 22,23,} sowie für die Überwachung bei einigen Schädlingsinsekten²⁴ zur genaueren Beurteilung von Resistenzprofilen und intrinsischer Toxizität von Insektiziden ²¹ . Bei Bioassays zur topischen Anwendung wird das Insektizid auf jeden Organismus aufgetragen, was zu einer minimalen Variation der Insektizidexposition führt. Dieses Papier stellt eine leicht angepasste und verbesserte Methode vor, die es ermöglicht, in kurzer Zeit eine Insektizidexposition auf eine große Anzahl von Insekten anzuwenden und gleichzeitig die Insektenmasse zu kontrollieren²². Diese Methode mit höherem Durchsatz und guter Replizierbarkeit könnte ein nützliches zusätzliches Werkzeug für die routinemäßige Überwachung der Insektizidanfälligkeit sein.

Protokoll

HINWEIS: Insektizide können Gefahren für Mensch, Tier und Umwelt verursachen²⁵. Vorsicht, Schulung und persönliche Schutzausrüstung werden dringend empfohlen. Achten Sie darauf, die Sicherheitsdatenblätter für alle verwendeten Insektizide und Lösungsmittel zu befolgen.

1. Hintere Exemplare

1. Hintere 3-5 Tage alte erwachsene Moskitos.
   ANMERKUNG: Das nachstehende Protokoll spiegelt die Bedingungen für die Aufzucht von Aedes aegypti wider und folgt dabei den Leitlinien der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen²⁶.
   1. Hintere Mücken aller Lebensstadien bei 27 ± 1 °C und 75 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit bei 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus.
   2. Schlüpfen Sie die Mückeneier aus, indem Sie sie in deionisiertes Wasser tauchen und Hefe²⁶ hinzufügen, oder legen Sie die untergetauchten Eier für 30 min in eine Vakuumkammer.
      HINWEIS: Beide Methoden verringern den Sauerstoffgehalt im Wasser und erhöhen das Schlüpfen²⁷.
   3. Füttern Sie das frisch geschlüpfte Larvenfischfutter (oder eine gleichwertige Diät wie gemahlenes Katzenfutter) in Schalen und halten Sie die Larvendichte zwischen den Schalen so ähnlich wie möglich, da die Larvendichte die Entwicklung^{beeinflusst 12} (z. B. 200-250 Larven pro Schale mit insgesamt 1,5 l Wasser).
   4. Füttern Sie die Larven jeden zweiten Tag, bis sie das Puppenstadium erreichen (ca. 7-10 Tage), und erhöhen Sie die Nahrungsmenge nach Bedarf.
      HINWEIS: Wenn zu wenig gefüttert wird, wird das Larvenwachstum verkümmert und die Larven können sich gegenseitig fressen. Wenn sie zu viel gefüttert werden, können die Larven sterben, wodurch das Wasser verschmutzt.
   5. Sobald sich die Puppen entwickelt haben, geben Sie sie täglich in eine Wasserschüssel in erwachsenen Mückenkäfigen und stellen Sie 10% Saccharoselösung ad libitum zur Verfügung.
   6. Notieren Sie den ersten Tag der erwachsenen Emergenz. Entfernen Sie die verbleibenden Puppen 2 Tage nach Beginn des Auslaufens aus dem Käfig.
      HINWEIS: Männliche Moskitos tauchen schneller auf. Beachten Sie das Auftreten von Männchen und Weibchen getrennt und stellen Sie sicher, dass für jeden Test ausreichend Männchen und Weibchen zur Verfügung stehen.
   7. Warten Sie 3 Tage nach dem Entfernen der Puppen, um 3-5 Tage alte Moskitos zum Testen zu erhalten.
2. Hintere Fruchtfliegen (lose nach Protokollen der Universität Zürich²⁸).
   1. Hintere Drosophila-Stämme in Lagerflaschen bei 23 ± 1 °C und 60 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus.
      HINWEIS: Drosophila Lagerflaschen sollten 75 ml eines Standardfliegenmediums enthalten, das zuerst als Flüssigkeit in den Boden der Flaschen gegossen und dann über Nacht erstarren gelassen wird.
   2. Bringen Sie Kolonien alle zwei Wochen in neue Lagerflaschen mit frischen Lebensmitteln, um Überbevölkerung und Schimmelbildung zu verhindern. Schlagen Sie dazu Fliegen mit einem tragbaren Kohlendioxidspender (CO₂) nieder, geben Sie die betäubten Fliegen auf ein Wiegepapier auf einem Eisbeutel oder Kühltisch und bürsten Sie die Fliegen mit einem fein gespitzten Pinsel in eine frische Lagerflasche. Achten Sie darauf, die Flaschen während dieses Vorgangs auf der Seite zu halten, um zu verhindern, dass Fliegen in das Essen fallen und ertrinken.

2. Bereiten Sie Insektizidformulierungen mit dem gravimetrischen Ansatz vor

1. Stellen Sie die erste Stammlösung nach dem gravimetrischen Ansatz mit einer analytischen Waage mit einer Genauigkeit von 0,1 mg in einem Abzug her.
   HINWEIS: Der gravimetrische Ansatz verwendet Masse, um die Mengen an Insektiziden und Lösungsmitteln zu messen. Die Standardpraxis (volumetrischer Ansatz) erfordert eine analytische Skala, um die Menge an (festem) Insektizid zu messen, die bei der Herstellung der ersten Stammlösung hinzugefügt wird. Die Menge des zugegebenen Lösungsmittels und alle folgenden Verdünnungen werden jedoch nur nach Volumen gemessen. Der gravimetrische Ansatz hat eine höhere Genauigkeit und wird daher bevorzugt.
   1. Bestimmen Sie die Zielinsektizidkonzentration und das Zielvolumen (maximal 10 ml werden empfohlen, wenn 15 ml konische Röhrchen verwendet werden, um ein Verschütten bei der Lagerung in einem Gefrierschrank zu verhindern) für die erste Stammlösung und berechnen Sie, wie viel Insektizidwirkstoff (AI) mit Eq (1) hinzugefügt werden soll:
        (1)
   2. Bereiten Sie ein Aufbewahrungsröhrchen vor (15 ml konisches Röhrchen, empfohlen für größere Volumina, 1,5 ml Mikrozentrifugen-Schraubverschlussröhrchen, empfohlen für Volumina von 1 ml oder weniger) und etikettieren Sie es mit Insektizid- und Lösungsmittelname, Zielkonzentration und Zubereitungsdatum. Legen Sie das Rohr und den Deckel auf die Waage innerhalb eines Racks oder einer Halterung und tare die Waage.
   3. Die gewünschte Menge an festem oder flüssigem Insektizid AI, ermittelt aus Schritt 2.1.1, wird gewogen. (z. B. Deltamethrin, das für die repräsentativen Daten verwendet wird) in die Röhre und zeichnen Sie die Masse auf.
   4. Legen Sie die Waage auf und geben Sie das gewünschte Lösungsmittelvolumen (entspricht dem Zielvolumen) in das Röhrchen, schließen Sie den Deckel sofort und zeichnen Sie die Masse auf. Schließen Sie den Deckel des Röhrchens unmittelbar nach Zugabe des Lösungsmittels (hier verwendetes Aceton), um eine Verdunstung zu vermeiden, und mischen Sie die Lösung.
   5. Erfassen Sie die Raumtemperatur. Einige Lösungsmittel, wie Aceton, können je nach Temperatur signifikante Änderungen des Volumens (und folglich der Dichte) aufweisen.
   6. Wenn Sie es sofort lagern, wickeln Sie den Deckel des Röhrchens in Parafilm ein (um die Verdunstung zu reduzieren), legen Sie es in ein Röhrchenrack / einen Halter (um aufrecht zu bleiben und ein Auslaufen zu verhindern), decken Sie es mit Folie ab (um UV-Exposition zu vermeiden), legen Sie es in einen wiederverschließbaren Plastikbeutel (um die Verdunstung zu reduzieren) und legen Sie den Beutel in einen Gefrierschrank von -20 ° C. Wenn Sie nicht sofort gelagert werden, stellen Sie sicher, dass der Deckel gesichert ist und decken Sie ihn mit Folie oder einem lichtgeschützten Behälter ab.
   7. Berechnen Sie die tatsächliche Konzentration der Stammlösung (mg/ml), indem Sie die Masse des zugesetzten Insektizids AI durch das zugesetzte Volumen des zugesetzten Lösungsmittels (und das Volumen des zugesetzten Insektizids, wenn es in flüssiger Form zugesetzt wird) dividieren. Um das Volumen des zugesetzten Lösungsmittels (oder flüssigen Insektizids) zu berechnen, teilen Sie die hinzugefügte Masse durch die bekannte Dichte, die für die aufgezeichnete Temperatur geeignet ist.
   8. Berechnen Sie die Dichte (g/ml) der Stammlösung, indem Sie die hinzugefügte Gesamtmasse (Insektizid und Lösungsmittel) durch das zugesetzte Gesamtvolumen (Lösungsmittel und Insektizid, falls in flüssiger Form) dividieren. Siehe Schritt 2.1.7 für die Umwandlung von flüssiger Masse in Volumen.
2. Verdünnen Sie die ursprüngliche Stammlösung seriell über 10%ige Verdünnungen. Verwenden Sie bei Bedarf diese seriellen Verdünnungen, um eine anfängliche Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen, um den Zielbereich der Insektizidkonzentrationen für den Bioassay zu identifizieren.
   1. Berechnen Sie das Volumen der Insektizid-Stammlösung und das Lösungsmittel, das jedem Röhrchen zugesetzt werden soll (z. B. 1 ml Insektizid-Stammlösung, verdünnt in 9 ml Lösungsmittel für eine 10-ml-Verdünnung von 10% der vorherigen Konzentration).
   2. Vortex der Stammlösung für 10 s. Tare ein vorbeschriftetes erstes Verdünnungsrohr auf der Waage. Das erforderliche Volumen der Stammlösung wird dem ersten Verdünnungsrohr mit einer Pipette hinzugefügt. Schließen Sie sofort den Deckel beider Rohre und zeichnen Sie die Masse im ersten Verdünnungsrohr auf.
   3. Setzen Sie das erste Verdünnungsrohr erneut ein und fügen Sie das erforderliche Volumen an Lösungsmittel hinzu. Schließen Sie den Deckel sofort, notieren Sie die Masse des zugesetzten Lösungsmittels und wirbeln Sie die erste Verdünnung für 10 s ein.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 und 2.2.3 für die übrigen Verdünnungen.
   5. Speichern Sie alle Verdünnungen wie oben in Schritt 2.1.6 beschrieben.
   6. Berechnen Sie die tatsächlichen Konzentrationen der Verdünnungen, indem Sie Schritt 2.1.7 ausführen.
   7. Berechnen Sie die Dichte jeder Insektizidverdünnung, indem Sie die Gesamtmasse (Insektizidlösung und Lösungsmittel) durch das zugesetzte Gesamtvolumen (Insektizidlösung und Lösungsmittel) dividieren. Verwenden Sie für jede serielle Verdünnung die Dichte der vorherigen Insektizid-Stammverdünnung, um die Dichte der neuen Verdünnung nach Eq (2) zu berechnen:
      (2)
3. Optional: Erstellen Sie Insektizidverdünnungen mit kleineren Schritten durch serielle Verdünnung.
   1. Wählen Sie die Konzentrationen und Volumina jeder neuen Lösung aus, die mit Hilfe einer Dosis-Wirkungs-Kurve der anfänglichen seriellen Verdünnungen, früherer Studien oder veröffentlichter Literatur hergestellt werden soll.
      HINWEIS: Die gewählten Konzentrationen sollten zu einem Mortalitätsbereich von 0-100% führen, wobei mindestens drei Konzentrationen aus diesem Bereich liegen, um eine Probit-Analyse zu ermöglichen.
   2. Verwenden Sie die seriellen Verdünnungen als Standardlösungen, um jede neue Verdünnung vorzunehmen, und folgen Sie Schritt 2.2, um die neuen Verdünnungen zwischen den 10-fachen Verdünnungen zu erstellen.
4. Optional: Aliquot die Insektizidlösung. Wenn größere Mengen der Insektizidlösungen hergestellt werden, aliquotieren Sie die Lösungen in 1,5-ml-Schraubverschlussrohre, um eine Kontamination, Verdampfung und Verschlechterung der Stammlösungen durch häufige Handhabung und Lichteinwirkung zu vermeiden.
   1. Aliquot die Lösungen, ausgehend von der niedrigsten Konzentration und arbeiten Sie auf die höchste Konzentration hin, um eine mögliche Kontamination zu reduzieren. Mischen Sie jede Stammlösung, indem Sie sie vor dem Öffnen 10 s lang vortexen und das gewünschte Volumen (z. B. 0,5 ml) in ein vorbeschriftetes Schraubverschlussrohr pipettieren.
   2. Lagern Sie die Aliquots in einem lichtbeständigen Behälter in einem -20 °C Gefrierschrank.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, Aliquots regelmäßig (monatlich) durch kleine neue Aliquots zu ersetzen, die direkt aus den Pestizidverdünnungen stammen. Dies begrenzt das Potenzial für Kontaminationen, die in andere Experimente übertragen werden können, oder Veränderungen aufgrund von Verdunstung oder UV-Abbau, während die Proben auf der Bank verwendet werden. Das Protokoll kann hier pausiert und auch Jahre später wieder gestartet werden, solange die Insektizidlösungen ordnungsgemäß gelagert (siehe Schritt 2.1.6) und im -20 °C Gefrierschrank aufbewahrt werden.
5. Verwenden Sie einen Permanentmarkerstift, um den Meniskus vor der Lagerung zu markieren, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu überwachen. Wenn Sie Insektizidlösung entfernen, um Aliquots herzustellen, markieren Sie den Meniskus jedes Mal, wenn die Lösung entfernt wird.

3. Vorbereiten des Bioassay-Arbeitsbereichs für die topische Anwendung

HINWEIS: Es wird empfohlen, in einem Insekten-Handling-Zelt zu arbeiten, um den Fang von entkommenen Moskitos oder Fliegen zu erleichtern. Siehe Ergänzende Abbildung S1 für Bilder eines Insektenhandlingzeltes.

1. Entfernen Sie die benötigten Insektizidlösungen aus dem Gefrierschrank, wirbeln Sie sie sofort ein und legen Sie sie bei Raumtemperatur in einen lichtbeständigen Behälter, um die Insektizide vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen zu lassen.
   HINWEIS: Insektizid-AIs können sich bei kühleren Temperaturen vom Lösungsmittel trennen. Darüber hinaus ändert sich das Acetonvolumen mit der Temperatur, was die aufgebrachte Insektiziddosis verändern kann. Das Mischen der Lösungen und das Erwärmen auf Raumtemperatur trägt dazu bei, die Konsistenz bei der Verwendung der Insektizidlösungen zu gewährleisten.
2. Legen Sie alle erforderlichen Werkzeuge und Materialien für den topischen Anwendungstest im Insektenhandhabungszelt fest, wie in der Materialtabelle angegeben.
3. Reinigen Sie den Spritzenzylinder und die Nadel mit analytischem Aceton, indem Sie 5 Wäschen pro Acetonaliquot durchführen. Vervollständigen Sie dies mit 5 separaten Aliquots für insgesamt 25 Wäschen. Siehe Zusatzfigur S2 für Spritzen- und Repeater-Pipettierteile.
   1. Stellen Sie 5 Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 0,5 ml Aceton auf.
   2. Füllen Sie den Spritzenzylinder mit 0,025 ml Aceton aus dem ersten Röhrchen und stoßen Sie dann das Aceton in einen Abfallbehälter aus, indem Sie schnell auf den Kolben drücken. Wiederholen Sie dies vier weitere Male, um insgesamt fünf Acetonwäschen aus demselben Acetonaliquot durchzuführen. Füllen Sie dann den Spritzenzylinder vollständig mit Luft und stoßen Sie die Luft und mögliche Acetonreste in den Abfallbehälter aus. Wiederholen Sie dies noch zwei weitere Male, um drei "Wäschen" mit Luft durchzuführen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 3.3.2 für die restlichen 4 Röhrchen Aceton.
   4. Erstellen Sie eine Lufttasche innerhalb des Zylinders zwischen dem Spritzenkolben und der Oberseite der Nadel, indem Sie den Kolben leicht in den Lauf (~ 5 mm) ziehen.
      HINWEIS: Diese Lufttasche schützt den Kolben vor dem Kontakt mit den Insektizidlösungen und reduziert die Verschleppung von Insektiziden.
   5. Stellen Sie die Spritze beiseite, bis sie für die topische Anwendung einsatzbereit ist.
4. Erstellen Sie einen Schlüssel mit den anzuwendenden Dosen und weisen Sie zufällige IDs nach Zufallszahlen- oder Buchstabengeneratoren zu (siehe Ergänzende Datei 1).
5. Beschriften Sie die Plastikbecher mit der zufälligen ID für die Blindensterblichkeitsbewertung.
   HINWEIS: Bei Bedarf kann das Protokoll hier angehalten und zu einem späteren Zeitpunkt neu gestartet werden. Wenn während des Pausierens mehr als ein paar Stunden vergehen, wird empfohlen, Schritt 3.3 zu wiederholen, um sicherzustellen, dass die Spritze sauber ist, und die Insektizidlösungen bis etwa eine Stunde vor der Dosierung der Insekten wieder in den Gefrierschrank zu legen und dann Schritt 3.1 zu wiederholen.

4. Bereiten Sie Proben für den topischen Bioassay vor. Eine Übersicht über die Vorgehensweise finden Sie in Abbildung 1.

1. Sortieren und wiegen Sie die Moskitos
   1. Verwenden Sie einen Aspirator, der durch Absaugen aus dem Einatmen angetrieben wird, um die gewünschte Anzahl von 3-5 Tage alten erwachsenen Moskitos zu aspirieren, die für den Assay benötigt werden, einschließlich eines Überschusses, um beschädigte Personen zu berücksichtigen. Übertragen Sie die Moskitos in eine konische Röhre (bis zu 100 Moskitos pro Röhre), indem Sie die Spitze des Aspirators in die Röhre mit Baumwolle legen, die um die Spitze gewickelt ist, und atmen Sie vorsichtig aus und klopfen Sie auf den Aspirator. Verwenden Sie die Baumwolle, um das Rohr zu verstopfen, wenn die Aspiratorspitze entfernt wird, und schließen Sie es dann mit dem Deckel ab. Vermeiden Sie es, den Aspirator und die Schläuche mit zu vielen Moskitos auf einmal zu füllen, da dies die Moskitos zusätzlich belastet und zum Tod führen kann.
   2. Schlagen Sie die Moskitos kurz in den Röhren nieder, indem Sie sie für mindestens 10 Minuten bei 4 ° C platzieren oder unter Eis in einer Eisschale vergraben.
      HINWEIS: Moskitos können bei minimaler Mortalität mehrere Stunden lang bei 2 ° C gehalten werden²⁹; Es ist jedoch am besten, die Dauer zu minimieren, in der sich die Moskitos auf Eis befinden, um mögliche negative Auswirkungen zu reduzieren.
   3. Bringen Sie die niedergeschlagenen Moskitos in das Insekten-Handling-Zelt und kippen Sie die Moskitos vorsichtig auf ein Plastiktablett (z. B. Petrischale), das auf dem Eis platziert ist. Gießen Sie nur etwa 50 Moskitos gleichzeitig, um sicherzustellen, dass jede das kühle Tablett darunter berührt und niedergeschlagen bleibt.
   4. Sortieren Sie die Moskitos nach Geschlecht, indem Sie sie vorsichtig an den Beinen (n) (oder Flügeln) mit einer Pinzette aufheben und jedes Geschlecht in einen separaten Haltebecher legen. Zählen Sie die Anzahl der Moskitos jedes Geschlechts beim Sortieren und stoppen Sie, wenn die gewünschte Anzahl erreicht ist. Entfernen Sie beim Sortieren alle Moskitos, die verletzt sind (z. B. fehlende Beine) oder besonders groß (z. B. abnormal vergrößerter Bauch) oder klein sind (mit bloßem Auge leicht als kleiner als die durchschnittliche Mückengröße dieser Population zu unterscheiden).
      HINWEIS: Die Handhabung der Moskitos durch die Anhängsel reduziert strukturelle Schäden an ihren weichen Primärkörpern (z. B. Bauch).
   5. Erfassen Sie das Gewicht jeder Tasse Moskitos mit einer analytischen Waage mit einer Genauigkeit von 0,1 mg.
      1. Legen Sie eine leere Tasse mit einer Petrischale als Deckel auf die Waage und tarnen Sie die Waage. Gießen Sie die Moskitos in den Behälter, legen Sie den Deckel darauf und legen Sie den Behälter auf die Waage.
      2. Notieren Sie das kombinierte Gewicht und die Anzahl der Proben auf dem Scoresheet (siehe Zusatzdatei 2). Stellen Sie den Becher mit den Exemplaren sofort wieder auf Eis, um sie immobilisiert zu halten.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.5.1-4.1.5.2, bis alle Becher mit Proben gewogen sind.
   6. Teilen Sie die vorbereiteten Moskitos in Gruppen von 20-25 in separate Tassen, die auf Eis gelegt werden und mit den zufälligen IDs beschriftet sind. Versuchen Sie bei der Übertragung von Moskitos, Stress und körperliche Schäden durch die Pinzette zu reduzieren. Im Idealfall nehmen Sie die Mücken nur 1-2 Mal mit einer Pinzette auf: einmal zum Sortieren / Wiegen und ein potenzielles zweites Mal für den Transfer in die Versuchsbecher.
      HINWEIS: Eine ideale Anzahl von Moskitos pro Tasse ist 20-25, was für eine Replikation ausreicht, vernünftig ist, um die Mortalität zu beurteilen, und sollte nicht zu dichteinduziertem Stress / Tod in der Tasse führen.
2. Sortieren und wiegen Sie die Fruchtfliegen
   1. Anästhesieren Sie die Fliegen mit CO₂ für 7 s.
      HINWEIS: Wenn Fliegen länger als 7 s CO₂ ausgesetzt sind, können sie Schwierigkeiten beim Krabbeln und Fliegen haben, wenn sie³⁰ aufwachen.
   2. Gießen Sie die Fliegen auf einen in Bankpapier eingewickelten Eisbeutel und verwenden Sie einen Pinsel mit feiner Spitze, um die Männchen und Weibchen zu trennen und zu zählen.
   3. Verwenden Sie den Pinsel, um die ausgewählten Fliegen vorsichtig aufzuheben und in eine saubere, leere Lagerflasche zu legen. Wählen Sie die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fruchtfliegen (z. B. 15 männliche und 15 weibliche) und kennzeichnen Sie die Lagerflaschen mit dem Stammnamen und der Fruchtfliegensumme (z. B. Canton-S, 30 Fliegen).
      HINWEIS: Es ist wichtig, die gleiche Anzahl von weiblichen und männlichen Fruchtfliegen zu haben, da männliche Fruchtfliegen erhöhte Aggressionen gegeneinander erfahren können, nachdem sie aus der Anwesenheit von Weibchen^{entfernt wurden 31}. Um nicht-insektizide Mortalität oder Verletzungen zu vermeiden, ist es daher am besten, eine gleiche Anzahl von Männern und Frauen zu haben (oder männliche Fruchtfliegen vollständig wegzulassen).
   4. Erfassen Sie das Gewicht jeder Flasche Fruchtfliegen mit einer analytischen Waage.
      1. Legen Sie eine leere Durchstechflasche (beschriftet mit einer zufälligen ID, siehe Schritt 3.4) mit einer Petrischale als Deckel auf die Waage und trottieren Sie die Waage.
         HINWEIS: Glasfläschchen werden für die Verwendung mit Fruchtfliegen empfohlen, da sie die Statik signifikant reduzieren.
      2. Betäuben Sie die Flasche mit Fruchtfliegen, die der zufälligen ID der Durchstechflasche entspricht, mit CO₂ für 7 s.
      3. Gießen Sie die Fruchtfliegen auf das Wiegepapier und verwenden Sie das Papier als Trichter, um die Fliegen in die Durchstechflasche einzuführen. Legen Sie den Deckel der Petrischale auf das Fläschchen mit Fruchtfliegen und legen Sie es auf die Waage.
      4. Notieren Sie das kombinierte Gewicht und die Anzahl der Proben auf dem Score-Blatt und legen Sie dann sofort die Durchstechflasche mit Fruchtfliegen in eine Eisschale, wobei der Deckel noch oben ist, um zu verhindern, dass die Fliegen entkommen.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.4.1-4.2.4.4 für jede Flasche Fruchtfliegen.
3. Wenn die oben genannten Schritte abgeschlossen sind, fahren Sie sofort mit dem nächsten Abschnitt fort.

5. Dosisproben

1. Laden Sie die Spritze mit der richtigen Insektizidkonzentration. Beginnen Sie mit der am wenigsten konzentrierten Dosis und arbeiten Sie mit jeder Gruppe von Organismen auf die konzentrierteste Dosis hin. Um Abfall zu vermeiden, laden Sie die Spritze nur mit dem benötigten Insektizidvolumen plus empfohlenen zusätzlichen 2 μL.
2. Kippen Sie die Proben auf Wiegepapier(e), das auf einem Tablett auf dem Eis platziert ist. Trennen Sie die Proben, die nahe beieinander liegen, mit einem sauberen, insektizidfreien Pinsel oder Wattestäbchen, um einen einfachen Zugang zu jeder Probe zur Dosierung zu ermöglichen. Verwenden Sie bei Moskitos auch den Pinsel, um sicherzustellen, dass jedes Exemplar auf seinem Rücken liegt und seine ventrale Oberfläche nach oben zeigt.
3. Tragen Sie mit der Spritze einen Tropfen Insektizidlösung (oder Aceton zur Kontrolle) auf den ventralen Thorax- und Bauchbereich für Moskitos und den Dorsum für Fruchtfliegen auf. Tragen Sie ein 0,2 μL Tröpfchen (das eine 10 μL Spritze erfordert) für kleinere Insekten wie Fruchtfliegen und ein 0,5 μL Tröpfchen (das eine 25 μL Spritze erfordert) für Moskitos auf.
   HINWEIS: Die Insektizidempfindlichkeit unterscheidet sich nicht signifikant zwischen primären Körperteilen (wie Kopf, Thorax und Bauch) im Vergleich zu Anhängseln (wie Flügeln, Beinen oder Rüssel)^32. Daher muss die Applikationsstelle nicht genau sein, solange die Dosis Tröpfchen auf den Primärkörper aufgetragen wird. Der ventrale Thorax und der Bauchbereich werden für Moskitos gewählt, weil sie oft auf ihrer dorsalen Seite liegen, wenn sie niedergeschlagen werden, während der Dorsum für Fruchtfliegen gewählt wird, weil sie oft auf ihrer Bauchseite liegen, wenn sie niedergeschlagen werden. Diese verringerte Spezifität der Anwendungsstelle trägt dazu bei, den Durchsatz dieser Methode zu erhöhen.
4. Gießen Sie die Proben sofort wieder in den beschrifteten Plastikbecher und bedecken Sie den Becher mit einem Netz und einem Gummiband. Legen Sie den Becher in ein Haltefach und notieren Sie auf dem Becher alle Exemplare, die bei diesem Prozess getötet, beschädigt oder entwichen sind (um sie bei der endgültigen Zählung der Exemplare in diesem Becher auszuschließen). Notieren Sie für die erste Tasse den Zeitpunkt, zu dem die Dosierung abgeschlossen ist.
5. Ersetzen Sie die Wiegepapiere, auf die die Proben gelegt werden, um eine Insektizidkontamination zwischen den Dosen zu vermeiden.
6. Wiederholen Sie die Dosierung für jede Tasse, bis alle Proben mit den richtigen Insektizidkonzentrationen dosiert wurden, und zeichnen Sie die Endzeit auf, wenn alle Proben dosiert wurden.
7. Geben Sie 10% Saccharoselösung zu jeder Tasse über einen eingeweichten Wattebausch und stellen Sie die Becher beiseite, bis die Mortalität am nächsten Tag beurteilt wird. Lagern Sie die Mücken bei 27 ± 1 °C mit 75 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit⁵ und die Fruchtfliegen bei 23 ± 1 °C mit 60 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Wattebällchen zusammendrücken, um Übersättigung oder Untersättigung zu vermeiden. Die Wattebällchen sollten feucht sein, aber nicht tropfen. Das Tropfen von Zuckerwasser in der Tasse kann zur Sterblichkeit der Proben führen und somit die Mortalitätsbewertung des Insektizids beeinflussen.

6. Bewerten Sie die Mortalität

1. Erfassen Sie die Probensterblichkeit bei 24 h nach Beginn der Insektizidexmission. Klassifizieren Sie Moskitos als lebendig, wenn sie fliegen und sich aufrecht halten können; als tot, wenn sie unbeweglich oder ataxisch sind (nicht in der Lage, zu stehen oder zum Flug zu starten), wie von der WHO⁶ beschrieben. Folgen Sie der gleichen Mortalitätsbewertung für Fruchtfliegen ^8,33.
   HINWEIS: Zur Beurteilung der verzögerten Mortalität kann die Mortalität zusätzlich nach 48 und 72 h mit täglichen Zuckerwasserwechseln beurteilt werden.
2. Nachdem die Mortalität aufgezeichnet wurde, legen Sie alle Becher mit Proben in einem geschlossenen Beutel für mindestens 1 Stunde in einen Gefrierschrank, um sicherzustellen, dass alle Proben vor der Entsorgung oder der anschließenden Verwendung (z. B. molekulare oder chemische Analyse) tot sind.

7. Replikate durchführen

1. Wiederholen Sie die Schritte 3-6 an einem neuen Satz von Proben und achten Sie darauf, jeden Tag zur gleichen Zeit Wiederholungen durchzuführen, da sich die Insektizidanfälligkeit je nach Tageszeit³⁴ ändern kann.
2. Stellen Sie sicher, dass für jede Konzentration mindestens 3 Wiederholungen vorhanden sind, um eine genaue Abschätzung der tödlichen Dosis zu erhalten, die 50% der Proben tötet (LD₅₀). Fügen Sie weitere Replikate hinzu, wenn ein hohes Maß an Variabilität beobachtet wird.
3. Schließen Sie die Analyse ab, nachdem alle Daten gesammelt wurden.

8. Analysieren Sie die Ergebnisse

1. Zeichnen Sie Daten in einem Tabellenkalkulationsprogramm auf und verwenden Sie die zufällige ID-Taste, um die Daten zu entlarven (Referenzschritt 3.4). Speichern Sie die Daten als Textdatei (siehe Beispieldaten in Supplemental File 3) zur Analyse im Statistikprogramm R 35 (siehe Beispiel R-Code in Supplemental File 4) oder einer anderen Software Ihrer Wahl^36.
2. Führen Sie im Softwareprogramm die folgende Analyse durch. Siehe Ergänzende Datei 4 für ein Beispiel für einen R-Code.
   1. Berechnen Sie die Dosis von Insektizid (ng) pro Probenmasse (mg) nach Eq (3) unten:
      (3)
   2. Berechnen Sie die Mortalität und wenden Sie Abbotts Formel 37 an, um die Mortalität im Verhältnis zur in jeder Kontrolle^{37 beobachteten} Mortalität zu korrigieren. Alternativ können Sie die Formel von Schneider-Orelli (1947) verwenden, um die Mortalität^{zu korrigieren 38}. Wenden Sie bei beiden Formeln die Korrektur auf alle Daten unabhängig von der Mortalität in jeder Kontrolle an, wie zuvor^{beschrieben 37} und implementiert³⁹, es sei denn, die Kontrolldaten sind ungewöhnlich hoch (siehe Diskussion unten).
      HINWEIS: Die Formel von Abbott und gleichwertige Alternativen, wie die Schneider-Orelli-Formel, passen die Mortalitätswerte proportional zu dem Ausmaß der Mortalität an, das in den Kontrollen nicht beobachtet wurde, und führen nicht zu einer Abnahme der Mortalität für Becher mit einer Mortalität von 100%. Weitere Informationen finden Sie in den zitierten Referenzen für diese Formeln.
   3. Transformieren Sie korrigierte Mortalitätsdaten in Probit-Werte (Wahrscheinlichkeitseinheit)⁴⁰ und führen Sie eine lineare Regression zwischen der Insektiziddosis und den transformierten Mortalitätsdaten durch. Verwenden Sie einen Chi-Quadrat-Test, um die Anpassung der linearen Modelle zu bewerten.
      HINWEIS: Mortalitätswerte von 0 (0 % Mortalität) oder 1 (100 % Mortalität) werden vor Abschluss der Probit-Transformation aus den Daten entfernt. Dies ist aufgrund der Art der Probit-Transformation notwendig. Daher enthalten die grafisch dargestellten Daten keine Positiv- oder Negativkontrollen oder andere Daten, die zu einer Mortalität von 0 % oder 100 % führten (nachdem die Korrektur von Abbott angewendet wurde).
   4. Berechnen Sie die LD₅₀ und 95% Konfidenzintervalle (CIs) pro Probenstamm, Population und/oder Geschlecht nach zuvor veröffentlichten Methoden 39,41,42.
   5. HINWEIS: Wenn sich die 95%-CIs zweier Stämme nicht überlappen, weisen die Stämme signifikant unterschiedliche Dosis-Wirkungs-Verhältnisse auf.
   6. Berechnen Sie gegebenenfalls Widerstandsverhältnisse (RRs), indem Sie die LD 50 der interessierenden Dehnung durch die LD₅₀ der Referenz-/Kontrolldehnung dividieren.

Abbildung 1: Diagramm des aktuellen Anwendungsassay-Protokolls. Das topische Applikationsassay-Protokoll beginnt mit (A) dem Sortieren von Proben auf Eis, gefolgt von (B) dem Wiegen der Proben auf einer analytischen Waage, (C) dem Dosieren von Proben mit Insektizidlösung (n) und (D) einer Wartezeit von 24 Stunden nach Insektizidexposition mit Zugang zu 10% Saccharoselösung ad libitum (über einen eingeweichten Wattebausch), gefolgt von einer Mortalitätsbewertung. Rote Pfeile zeigen den Zielort der Insektizidanwendung für Moskitos (links) und Fruchtfliegen (rechts) an. Beachten Sie, dass das Bild nicht maßstabsgetreu ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen zwei verschiedene Stämme von Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) und einen isolierten Feldstamm aus Florida mit bekannten Knockdown-Widerstandsmutationen F1534C und V1016I (IICC-Genotyp). Zusätzlich wird Drosophila melanogaster (Kanton: S-Stamm) vorgestellt.

Abbildung 2 und Abbildung 3 veranschaulichen die Dosis-Wirkungs-Beziehung jedes Organismus nach Stamm und Geschlecht, die nach dem obigen Protokoll getestet wurden. Da keine Unterschiede zwischen den Dosis-Wirkungs-Kurven von männlichen und weiblichen Moskitos innerhalb jedes Stammes beobachtet wurden (t = 1,70, p = 0,098 für ROCK und t = 0,64, p = 0,527 für IICC), wurden Daten beider Geschlechter innerhalb jedes Mückenstamms gepoolt. Die massenrelativierten LD 50 für ROCK und IICC_betragen 0,008 ng/mg (95% CI: 0-0,104) bzw. 0,336 ng/mg (95% CI: 0,235-0,438). Die 95%-CIs dieser Werte überschneiden sich nicht, was auf signifikant unterschiedliche Dosis-Wirkungsweisen der Stämme hinweist. Die RR der IICC-Sorte (relativ zur ROCK-Sorte) beträgt 41,7, was laut WHO als hochbeständig^{gilt 5}. Für die Canton-S-Fruchtfliegen beträgt die massenrelativierte LD_{50 0,213} ng/mg (95% KI: 0-0,490).

Abbildung 2: Repräsentative Daten von Mücken mittels topischer Anwendung Bioassay. Repräsentative Dosis-Wirkungs-Daten aus dem Bioassay zur topischen Anwendung nach dem obigen Protokoll unter Verwendung von Deltamethrin und Moskitos: (A) weibliche Ae. aegypti ROCK (n = 880) und IICC (n = 550) Stämme, (B) männliche Ae. aegypti ROCK (n = 880) und IICC (n = 569) Stämme. Deltamethrin-Testkonzentrationen reichten von 0,00075 ng / μL bis 9,68705 ng / μL, und die Dosis von Deltamethrin, die pro durchschnittlicher Mückenmasse (mg) angewendet wird, spiegelt sich auf der x-Achse wider. Die Mortalität wird als Anteil auf der y-Achse dargestellt. Die schwarze Linie durch jeden Datenpunktcluster stellt die dehnungs- und geschlechtsspezifische lineare Regression dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Daten von Fruchtfliegen mittels topischem Applikationsbioassay. Repräsentative Dosis-Wirkungs-Daten aus dem Bioassay zur topischen Anwendung nach dem obigen Protokoll unter Verwendung von Deltamethrin und Fruchtfliegen: D. melanogaster Canton-S-Stamm (n = 1014). Die Deltamethrin-Testkonzentrationen lagen zwischen 0,00499 und 5,02876 ng / μL, und die Dosis von Deltamethrin, die pro durchschnittlicher Fruchtfliegenmasse (mg) angewendet wird, spiegelt sich auf der x-Achse wider. Die Mortalität wird als Anteil auf der y-Achse dargestellt. Die schwarze Linie stellt die lineare Regression dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zusatzfigur S1: Tisch-Insekten-Handling-Zelt. Benchtop-Insekten-Handling-Zelt wird verwendet, um entkommene Moskitos oder Fliegen während des topischen Applikationstests leichter zu fangen. Die Struktur ist in A geschlossen und in B offen. Diese Struktur wurde mit PVC-Rohr und feinmaschigem Gewebe gebaut. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Spritzen- und Repeater-Applikatoreinheit. Spritzen- und Repeater-Applikatoreinheit zur Dosierung von Insekten. Hauptteile sind 1) Nadel, 2) Spritzenlauf, 3) Kolben, 4) Repeater und 5) Repeater-Taste. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Randomisierungsskript: Randomisierungsskript, um unvoreingenommene Etiketten für alle Tassen jedes Experiments zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Mortalitäts-Score-Blatt: Mortalitäts-Score-Sheet zur Unterstützung der Mortalitätsbewertung. Das Blatt enthält auch Orte zum Aufzeichnen aller anderen wichtigen Informationen, auf die im Protokoll verwiesen wird, z. B. die Start- und Endzeiten der Insektizidanwendung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplemental File 3: Beispiel-Mortalitätsdaten: Beispieldatendatei, die zum Erstellen von Abbildung 2 verwendet wird. Die Beschreibungen der Spaltenüberschriften lauten wie folgt: "id" = Identifikationscode jedes Datenpunkts; "Art" = Artname (z. B. Aedes aegypti); "Insektizid" = Name des topisch applizierten Insektizids (z. B. Deltamethrin); "Stamm" = Name des Mückenstamms (z. B. ROCK); "Datum" = Startdatum thematische Anwendung; "Sex" = Geschlecht von Moskitos; "Alter" = Alter der Mücken (jung = 3-5 Tage alt; alt = 4 Wochen alt); "total.mosq" = Gesamtzahl der Moskitos, die in der Charge gewogen werden; "Gewicht" = Gewicht (mg) aller Moskitos innerhalb der Charge; "Konzentration" = Konzentration des Insektizids (μg/ml); "Spritze" = Tröpfchenvolumen (ml) der Spritze; "Dosis" = Menge des Insektizid-Wirkstoffs, der auf jede Mücke (ng) aufgetragen wird; "gesamt" = Anzahl der Moskitos in jeder Tasse; "tot" = Anzahl der toten Moskitos in jeder Tasse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: R-Analysecode: Beispiel R-Code, der zum Abschließen der Probit-Analyse verwendet werden kann (wie in Schritt 8 des Protokolls beschrieben). Die repräsentativen Ergebnisse (zugänglich über die ergänzende Beispieldatendatei) können mit diesem R-Code verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Papier stellt ein angepasstes Protokoll für den topischen Applikationsassay für Mücken und Fruchtfliegen vor. Dieses Verfahren könnte leicht angepasst werden, um im Feld und mit anderen Organismen verwendet zu werden, da es nur minimale Spezialausrüstung erfordert. Im Folgenden werden die kritischen Schritte dieses Protokolls, mögliche Änderungen, Ratschläge zur Fehlerbehebung, Einschränkungen der Methode und die Bedeutung dieser Methode behandelt.

Kritische Schritte im Protokoll: Es gibt drei kritische Schritte im Protokoll, die, wenn sie falsch ausgeführt werden, die Ergebnisse des Bioassays drastisch beeinflussen können: Genauigkeit der Insektizidkonzentration, Probenabschlag und Mortalitätsbewertung.

Genauigkeit der Insektizidkonzentration:
Es ist äußerst wichtig, genaue Insektizidlösungen zu haben, um replizierbare Dosis-Wirkungs-Kurven und aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Der volumetrische Ansatz zur Herstellung von Insektizidlösungen ist in der Literatur sowohl für CDC-Flaschenbioassay 7 als auch für topische Anwendungen^{13,14,43 gebräuchlicher}. Der hier beschriebene gravimetrische Ansatz ist jedoch aufgrund der Berücksichtigung der Temperatur durch die Einbeziehung der (temperaturspezifischen) Dichte von Natur aus genauer, was zu einer genaueren Formulierungsvorbereitung führt.

Proben-Knockdown:
Das Abschlagen der Proben ist ein kritischer Bestandteil dieser Methode und ermöglicht die genaue Verabreichung der Insektizid- und Gewichtsmessungen. Das Abschlagen von Organismen birgt jedoch unweigerlich das Risiko von körperlichem Stress und Schäden, wie bereits gezeigt³⁰. Seien Sie daher vorsichtig und achtsam, wenn Sie die Proben niederschlagen, um sicherzustellen, dass i) jedes Exemplar für eine ähnliche Dauer niedergeschlagen wird, ii) die Länge des Knockdowns auf ein Minimum beschränkt ist und iii) die Methode des Knockdowns bei allen Proben konsistent gehalten wird. Darüber hinaus wird empfohlen, die Knockdown-Methode vor der Anwendung von Insektiziden separat zu testen, um sicherzustellen, dass die Methode erfolgreich ist und keine Kontrollmortalität von mehr als 10% induziert. Der anfängliche Test kann für einen unerfahrenen Benutzer länger dauern, was zu längeren Knockdown-Zeiten führt. Seien Sie daher vorsichtig bei der Interpretation der Ergebnisse der ersten Assays.

Mortalitätsbewertung:
Die Beurteilung der Mortalität kann eine Herausforderung sein, insbesondere wenn das Insektizid die Mücke oder Fliege nicht vollständig tötet, sondern nur niederschlägt oder verstümmelt. Daher ist es wichtig, sich darüber im Klaren zu sein, wie sich das Insektizid auf den Zielorganismus auswirkt, und eine klare Definition für "tote" (oder niedergeschlagene) Organismen zu haben, bevor Sie beginnen. Darüber hinaus wird empfohlen, dieselbe Person die Mortalität zwischen Dosen und Replikationen beurteilen zu lassen, um die Variation zu reduzieren.

Protokolländerungen: Mehrere unten beschriebene Änderungen können auf dieses Protokoll angewendet werden, um seine Vielseitigkeit und Zugänglichkeit zu verbessern.

Anpassung des Assays an kleinere oder größere Insekten:
Bei der Verwendung kleinerer oder größerer Proben wird empfohlen, ein kleineres bzw. größeres Dosisvolumen an Insektiziden aufzutragen. Als Beispiel haben wir das Mückenprotokoll an Fruchtfliegen angepasst, indem wir die 0,5-μL-Dosis auf eine Dosis von 0,2 μL reduziert haben. Stellen Sie sicher, dass die richtige Spritzengröße für das gewählte Dosisvolumen ausgewählt ist.

Anpassung des Assays an Feldinsekten:
Bei der Verwendung von Feldinsekten kann es zu mehr Variationen in der Insektengröße kommen. Daher wäre es empfehlenswert, die Insekten in kleineren Gruppen (z. B. pro Tasse) zu wiegen, anstatt als große Gruppe (z. B. alle Insekten, die für ein Experiment verwendet werden). Dies kann dazu beitragen, die potenzielle Variation der Insektizidanfälligkeit zu erfassen, die mit den Unterschieden in der Insektenmasse im Feld verbunden ist.

Modifikationen der Ausrüstung:
Insekten-Handling-Zelt: Die Dosierung der Probe kann unter einem Insekten-Handling-Zelt durchgeführt werden, das einfach mit PVC-Rohr und Moskitonetz gebaut wird. Dies kann eine Alternative zu einem geschlossenen Raum (z. B. insektär) sein und dazu beitragen, eine mögliche Insektizidkontamination in Bereichen zu beseitigen, in denen Insektenaufzucht auftreten könnte. Dieses Insekten-Handling-Zelt ist einfach zu konstruieren und kostengünstig (~ $ 70). Alternativ könnte ein Insektenkäfig gekauft werden (~ $ 425).

Kühltisch: Eisbeutel oder Eisschalen können verwendet werden, um die Probe niederzuschlagen und / oder die Probe niedergeschlagen zu halten.

Inkubator: Inkubatoren werden empfohlen, um das Exemplar aufzuziehen und das Exemplar nach der Insektizidbehandlung 24 h lang zu halten. Wenn kein Inkubator verfügbar ist, kann er gebaut werden. Die Ausrüstung, die für den Bau des Inkubators benötigt wird, umfasst einen isolierten Behälter, einen Luftbefeuchter, Wärmekabel, einen Feuchtigkeits- und Temperaturregler sowie ein Licht, das sich auf Gesamtkosten von ~ $ 170 summieren sollte, die den vorherigen Methoden folgen und diese erweitern⁴⁴.

Haltebecher: Obwohl Plastikbecher zum Sortieren und Halten des behandelten Exemplars verwendet werden, wären mit Wachs ausgekleidete Pappbecher oder Glasbehälter geeignete Alternativen.

Veränderung des Organismus und des Lebensstadiums:
Diese Methode ist sehr anpassungsfähig für die Verwendung mit anderen Vektoren, Insekten und / oder Arthropoden wie Culex quinquefasciatus Moskitos 32, Hausfliegen³² und Kakerlaken 45, sowie nicht erwachsene Lebensstadien, wie Mückenlarven ⁴⁶.

Aktuelle Änderung des Applikationsstandorts:
Diese Methode beschreibt die Anwendung des Insektizids auf den ventralen Thorax und die Bauchregion für Moskitos (und den Dorsum für Fruchtfliegen). Andere Anwendungsorte können jedoch verwendet werden, solange die Belichtungsstelle konsistent ist. Konsistenz ist wichtig, da die Insektizidempfindlichkeit je nach Anwendungsort^{variieren kann 32}.

Ratschläge zur Fehlerbehebung: Diese Methode besteht aus mehreren Schritten, die zunächst eine Herausforderung darstellen. Im Folgenden werden einige der häufigsten Probleme beschrieben, auf die man stoßen kann.

Undichte / verdampfende Insektizidlösungen:
Insektizide werden üblicherweise in Aceton, einer hochflüchtigen Verbindung, gelöst. Dies bedeutet, dass Aceton bei Raumtemperatur schnell verdunstet und die Insektizidkonzentrationen im Laufe der Zeit erhöht. Wenn die Insektizidlösungen undicht zu sein scheinen oder verdampfen, stellen Sie die Lösungen neu her, stellen Sie sicher, dass der Deckel des Röhrchens fest sitzt, und überprüfen Sie, ob die Speicherprotokolle ordnungsgemäß befolgt werden (z. B. wird Parafilm verwendet und die Röhrchen werden aufrecht gelagert). Wenn die Leckage anhält, versuchen Sie, die Röhrchen mit einem niedrigeren Volumen zu füllen, um mehr Raum für die Änderung des Volumens zu lassen, die das Aceton bei verschiedenen Temperaturen erfährt. Wenn Sie Aceton als Lösungsmittel verwenden, stellen Sie außerdem sicher, dass die Röhrchen für die Acetonlagerung ausgelegt sind (z. B. FEP-, TFE- und PFA-Kunststoffe). Wenn Sie hydrophobe Insektizide verwenden, lagern Sie die Lösungen in Glasfläschchen (da hydrophobe Insektizide weniger als Kunststoff an Glas haften). Es ist auch eine gute Praxis, den Meniskus der Lösung vor der Lagerung zu markieren, um die Verdunstung zu überwachen.

Gewichtsdriften auf der Mikrowaage beim Wiegen von Organismen:
Wenn der Gewichtswert auf der Waage driftet (langsam nach oben oder unten), könnte dies auf statische Werte zurückzuführen sein. Drift tritt am häufigsten beim Wiegen von Organismen in Kunststoffgegenständen auf, da Kunststoff leicht eine statische Ladung halten kann. Um dies zu vermeiden, kann ein Wiegepapier unter den zu wiegenden Kunststoffbehälter gelegt oder ein Nicht-Kunststoffbehälter wie Glas verwendet werden.

Abnormale Mortalitätsergebnisse:
Es gibt viele Möglichkeiten, wie die Mortalitätsergebnisse abnormal erscheinen können, wie z.B. die Beobachtung einer hohen Mortalität in den Kontrollen oder einer hohen/niedrigen Mortalität bei allen Insektiziddosen. Überprüfen Sie die folgenden Fälle zur Problembehandlung in den einzelnen Szenarien.

Hohe Kontrollmortalität
Wenn in der Kontrollgruppe eine hohe Mortalität (10% oder mehr) vorliegt, bewerten Sie die Knockdown-Methode und die Zeitspanne, in der die Proben niedergeschlagen werden. Wenn möglich, verkürzen Sie die Zeitspanne, für die die Proben niedergeschlagen werden. Andere mögliche Faktoren, die für eine hohe Mortalität in den Kontrollen zu berücksichtigen sind, sind i) die Überprüfung, ob die Inkubatoreinstellungen korrekt sind - abnormale Temperaturen und / oder Feuchtigkeit könnten zu einer erhöhten Mortalität führen. Temperatur und Luftfeuchtigkeit sollten mit einem unabhängigen Datenlogger überprüft werden. ii) Beurteilung des Umgangs mit Insekten. Der Umgang mit Insekten zu viel oder zu grob könnte zu einer hohen Sterblichkeit führen. iii) Überprüfung, ob keine Insektizidkontamination in dem 100% Aceton vorhanden ist, das zur Behandlung der Kontrollgruppe oder auf der Instrumentierung verwendet wird. Ersetzen Sie Aceton und reinigen Sie alle Instrumente mit Aceton oder Ethanol. Vermeiden Sie Verunreinigungen, indem Sie häufig Handschuhe austauschen, das Verschütten verhindern und die Instrumente reinigen. Beachten Sie, dass in der Zusatzdatei 3 maximal zwei Moskitos in den Kontrollbechern (nur Aceton) gestorben sind. Diese Sterblichkeitsrate wird nicht als hoch angesehen (sie beträgt weniger als 10%), und daher gab es keinen Grund zur Besorgnis.

Hohe Mortalität in allen exponierten Gruppen (aber nicht in Kontrollgruppen)
Verwenden Sie niedrigere Insektizidkonzentrationen oder kleinere Dosisvolumina zum Testen. Die verwendeten Dosierungen können über der Mindestdosis liegen, die keine Mortalität induziert. Verwenden Sie mehrere 10-fache Verdünnungen, um den richtigen Dosisbereich zu identifizieren und eine Kontamination auszuschließen. Um eine Kontamination zu vermeiden, beginnen Sie mit der Dosierung mit der niedrigsten Konzentration und arbeiten Sie auf die höchste Konzentration hin. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle verwendeten Geräte regelmäßig mit Aceton und / oder Ethanol gereinigt werden, die auf die Probe aufgetragenen Dosen sehr gering sind und selbst die geringste Kreuzkontamination die Ergebnisse beeinträchtigen kann.

Niedrige Mortalität in allen exponierten Gruppen
Verwenden Sie höhere Insektizidkonzentrationen. Die verwendeten Dosierungen könnten alle zu niedrig sein, um die Mortalität in der Bevölkerung zu verursachen. Um den richtigen Dosisbereich zu identifizieren, setzen Sie die Proben mehreren weiteren 10-fachen konzentrierten Dosierungen aus. Stellen Sie sicher, dass die Insektizidlösungen nicht abgelaufen oder abgebaut sind (möglicherweise aufgrund hoher Temperaturen oder Lichteinwirkung). Wenn die Lösungen abgelaufen sind oder der Verdacht besteht, dass sie sich verschlechtert haben, erstellen Sie die Lösungen neu und stellen Sie sicher, dass die richtigen Lagerbedingungen eingehalten werden.

Inkonsistente Mortalität zwischen Replikationen/Tagen
Die Tageszeit, zu der Insekten dem Insektizid ausgesetzt sind, könnte den Grad der zum Ausdruck gebrachten Resistenz beeinflussen, insbesondere bei metabolischen Resistenzen³⁴. Wiederholen Sie dieses Protokoll jeden Tag während des gleichen Zeitfensters, um die Tageszeit als potenzielle Variable zu vermeiden, die zu Änderungen der Mortalität beiträgt. Andere mögliche Faktoren, die zu einer inkonsistenten Mortalität zwischen Replikaten beitragen, sind i) Proben, die zwischen den Experimenten unterschiedlich aufgezogen werden. Stellen Sie sicher, dass alle Exemplare die gleiche Altersgruppe haben, bei der gleichen Temperatur und ähnlichen Dichten und Nahrungsverfügbarkeit aufgezogen werden. ii) Insektizidkonzentrationen, die im Laufe der Zeit abgebaut werden oder sich aufgrund der Acetonverdunstung konzentrieren. Überarbeiten Sie die Lösungen und stellen Sie die richtigen Lagerbedingungen sicher. iii) Inkonsistente Mortalitätsbewertung. Stellen Sie sicher, dass dieselbe Person die Mortalität bewertet, oder entwickeln Sie ein klares Protokoll, das im gesamten Team konsistent verwendet werden kann. Verwenden Sie Blind-Scoring, um Verzerrungen bei der Mortalitätsbewertung zu reduzieren.

Insekten, die an der Oberfläche der Sortierschale haften:
Aceton reagiert auf Kunststoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden, wie Petrischale. Die Probe haftet wahrscheinlich an der Oberfläche, wenn Aceton auf Petrischalen oder ähnlichen Kunststoffoberflächen verwendet wird. Diese Haftung kann vermieden werden, indem das Sortierfach mit Wiegepapier ausgekleidet oder ein sortierfach ohne Kunststoff verwendet wird. Darüber hinaus kann Kondensation auf der Oberfläche von Kunststoff in der Sortierschale oder in den Haltebechern dazu führen, dass Insekten an der Kondensation haften, oder die Probe kann zu kalt sein und möglicherweise an der Oberfläche gefrieren. Passen Sie die Knockdown-Methode an, um die Kondensation zu reduzieren und gleichzeitig zu verhindern, dass die Proben zu kalt / gefroren werden (z. B. Wägepapier zwischen die Proben und das Kunststoffsortierfach legen).

R-Analysefehler:
Sobald die Mortalitätsdaten gesammelt wurden, können während der Analyse eine Vielzahl von Komplikationen auftreten. Der häufigste Grund, warum ein R-Code die Aktionen für die Datendatei nicht ausführen kann, ist, dass das Datenformat nicht mit dem Code übereinstimmt (z. B. Spaltenüberschriften und/oder leere Zellen). Wenn schwerwiegendere Komplikationen auftreten, lesen Sie die R-Hilfeseiten, die in Rstudio³⁵ integriert sind.

Einschränkungen der oben beschriebenen topischen Anwendungsmethode:
Die Insektizidabsorption über die topische Anwendungsmethode ahmt keine natürliche Exposition nach:
Die topische Anwendung auf den Primärkörper ist nicht die natürliche Art der Insektizidabsorption. Im Feld absorbieren Insekten Insektizide meist über ihre Beine über die Zeit, in der sie mit der mit Insektiziden behandelten Oberfläche oder auf ihren Flügeln durch kleine Aerosolpartikel^47,48 in Kontakt kommen^, anstatt eine schnelle Exposition auf der ventralen Oberfläche. Die direkte Anwendung einer bekannten Insektiziddosis wird jedoch genau eine phänotypische Reaktion auf Insektizide feststellen, die für genetische und evolutionäre Studien oder Vergleiche der Insektizidempfindlichkeit über Raum oder Zeit hinweg erforderlich ist. Daher ist dieser Ansatz für die Prüfung technischer Resistenzen von Vorteil, misst jedoch nicht direkt die praktische Resistenz (die Wirksamkeit des tatsächlichen Interventionsinstruments in einer Feldeinstellung¹⁵). Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die derzeitigen Standardmethoden (z. B. WHO-Röhrchentests und CDC-Flaschenbioassays) auch keine Insektizidexposition im Feld erfassen oder nachahmen können (d. H. Durch Beschlagen).

Topische Applikationsassays können nur Kontaktabsorptionsinsektizide beurteilen:
Diese Methode ist für Insektizide vorgesehen, die durch Kontakt und Absorption des Insektizids wirken, und nicht für die Verwendung mit oralen Insektiziden, wie Borsäure, die üblicherweise in attraktiven toxischen Zuckerködern verwendet^{wird 49}.

Bedeutung der Methode:
Die topische Applikationsmethode erweitert etablierte Standards für Insektizid-Bioassays durch Berechnung der tödlichen Dosis (nicht Konzentration) und Messung der technischen (nicht praktikablen) Resistenz¹⁵. Im Folgenden sind die Vor- und Nachteile dieser Methode gegenüber bestehenden Insektizid-Suszeptibilitätstests aufgeführt.

Berechnung der tödlichen Dosis:
Diese Methode bestimmt die tödliche Dosis des Insektizids und nicht die tödliche Konzentration, die die CDC- und WHO-Bioassays zur Bestimmung der diskriminierenden Dosis¹¹ verwenden. Die tödliche Dosis ist aussagekräftiger, da es sich um eine quantifizierte Menge an Insektizid handelt, von der bekannt ist, dass sie die Mortalität auslöst. Im Gegensatz dazu berücksichtigt die tödliche Konzentration nicht, wie viel Insektizid der Organismus tatsächlich erwirbt. Bei der Berechnung der tödlichen Dosis können Unterschiede zwischen geschlechts- oder größenabhängigen Suszeptibilitätsprofilen genauer beobachtet und quantifiziert werden, was diese Messung noch vielseitiger macht.

Technische Beständigkeit:
Diese Methode bewertet die technische Beständigkeit, d. h. den Widerstand, der in standardisierten, kontrollierten Umgebungen gemessen wird. Solche Messungen eignen sich zur Überwachung der Ausbreitung von Insektizidresistenzen und zur Verknüpfung phänotypischer Resistenzen mit potenziellen Markern¹⁵. Aufgrund der verringerten Variation der Mortalität aufgrund des Bioassays zur topischen Anwendung ermöglicht es eine bessere Identifizierung neuer Resistenzmarker. Aufgrund der unnatürlichen Exposition von Insektiziden gegenüber der Mücke ist dieser Assay jedoch nicht für die Abschätzung der Wirksamkeit eines bestimmten Eingriffs in einer bestimmten Population geeignet. Für Messungen eines solchen praktischen Widerstands werden weitere Assays benötigt¹⁵.

Anpassungsfähigkeit der Proben:
Diese Methode kann an anderen wichtigen Arthropoden wie Pflanzenschädlingen (z. B. Kartoffelkäfer), Hausschädlingen (z. B. Kakerlaken und Bettwanzen) oder Bestäubern (z. B. Bienen) mit einfachen Änderungen des Knockdown-Ansatzes und / oder der Insektiziddosis, des Volumens und / oder der Konzentration (wie oben beschrieben) angewendet werden. Die einfache Anpassungsfähigkeit kann dazu beitragen, die Insektizidresistenzforschung in verschiedenen Forschungsbereichen zu analogisieren. Die Verwendung eines LD 50-Wertes anstelle einer tödlichen Konzentration, die 50% der Exemplare tötet (LC₅₀), ermöglicht einen genauen Vergleich zwischen den Arten.

Kosten:
Ähnlich wie bei CDC-Flaschenbioassays und WHO-Röhrchentests sind die Kosten für die Durchführung des topischen Anwendungstests minimal (siehe Materialtabelle). Die wesentlichen Ausrüstungsgegenstände sind die Spritze (ca. 70 US-Dollar) und der Spender (ca. 100 US-Dollar), die über Assays wiederverwendbar sind.

Anzahl der benötigten Exemplare:
Pro topischem Applikationsassay-Becher sollten mindestens 20-25 Proben verwendet werden. Es wird empfohlen, mindestens fünf Insektizidkonzentrationen pro Experiment zu testen, wobei mindestens drei Replikate für das Verfahren empfohlen werden. Insgesamt ergeben sich daraus mindestens 300-375 Proben, die für einen vollständigen Test benötigt werden, vergleichbar mit der Anzahl der Proben, die für die Durchführung von Widerstandsintensitätstests mit WHO-Röhrchentests oder CDC-Flaschenbioassays erforderlich sind. Wenn jedoch mit dem topischen Anwendungsbioassay eine reduzierte Variabilität erreicht wird, kann die gleiche Anzahl von Proben zu mehr statistischer Aussagekraft führen, um Suszeptibilitätsdaten über Raum oder Zeit hinweg zu vergleichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Thomas Scientific	20A00L068	Aceton-Aliquot-Lagerung
1,5 mL Röhrchen mit Schraubverschluss	Thomas Scientific	1182K23	Insektizid-Verdünnungs-Lagerung
15 mL konische Röhrchen	VWR	339651	Insektizid-Verdünnungs-Lagerung
20 mL Glas-Szintillationsfläschchen	Fisher Scientific	0334125D	Wiegen von Fruchtfliegen
25 μ L Spritze	Fisher Scientific	14815288	Topischer Applikator
	Aceton Fisher	Scientific AC423240040	ACS 99,6%, 4 L
Aedes aegypti (IICC-Stamm)	USDA CMAVE	NA	Insektizidresistent
Aedes aegypti (Rockefeller-Stamm)	CDC	NA	Insektizidanfällig
Analysewaage	Fisher Scientific	14-557-409	Präzision bis zu 0,1 mg
Aspirator	Amazon	6.49986E+11	Mückensammelgerät
Tischpapier	VWR	89126-794	Platz unter dem Arbeitsbereich
Wattestäbchen	Amazon	B092S8JVQN	Verwendung zum Sortieren von Insekten
Wattebällchen	Amazon	B0769MKZWT	Verwendung für Saccharoselösung
Dispenser	Fisher Scientific	1482225	Repeater-Pipettore
Drosophila melanogaster (Canton-S-Stamm)	University of Wisconsin-Madison	NA	Insektizidanfällig
Pinsel mit feiner Spitze	Amazon	B07KT2X1BK	Verwendung zum Sortieren von Insekten
Fruchtfliegen-Vorratsflaschen	Fisher	Scientific AS355	Verwendung zum Aufziehen und Sortieren Fruchtfliegen
Tragbarer CO2Spender	Fisher Scientific	NC1710679	Zum Zerlegen von Insekten Haltebecher
	Amazon	B08DXG7V1S	Klarer Kunststoff
Eisbeutel	Amazon	B08QDWMMW5	Zum Zerlegen von Fruchtfliegen
Eisschalen	Amazon	9301085269	Zum Zerlegen von Insekten
Insekten Pinzette	Amazon	B07B4767WR	Insektenzange
Insektizid	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltamethrin
Beschriftungsaufkleber	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" Farbe Punkt Aufkleber
Beschriftungsband	Amazon	B00X6A1GYK	Weißes Klebeband
Netting	Amazon	B07F2PHHWV	Zum Abdecken von Haltebechern und Insekten verwenden Petrischalen für Materialumschlag
	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
PVC-Rohr	Lowe' s	23971	Insektenhandhabung Zeltmaterialien
Gummibänder	Amazon	B00006IBRU	Verwendung zur Sicherung von Gittern / Netzen auf Bechern
Saccharose	Amazon	B01J78INO0	Granulat weißer Zucker
Wiegepapier	VWR	12578-165	4" x 4"