Experimenteller und Datenanalyse-Workflow für die Nanoindentation weicher Materie

Summary

Das Protokoll stellt einen vollständigen Workflow für Experimente zur Nanoindentation weicher Materialien dar, einschließlich Hydrogele und Zellen. Zunächst werden die experimentellen Schritte zur Erfassung von Kraftspektroskopiedaten detailliert beschrieben. Dann wird die Analyse solcher Daten durch eine neu entwickelte Open-Source-Python-Software detailliert, die kostenlos von GitHub heruntergeladen werden kann.

Abstract

Nanoindentation bezieht sich auf eine Klasse von experimentellen Techniken, bei denen eine mikrometrische Kraftsonde verwendet wird, um die lokalen mechanischen Eigenschaften von weichen Biomaterialien und Zellen zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat eine zentrale Rolle in den Bereichen Mechanobiologie, Biomaterialdesign und Tissue Engineering eingenommen, um eine korrekte mechanische Charakterisierung weicher Materialien mit einer Auflösung zu erhalten, die mit der Größe einzelner Zellen (μm) vergleichbar ist. Die beliebteste Strategie, um solche experimentellen Daten zu gewinnen, ist die Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (AFM); Während dieses Instrument eine beispiellose Auflösung in Kraft (bis hin zu pN) und Raum (Sub-nm) bietet, ist seine Verwendbarkeit oft durch seine Komplexität eingeschränkt, die Routinemessungen von integralen Indikatoren mechanischer Eigenschaften wie dem Elastizitätsmodul (E) verhindert. Eine neue Generation von Nanoindentern, wie sie auf der optischen Fasersensortechnologie basieren, hat in letzter Zeit an Popularität gewonnen, da sie sich leicht integrieren lässt und gleichzeitig sub-nN-Kräfte mit μm-Ortsauflösung aufbringen kann, wodurch sie zur Untersuchung lokaler mechanischer Eigenschaften von Hydrogelen und Zellen geeignet sind.

In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung vorgestellt, die das experimentelle Verfahren zur Erfassung von Nanoindentationsdaten auf Hydrogelen und Zellen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanofaser-Sensor-Nanoindenters beschreibt. Während einige Schritte spezifisch für das hier verwendete Instrument sind, kann das vorgeschlagene Protokoll als Leitfaden für andere Nanoindentationsvorrichtungen verwendet werden, vorausgesetzt, einige Schritte werden gemäß den Richtlinien des Herstellers angepasst. Darüber hinaus wird eine neue Open-Source-Python-Software vorgestellt, die mit einer benutzerfreundlichen grafischen Benutzeroberfläche für die Analyse von Nanoindentationsdaten ausgestattet ist, die das Screening von falsch erfassten Kurven, die Datenfilterung, die Berechnung des Kontaktpunkts durch verschiedene numerische Verfahren, die konventionelle Berechnung von E sowie eine erweiterte Analyse ermöglicht, die sich besonders für einzellige Nanoindentationsdaten eignet.

Introduction

Die grundlegende Rolle der Mechanik in der Biologie ist heute etabliert ^1,2. Von ganzen Geweben bis hin zu einzelnen Zellen können mechanische Eigenschaften über den pathophysiologischen Zustand des untersuchten Biomaterials ^3,4 informieren. Zum Beispiel ist Brustgewebe, das von Krebs betroffen ist, steifer als gesundes Gewebe, ein Konzept, das die Grundlage des beliebten Palpationstests⁵ ist. Insbesondere wurde kürzlich gezeigt, dass die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das schwere akute respiratorische Syndrom ....

Protocol

1. Vorbereitung von Substraten/Zellen für Nanoindentationsmessungen

1. Befolgen Sie die im Zusatzprotokoll angegebenen Schritte zur Vorbereitung von PAAm-Hydrogelen/-Zellen für Nanoindentationsexperimente. Das Verfahren ist in Abbildung 2 zusammengefasst.
   HINWEIS: PAAm-Hydrogele wurden ausgewählt, da sie die am häufigsten verwendeten Hydrogele im Bereich der Mechanobiologie sind. Das Protokoll ist jedoch gleichermaßen auf jede Art von Hydrogel²⁵ anwendbar (siehe Diskussion, Änderungen des Verfahrens).

2. Inbetriebna....

Results

Nach dem Protokoll wird ein Satz von F-z-Kurven erhalten. Das Dataset enthält höchstwahrscheinlich gute Kurven und Kurven, die verworfen werden müssen, bevor mit der Analyse fortgefahren wird. Im Allgemeinen sollten Kurven verworfen werden, wenn sich ihre Form von der in Abbildung 4A gezeigten unterscheidet. Abbildung 5AI zeigt einen Datensatz von ~100 Kurven, die auf einem weichen PAAm-Hydrogel von erwartetem E 0,8 KPa³⁵

Discussion

Dieses Protokoll zeigt, wie Kraftspektroskopie-Nanoindentationsdaten mit einem kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanoindenter sowohl auf Hydrogelen als auch auf einzelnen Zellen robust erfasst werden können. Darüber hinaus werden Anleitungen zur Verwendung einer in Python programmierten Open-Source-Software bereitgestellt, die einen präzisen Workflow für die Analyse von Nanoindentationsdaten umfasst.

Kritische Schritte im Protokoll
Die folgenden Schritte haben sich bei d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm Deckgläser	VWR	631-1577P
35 mm zellbehandelte Kulturschalen	Greiner CELLSTAR	627160
Acrylamid	Sigma-Aldrich	A4058
Acrylsilan	Alfa Aesar	L16400
Ammonium Persulfate	Merk	7727-54-0
Bisacrylamid	Merk	110-26-9
Chiaro Nanoindenter	Optics 11 Lebensdauer		keine Katologennummer
Ethanol			allgemein
Fötales Rinderserum	Gibco	16140071
High Glucose DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			allgemein
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Objektträger Mikroskop	Objektträger VWR	631-1550P
MilliQ System	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer	Optik11 Lebensdauer		keine Katalognummer
Optik 11 Lebenssonde (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 μm)	Optik 11 Lebensdauer		keine Katologenzahl
Optik 11 Lebenssonde (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 μm)	Optik 11 Lebensdauer		ohne Katologenzahl
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
RainX regenabweisend	RainX	26012
Standard Petrischalen (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetramethylethylendiamin	Sigma-Aldrich	110-18-9
Vakuum-Exsikkator	Thermo Scientific	531-0250
Software
Datenerfassungssoftware (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (optional)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (optional)	Microsoft