Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

3.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/63411

⸱

20. Dezember 2021

 ,  ,  , 
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ermöglicht eine markierungsfreie Abbildung des biologischen Gewebes in seiner natürlichen Mikroumgebung auf der Grundlage intrinsischer molekularer Schwingungen und ist somit ein perfektes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung biologischer Prozesse bei subzellulärer Auflösung. Durch die Integration der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzbildgebung (TPEF) in das SRS-Mikroskop kann die dual-modale In-vivo-Bildgebung von Geweben kritische biochemische und biophysikalische Informationen aus mehreren Perspektiven erfassen, die helfen, die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau usw. beteiligt sind. In diesem Videoprotokoll wird der Aufbau eines TPEF-SRS-Mikroskopsystems sowie das in vivo bildgebende Verfahren des tierischen Rückenmarks vorgestellt. Das Rückenmark spielt als Teil des zentralen Nervensystems eine entscheidende Rolle bei der Kommunikation zwischen dem Gehirn und dem peripheren Nervensystem. Myelinscheide, die reich an Phospholipiden ist, umgibt und isoliert das Axon, um eine salzige Leitung von Aktionspotentialen zu ermöglichen. Die In-vivo-Bildgebung von Myelinscheiden im Rückenmark ist wichtig, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt auch die Tierpräparation und in vivo TPEF-SRS-Bildgebungsverfahren zur Aufnahme hochauflösender biologischer Bilder.

Einleitung

Die Raman-Mikroskopie1,2 entwickelt sich zu einer leistungsstarken markierungsfreien Methode, um biologisches Gewebe basierend auf den charakteristischen Frequenzen verschiedener chemischer Bindungen in Biomolekülen abzubilden. Aufgrund ihrer nicht-invasiven und gut adaptiven Bildgebungsfähigkeit wurde die Raman-Mikroskopie häufig für die Bildgebung von lipidangereicherten Komponenten in biologischen Geweben wie Myelinscheide3,4,5, Adipozyten6,7 und Lipidtröpfchen eingesetzt8,9,10 . Das Signal der stimulierten Raman-Streuung (SRS), das als stimulierter Raman-Gewinn (SRG) oder stimulierter Raman-Verlust (SRL) erfasst wird, ist hintergrundfrei und zeigt eine perfekte spektrale Ähnlichkeit mit spontaner Raman-Streuung11,12. Darüber hinaus sind SRL und SRG linear von der Analytkonzentration abhängig, was eine quantitative Analyse der biochemischen Komponenten ermöglicht9,11,13. Die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (TPEF) wurde aufgrund ihrer inhärenten optischen Schnittfähigkeit, tiefen Eindringtiefe und geringen Phototoxizität häufig für die biologische In-vivo-Bildgebung eingesetzt14,15,16. Die Leistung der TPEF-Bildgebung hängt jedoch von den Eigenschaften fluoreszierender Tags ab, und die Anzahl der auflösbaren Farben ist aufgrund der breitbandigen Fluoreszenzspektren begrenzt8,17,18,19. Markierungsfreie SRS-Bildgebung und fluoreszenzbasierte TPEF-Bildgebung sind zwei komplementäre Bildgebungsmodalitäten, und ihre Kombination kann reichlich biophysikalische und biochemische Informationen über Gewebe liefern. Diese beiden Bildgebungsmodalitäten basieren beide auf den nichtlinearen optischen (NLO) Prozessen, die eine einfache Integration in ein Mikroskopsystem ermöglichen. Die Kombination der SRS- und TPEF-Bildgebung, die sogenannte dual-modale Bildgebung, ermöglicht eine hochdimensionale Bildgebung und Profilierung von Zellen und Geweben und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis komplexer biologischer Systeme. Insbesondere kann die Pikosekunden-SRS-Mikroskopie eine chemische Bindungsbildgebung mit hoher spektraler Auflösung im Vergleich zur Femtosekunden-SRS-Technik (fs)11 erreichen, die es ermöglicht, mehrere biochemische Komponenten in biologischem Gewebe zu unterscheiden, insbesondere in der überfüllten Fingerabdruckregion20,21. Darüber hinaus zeigt SRS im Vergleich zu einem anderen häufig verwendeten dual-modalen NLO-Mikroskopsystem mit Integration eines kohärenten Anti-Stokes-Streumikroskops (CARS) eine überlegene Leistung gegenüber CARS in Bezug auf Spektral- und Bildinterpretation sowie Detektionsempfindlichkeit11. Das SRS-TPEF-Mikroskop wurde als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung verschiedener biologischer Systeme verwendet, wie Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis Kaulquappengehirn5, Mausgehirn23,24, Rückenmark25,26, peripherer Nerv27 und Fettgewebe7 usw.

Das Rückenmark bildet zusammen mit dem Gehirn das zentrale Nervensystem (ZNS). Die Visualisierung zellulärer Aktivitäten im ZNS in vivo unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von ZNS-Erkrankungen28,29,30 und für die Entwicklung entsprechender Therapien31,32,33. Die Myelinscheide, die Axone für eine Hochgeschwindigkeits-Wirkungspotentialleitung umhüllt und isoliert, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Die Demyelinisierung gilt als Kennzeichen bei Erkrankungen der weißen Substanz wie der Multiplen Sklerose34. Darüber hinaus können Myelinreste nach einer Rückenmarksverletzung35 die Makrophagenaktivierung modulieren, was zu chronischen Entzündungen und Sekundärverletzungen beiträgt36. Daher ist die In-vivo-Bildgebung von Myelinhüllen zusammen mit Neuronen und Gliazellen in lebenden Mausmodellen eine große Hilfe, um die dynamischen Prozesse bei ZNS-Erkrankungen zu verstehen.

In diesem Protokoll werden die grundlegenden Setup-Verfahren eines selbst gebauten TPEF-SRS-Mikroskops beschrieben und die dual-modalen In-vivo-Bildgebungsverfahren für das Rückenmark der Maus vorgestellt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierverfahren, die bei dieser Arbeit durchgeführt werden, werden gemäß den Richtlinien der Laboratory Animal Facility der Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) durchgeführt und von der Tierethikkommission der HKUST genehmigt. Für die Einrichtung und Bedienung des TPEF-SRS-Mikroskops ist eine Sicherheitsschulung für die Laserhandhabung erforderlich. Tragen Sie immer eine Laserschutzbrille mit entsprechendem Wellenlängenbereich, wenn es um Laser geht.

1. Aufbau des TPEF-SRS-Mikroskops (Setup-Schema siehe Abbildung 1)

  1. Verwenden Sie einen integrierten optischen parametrischen Oszillator (OPO), der mit einem modegebundenen Ytterbium-Faserlaser verbunden ist, als ps-Laserquelle für die SRS-Bildgebung.
    HINWEIS: OPO gibt einen Stokes-Strahl (1031 nm) und einen Pumpstrahl (abstimmbar von 780 nm bis 960 nm) mit 2 ps Pulsdauer und 80 MHz Wiederholrate aus. Der Stokes-Strahl wird bei 20 MHz durch einen eingebauten elektro-optischen Modulator (EOM) für die hochfrequente phasensensitive SRS-Detektion auf MHz-Ebene moduliert.
  2. Verwenden Sie einen fs Titan (Ti): Saphirlaser als Laserquelle für die TPEF-Bildgebung.
  3. Verwenden Sie ein Paar Objektive (L1 und L2), um zu kollimieren und die Größe des fs-Strahls auf 3 mm einzustellen.
  4. Verwenden Sie ein Paar Linsen (L3 und L4), um den ps-Laserstrahl zu kollimieren und seinen Durchmesser auf 3 mm zu erweitern.
  5. Ändern Sie die Polarisation des fs-Laserstrahls von p-Polarisation auf s-Polarisation mit einer Halbwellenplatte.
  6. Kombinieren Sie die beiden Laserstrahlen mit einem polarisierenden Strahlteiler (PBS).
  7. Fügen Sie ein Paar 3-mm-XY-Scan-Galvanometerspiegel hinter dem PBS für das Strahlscannen hinzu.
  8. Verwenden Sie ein telezentrisches Scanobjektiv (L5) und ein unendlich korrigiertes Röhrenobjektiv (L6), um den Scanspiegel und die hintere Pupille des 25-fachen Objektivs zu konjugieren. Erweitern Sie den Laserstrahl um die Scanlinse und die Tubuslinse, um die hintere Blende des Objektivs auszufüllen.
  9. Platzieren Sie einen PBS- oder dichroitischen Spiegel (D2) zwischen der Röhrenlinse und der Objektivlinse für die SRS- oder Fluoreszenzsignalsammlung. Verwenden Sie einen motorisierten Flipper, um zwischen PBS und D2 zu wechseln.
    HINWEIS: Ein Teil des rückgestreuten SRS-Signals geht beim Passieren des PBS aufgrund seiner zufällig verschobenen Polarisation verloren.
  10. Verwenden Sie ein Paar Linsen (L7 und L9), um den Erfassungsstrahl zu verengen und die hintere Pupille der 25-fachen Objektivlinse mit einem Fotodiodensensor zu konjugieren.
  11. Verwenden Sie ein Paar Linsen (L8 und L10), um den Detektionsstrahl zu verengen und die hintere Pupille des 25-fachen Objektivs mit der Detektionsoberfläche des Photomultipliers (PMT) zu konjugieren.
  12. Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel (D3), um den Detektionspfad von Fluoreszenz- und SRS-Signalen zu trennen.
  13. Platzieren Sie ein Filterset (Fs1) vor dem Photodiodendetektor, um den Stokes-Laser zu blockieren und nur den Pumpstrahl zu passieren.
  14. Platzieren Sie ein Filterset (Fs2) vor dem PMT-Detektor, um nur das Zielfluoreszenzsignal zu leiten.
  15. Schließen Sie den PMT zur Signalverstärkung an einen Stromverstärker an.
  16. Schließen Sie die Fotodiode an einen Lock-in-Verstärker an.
  17. Schließen Sie das Sync-Signal vom eingebauten EOM-Ausgang an den Referenzeingang des Lock-in-Verstärkers zur SRS-Signaldemodulation an.
  18. Schließen Sie den PMT-Verstärker und die Lock-in-Verstärkerausgänge an das Datenerfassungsmodul an.

2. Kalibrierung des TPEF-SRS-Mikroskopsystems

  1. Inbetriebnahme der Laser
    1. Schalten Sie den Schlüsselschalter von der Standby- in die Ein-Position, um den Ti: Saphirlaser einzuschalten, und warten Sie 30 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat.
    2. Schalten Sie den OPO ein, indem Sie auf die Schaltfläche Start auf dem OPO Control Panel klicken und warten Sie 20 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat.
    3. Nachdem sich der PS-Laser erwärmt hat, verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Photodetektor, um die Modulationstiefe des Stokes-Strahls zu überprüfen. Öffnen Sie den Laserverschluss für den Stokes-Strahl. Klicken Sie auf die Set OPO Power Box und geben Sie 20 ein. Platzieren Sie den Hochgeschwindigkeits-Photodetektor am OPO-Ausgang, um den Strahl zu detektieren. Verbinden Sie den Ausgangsanschluss des Photodetektors mit dem Eingangsanschluss eines Oszilloskops über ein Koaxialkabel mit Bajonett-Neill-Concelman (BNC)-Anschluss, um den Laserpuls zu überwachen.
    4. Öffnen Sie das EOM-Steuerungsfenster in der OPO-Steuerungssoftware . Stellen Sie die EOM-Leistung und -Phase entsprechend dem auf dem Oszilloskop gezeigten Pulsintensitätsdiagramm ein, um eine maximale Modulationstiefe bei 20 MHz zu erreichen.
      HINWEIS: Die EOM-Leistung ist in der Regel stabil und muss nur überprüft werden, wenn das SRS-Signal deutlich verringert ist.
  2. Optische Ausrichtung des kombinierten TPEF-SRS-Mikroskops
    1. Führen Sie eine optische Ausrichtung zur Kolokalisierung der ps- und fs-Strahlen durch, wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.13 beschrieben.
    2. Öffnen Sie den Laserverschluss der Pumpe, während Sie die Stokes-Ausgabe in der OPO-Steuerungssoftware stoppen. Verwenden Sie die OPO-Steuerungssoftware, um die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 796 nm einzustellen, indem Sie auf die Set Signal Box klicken und den Wellenlängenwert 796 eingeben. Klicken Sie auf die Box Set OPO Power und geben Sie 20 ein, um die Leistung auf das Minimum (~ 20 mW) für die optische Ausrichtung einzustellen.
    3. Schalten Sie den Mikroskopcomputer und alle zugehörigen elektronischen Komponenten ein, einschließlich Scanner, Objektivaktuatoren, Photodioden, PMTs, Stromverstärker, Lock-in-Verstärker und motorisierte Flossen. Starten Sie die Mikroskopsteuerungssoftware.
      HINWEIS: Die Mikroskopsteuerungssoftware ist eine hausgemachte Schnittstelle.
    4. Platzieren Sie zwei Ausrichtungsplatten (P1 und P2 in Abbildung 1) auf dem optischen Weg. Platzieren Sie P1 hinter PBS in einem Abstand von ca. 10 cm und platzieren Sie P2 hinter P1 in einem Abstand von ca. 30 cm.
      HINWEIS: Die ps- und fs-Strahlen werden mithilfe eines PBS kombiniert (Abbildung 1). Die beiden Ausrichtungsplatten dienen zur Überprüfung der Ausrichtung sowie der Kolokalisation der beiden Laserstrahlen.
    5. Öffnen Sie den Mikroskopverschluss für den ps-Laserstrahl.
    6. Stellen Sie den Spiegel M1 so ein, dass er die ps-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P1 lokalisiert. Verwenden Sie ein Infrarot (IR) Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P1 zu beobachten, wenn Sie den Spiegel M1 einstellen.
    7. Stellen Sie den Spiegel M2 ein, um die ps-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P2 zu lokalisieren. Verwenden Sie das IR-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P2 beim Einstellen des Spiegels M2 zu beobachten.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6 und 2.2.7, bis sich die ps-Strahlmitte am Durchgangsloch beider Ausrichtungsplatten befindet. Schließen Sie den Verschluss des PS-Strahls in der Mikroskopsteuerungssoftware.
    9. Stellen Sie die Wellenlänge von fs Ti: Saphirlaser auf 740 nm ein und öffnen Sie den Laserverschluss. Stellen Sie die Laserleistung auf 5 mW (gemessen am Eingangsanschluss des Mikroskopsystems) für die optische Ausrichtung ein.
    10. Öffnen Sie den Mikroskopverschluss für den fs-Laserstrahl.
    11. Stellen Sie den Spiegel M3 ein, um das fs-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P1 zu lokalisieren.
    12. Stellen Sie den Spiegel M4 ein, um das Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P2 zu lokalisieren.
    13. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.11 und 2.2.12, bis sich das fs-Laserstrahlzentrum an den Durchgangslöchern zweier Ausrichtungsplatten befindet. Schließen Sie den Mikroskopverschluss für den fs-Strahl.
    14. Führen Sie eine räumliche Überlappung der Pumpe und der Stokes-Träger durch, wie in den Schritten 2.2.15 bis 2.2.18 beschrieben.
      HINWEIS: Obwohl sich die Pumpe und die Stokes-Strahlen im ps-Laser grob überlappen, ist eine Feinabstimmung der Positionen der beiden Laserstrahlen erforderlich, um eine optimale SRS-Leistung zu erzielen. Da der Pumpenstrahl zunächst wie zuvor beschrieben ausgerichtet wird, wird als nächstes der Stokes-Strahl so eingestellt, dass er mit dem Pumpenstrahl kolokalisiert.
    15. Platzieren Sie eine Kamera an der Position des Objektivs, um die Position von zwei Strahlpunkten zu visualisieren. Markieren Sie die Position des Pumpenstrahls auf dem Kamerabildschirm als Referenz.
    16. Setzen Sie eine Ausrichtungsplatte P0 vor L3 (Abbildung 1). Verwenden Sie eine Hex-Taste, um den optischen Spiegel 1 (OM1) so einzustellen, dass das Stokes-Strahlzentrum das Durchgangsloch der Ausrichtungsplatte passiert und mit dem Pumpstrahl am Laserausgangsanschluss kolokalisiert. Verwenden Sie das IR-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P0 während der Einstellung zu bestätigen.
      HINWEIS: OM1 und OM2 sind zwei Spiegel im OPO-Kopf, um die Position des 1031 nm Stokes-Strahls einzustellen.
    17. Entfernen Sie die Ausrichtungsplatte P0 und verwenden Sie die Hex-Taste, um den OM2 so einzustellen, dass die Mitte des Stokes-Strahls mit dem Referenzzeichen des Pumpenstrahls auf der Kamera kolokalisiert wird.
    18. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.16 und 2.2.17, bis sich der Stokes-Strahl sowohl auf P0- als auch auf Kameraebene strikt mit dem Pumpenstrahl überlappt.
      HINWEIS: Bei der Visualisierung der Strahlpunkte auf der Kamera sollten alle Ausrichtungsplatten aus dem optischen Pfad entfernt werden.
  3. Optimierung der Bildgebungsbedingungen
    1. Führen Sie die Phaseneinstellung des Lock-in-Verstärkers wie in Schritt 2.3.2 beschrieben durch. bis 2.3.7.
      HINWEIS: Die SRS-Erkennung basiert auf einem hochfrequenten phasensensitiven Schema. Für die SRL-Detektion wird die Intensität des Stokes-Strahls mit 20 MHz moduliert und ein Lock-in-Verstärker wird verwendet, um das Signal zu demodulieren. Phase und Offset des Lock-in-Verstärkers müssen angepasst werden, um den optimalen Bildkontrast zu erreichen.
    2. Öffnen Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware.
    3. Stellen Sie die Wellenlänge des Pumplasers auf 796 nm und die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf 15 mW bzw. 25 mW auf der Probe ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie hier Olivenöl für die Optimierung und Kalibrierung der SRS-Bildgebung. Der Raman-Gipfel des Olivenöls in der Kohlenstoff-Wasserstoff-Region liegt bei 2863,5 cm-1, was der Wellenlänge des Pumpstrahls bei 796 nm entspricht.
    4. Verschließen Sie das Olivenöl in einem Objektträger und befestigen Sie ein gefaltetes Seidenpapier am Boden des Objektträgers, um die Signalrückstreuung für die Epi-SRS-Erkennung zu verbessern. Legen Sie die Olivenölprobe auf die Bühne und stellen Sie den Fokus des 25-fachen Objektivs auf die Probe ein.
    5. Verwenden Sie die Mikroskopsteuerungssoftware, um die Bildgebungsparameter wie folgt einzustellen: 512 x 512 Pixel für 500 μm x 500 μm Sichtfeld (FOV), 6,4 μs Pixelverweildauer. Verwenden Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware, um den Zeitkonstantenwert auf 10 μs einzustellen, was nahe an der Pixelverweilzeit liegt.
    6. Scannen Sie den Laserstrahl über die Probe. Verwenden Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware, um die Phase (0-180°) mit einer Schrittweite von 22,5° so lange abzustimmen, bis die SRS-Signalintensität das Maximum erreicht.
      HINWEIS: Bei diesem rein analogen Lock-in-Verstärker ist der Signalausgang die phasenabhängige Komponente, die von der Phase des Referenzsignals abhängig ist. Die Phase kann durch die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware mit einer Auflösung von 11 ° eingestellt werden, wodurch das erkannte Signal auf ~ 2% 12 maximiert werden kann. Der Lock-in-Verstärker gerät aus der Phase, sobald das Synchronisationssignal unterbrochen wird. Die Phase muss jedes Mal neu eingestellt werden, wenn das Synchronisationssignal wiederhergestellt wird.
    7. Scannen Sie die Probe mit geschlossenem Laserverschluss. Verwenden Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware, um den Offset-Wert mit einer Schrittweite von 1 mV so lange abzustimmen, bis das durchschnittliche SRS-Signal nahe Null liegt.
      HINWEIS: Das durchschnittliche SRS-Signal wird als die durchschnittliche Intensität aller Pixel im SRS-Bild geschätzt, die automatisch von der Mikroskopsteuerungssoftware berechnet wird. Offsets sind nützlich, um unerwünschte phasenkohärente Signale zu unterdrücken.
    8. Führen Sie die Optimierung der zeitlichen Synchronisierung wie in den Schritten 2.3.9 bis 2.3.14 beschrieben durch.
    9. Öffnen Sie den Dialog Delay Manager (Abbildung 2) in der OPO-Steuerungssoftware.
    10. Scannen Sie das Olivenöl und stimmen Sie die Verzögerungsstufe ab, bis das SRS-Signal des Olivenöls sein Maximum erreicht.
      HINWEIS: Zum ersten Mal der SRS-Bildgebung, wenn die Phase des Lock-in-Verstärkers nicht optimiert wurde, wird die zeitliche Synchronisation zunächst grob angepasst, um das SRS-Signal der Probe zu visualisieren, bevor die Phase des Lock-in-Verstärkers optimiert wird.
    11. Stoppen Sie das Scannen und klicken Sie im Dialogfeld des Verzögerungsmanagers auf die Schaltfläche Daten hinzufügen , um die aktuellen Verzögerungsdaten aufzuzeichnen.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 2.3. 10 und 2.3.11 für verschiedene chemische Proben bei unterschiedlichen Wellenlängen.
      HINWEIS: Polystyrolkügelchen, schweres Wasser, 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin, Glycerin werden verwendet, um die Verzögerungsdaten an verschiedenen Schwingungsbändern zu messen.
    13. Wählen Sie im Dialogfeld "Verzögerungsmanager" die Option "Datenanpassung und -reihenfolge" 5 aus, um die aktuellen Datenpunkte mit der polynomischen Funktion fünfter Ordnung abzugleichen. Wenden Sie die angepassten Daten an, indem Sie auf die Schaltfläche Als benutzerdefiniert verwenden klicken und das Kontrollkästchen aktivieren. Die Verzögerungsstufe wird bei verschiedenen Wellenlängen entsprechend der angepassten Verzögerungskurve automatisch angepasst.
    14. Speichern Sie alle Verzögerungsdaten in einer Textdatei, die für die zukünftige Verwendung geladen werden kann.

3. Chirurgische Vorbereitung der Maus für in vivo Fluoreszenz und SRS-Bildgebung

  1. Sterilisieren Sie alle erforderlichen Werkzeuge, einschließlich Skalpelle, Federschere, Pinzette, Deckgläser und Mullpads.
  2. Desinfizieren Sie alle Oberflächen, die während der Operation berührt würden, mit 70% Ethanol. Decken Sie den Arbeitsbereich der Tischplatte mit sterilen Vorhängen ab. Legen Sie ein Heizkissen unter den Vorhang.
  3. Verwenden Sie Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 transgene Mäuse, die Enhanced Yellow Fluorescence Protein (EYFP) in afferenten Neuronen der dorsalen Wurzelganglion für die In-vivo-Rückenmarksbildgebung exprimieren. Wiegen Sie die Maus und induzieren Sie eine Anästhesie durch intraperitoneale (i.p.) Injektion des Ketamin-Xylazin-Gemisches (87,5 mg kg-1 und 12,5 mg kg-1).
  4. Kneifen Sie den Zeh der Maus zusammen, um eine tiefe Anästhesie zu gewährleisten. Ergänzen Sie bei Bedarf mit der Hälfte der ursprünglichen Dosis der Anästhetika. Tragen Sie Salbe auf die Mausaugen auf, um Hornhauttrockenheit zu verhindern.
  5. Rasieren Sie die Haare auf dem Rücken über der Brustwirbelsäule und entfernen Sie dann die Haare vollständig mit Enthaarungscreme. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit Jodlösung.
  6. Machen Sie einen kleinen Mittellinienschnitt (~ 1,5 cm) der Haut über dem T11-T13-Wirbel mit einem Skalpell.
  7. Schneiden Sie Muskeln und Sehnen sowohl oben als auch an den Seiten des T11-T13-Wirbels mit Federschere und Pinzette ein. Belichten Sie die drei benachbarten Wirbel. Verwenden Sie sterile Mullbinden und sterile Kochsalzlösung, um Blutungen zu kontrollieren und die Operationsstelle zu reinigen.
  8. Stabilisieren Sie die Wirbelsäule mit Hilfe der beiden Edelstahl-Seitenstangen auf einer speziell entwickelten Stabilisierungsstufe (Abbildung 2B).
  9. Verwenden Sie eine # 2-Pinzette, um eine Laminektomie bei T12 durchzuführen. Verwenden Sie vorsichtig die Pinzette, um die Lamina Stück für Stück zu brechen, bis die gesamte Lamina des T12-Wirbels entfernt ist.
  10. Waschen Sie das Blut über dem Rückenmark mit steriler Kochsalzlösung ab und verwenden Sie das Mullkissen, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen. Üben Sie mit einem Stück Mullkissen Druck auf die Blutungsstelle aus, um die Blutung zu kontrollieren.
  11. Legen Sie ein Deckglas (22 x 22 mm) auf die Klemmstange und füllen Sie den Zwischenraum zwischen dem Deckglas und dem Rückenmark mit Kochsalzlösung.

4. In vivo TPEF-SRS-Bildgebung des Rückenmarks der Maus

  1. Montieren Sie die Stabilisierungsstufe auf einer fünfachsigen Stufe unter dem TPEF-SRS-Mikroskop.
    HINWEIS: Der Fünf-Achsen-Tisch ermöglicht eine dreiachsige Verschiebung und ±5°-Nick- und Rollbiegebewegung.
  2. Sichern Sie den Mauskopf mit zwei Kopfstangen und senken Sie die Halteplatte ab, um genügend Platz für Brustbewegungen während der Atmung zu bieten und Bewegungsartefakte zu lindern.
  3. Setzen Sie ein Heizkissen unter die Maus ein, um die Maus während der Bildgebung warm zu halten.
  4. Stellen Sie das z-Translationsstadium ein, um den Fokus so einzustellen, bis das Hellfeldbild der Rückenmarksvaskulatur unter einem 10-fachen Objektiv beobachtet werden kann.
  5. Lokalisieren Sie die Rückenmarksvene in der Mitte des FOV, indem Sie die zweiachsige Translationsstufe der fünfachsigen Stufe abstimmen.
  6. Stimmen Sie die Roll- und Nickwinkel der Fünf-Achsen-Stufe ab, um die Rückenmarksoberfläche senkrecht zur Objektivachse basierend auf dem Hellfeldbild anzupassen.
  7. Ersetzen Sie das 10x durch ein 25-faches Wassertauchobjektiv für die TPEF-SRS-Bildgebung.
  8. Stellen Sie die Wellenlänge des fs-Strahls auf 920 nm ein. Stellen Sie die fs-Strahlleistung auf 10 mW auf dem Sample ein.
  9. Stellen Sie die Wellenlänge des Pumpstrahls auf 796 nm ein. Passen Sie die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf 60 mW bzw. 75 mW an der Probe an.
    HINWEIS: Die Rückenmarks-SRS-Bildgebung wird bei der Wellenzahl von 2863,5 cm-1 durchgeführt, was dem Raman-Peak von Myelinscheiden im Kohlenstoff-Wasserstoff-Bereich entspricht, basierend auf den gemessenen SRS-Spektren7,9. Die Laserleistung wird bestimmt, um eine hochauflösende TPEF-SRS-Bildgebung des Rückenmarks zu gewährleisten. Gewebeschäden werden unter den derzeitigen bildgebenden Bedingungen nicht beobachtet.
  10. Wählen Sie für die SRS-Bildgebung PBS über dem Objektiv mit einem motorisierten Flipper aus, indem Sie die Switch-Taste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist.
  11. Stellen Sie die Bildgebungsparameter wie folgt ein: 512 x 512 Pixel für 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs Pixelverweilzeit, 2 μs Zeitkonstante.
  12. Beginnen Sie mit dem Scannen der Probe und legen Sie den Fokus auf die dorsale Oberfläche des Rückenmarks fest.
  13. Feinabstimmung der Verzögerungsstufe durch die OPO-Steuerungssoftware, bis das maximale SRS-Signal des Rückenmarks erreicht ist.
    HINWEIS: Biologische Proben können eine zusätzliche chromatische Dispersion induzieren, die Verzögerungsstufe muss möglicherweise angepasst werden, um die zeitliche Synchronisation zu optimieren. Wenn die SRS-Bildgebung jedoch in der Nähe der oberen Oberfläche des Gewebes durchgeführt wird, ist der zeitliche Unterschied zwischen den beiden Laserpulsen, die durch das biologische Gewebe und das Bildgebungsfenster eingeführt werden, in der Regel gering (weniger als mehrere hundert fs).
  14. Für die TPEF-Bildgebung wählen Sie den dichroitischen Spiegel D2 über dem Objektiv mit einem motorisierten Flipper , indem Sie die Switch-Taste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist.
  15. Legen Sie die Bildgebungsparameter fest und starten Sie das Scannen der Probe. Um den TPEF-SRS-Bildstapel zu erfassen, erfassen Sie die TPEF- und SRS-Bilder nacheinander mit einem Intervall von 1 s in der gleichen Tiefe, bevor Sie in die nächste Tiefe gehen. Die Bildgebungsparameter für die TPEF-Bildgebung sind 512 x 512 Pixel, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs Pixelverweildauer.
  16. Entfernen Sie das Tier aus der Stabilisierungsphase, nachdem alle Bilder gesammelt wurden.
  17. Reinigen Sie das freiliegende Gewebe, indem Sie Kochsalzlösung spülen und die überschüssige Flüssigkeit mit einem Mullkissen aufnehmen. Tragen Sie Silikongel auf das freiliegende Rückenmark auf und warten Sie ~ 5 Minuten, bis es geheilt ist.
  18. Nähen Sie die Haut mit #6-0 chirurgischer Naht, um die Wunde zu schließen. Tragen Sie Verbrennungscreme auf die Haut der Operationsstelle auf, um eine Infektion zu verhindern. Verabreichen Sie die analgetische Behandlung subkutan (0,1 mg/kg Buprenorphin).
  19. Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig und legen Sie den Käfig auf ein Heizkissen, bis sich die Maus vollständig von der Narkose erholt hat.
  20. Wiederholen Sie die analgetische Verabreichung alle 12 Stunden für 3 Tage nach der Operation.
  21. Schließen Sie den Verschluss von OPO und fs Laser. Stellen Sie die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf das Maximum ein.
    HINWEIS: Das Einstellen der maximalen Leistung vor dem Ausschalten des Lasers ist für die Laserwartung von Vorteil.
  22. Stellen Sie die Wellenlänge des Pumpstrahls und des fs-Lasers auf 800 nm ein.
  23. Stellen Sie die beiden Laser in den Standby-Modus, schließen Sie die gesamte Steuerungssoftware der Elektronik und schalten Sie alle zugehörigen Geräte aus.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die in vivo dual-modale Bildgebung von spinalen Axonen sowie Myelinscheiden wird mit den transgenen Thy1-YFPH-Mäusen durchgeführt, die EYFP in afferenten Neuronen des dorsalen Wurzelganglions exprimieren (Abbildung 3). Diese gekennzeichneten afferenten Neuronen leiten die sensorischen Informationen vom peripheren Nerv an das Rückenmark weiter, wobei sich der zentrale Ast in der Rückenmarksdorsalsäule befindet. Mit dem TPEF-SRS-Mikroskop können dicht verteilte Myelinhüllen mittels ma...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

In diesem Protokoll wird der grundlegende Aufbau des TPEF-SRS-Mikroskops ausführlich beschrieben. Für die SRS-Bildgebung sind die Pumpe und die Stokes-Strahlen innerhalb des OPO zeitlich und räumlich überlappt. Diese Überlappung kann jedoch nach dem Durchlaufen des Mikroskopsystems unterbrochen werden. Daher ist sowohl die räumliche als auch die zeitliche Optimierung der Kolokalisation der Pumpe und der Stokes-Träger notwendig und entscheidend, um eine optimale SRS-Bildgebung zu erreichen. Die zeitliche Verzögerung zwisc...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen und haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Hong Kong Research Grants Council durch Zuschüsse 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, der Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), dem Area of Excellence Scheme des University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) und der Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) durch den Zuschuss RPC10EG33 unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#2 PinzetteDumont11223-20Für Laminektomie
10X ObjektivNikonCFI Plan Apo Lambda 10X
25X ObjektivOlympusXLPLN25XSVMP2
Burn CremeBetadine
KameraSony& alpha; 6300
StromverstärkerStanford researchSR570
Strom-Photomultiplier-ModuleHamamatsuH11461-01
D2 665 nm dichroitischer LangpassspiegelSemrockFF665-Di02-25x36Zur Lenkung des Epi-Fluoreszenzsignals auf das Detektionsmodul
D3 700 nm dichroitischer KurzpassspiegelEdmund69-206Zur Trennung von SRS von TPEF Detektionsweg
EnthaarungscremeVeet
FS1 975 nm KurzpassfilterEdmund86-108Zum Blockieren des Strahls
FS1 BandpassfilterSemrockFF01-850/310Zum Blockieren des Strahls
Fs2 BandpassfilterSemrockFF01-525/50Zum Blockieren des YFP-Signals
Fs2 KurzpassfilterSemrockFF01-715/SP-25Zum Blockieren von fs-Anregungslaserstrahlen
HalbwellenplatteThorlabsSAHWP05M-1700
Hochgeschwindigkeits-PhotodetektorMenloSystemsFPD 310-FZum Überprüfen der Stokes-Strahlmodulation
Jod-Betadin
IR-OszilloskopFJWFIND-R-SCOPE Infrarot-Viewer 2X Kit Modell 84499C2X
IrisThorlabsCPA1
L1ThorlabsAC254-060-B-ML
L10ThorlabsLA4052-A
L2ThorlabsLA1422-B
L3ThorlabsAC254-050-B
L4ThorlabsAC254-060-B-ML
L7f=100 mm, AB-Beschichtung
L8ThorlabsLA4874-A
L9ThorlabsAC254-035-B-ML
Lock-in-VerstärkerAPE
SpiegelThorlabsPF10-03-P01
Motorisierter FlipperThorlabsMFF101/M
Multifunktionale ErfassungskarteNational InstrumentPCIe-6363
OszilloskopTektronixTDS2012C
FotodiodeAPEZur Detektion von SRS-Signalen
Pikosekunden-LaserquelleAPEpicoSmaragd
Polarisierender StrahlteilerThorlabsCCM1-PBS252/M
LeistungsmesserNewport843-R
SalineBraun
Scan-Objektiv L5ThorlabsSL50-CLS2
Scanning-SpiegelCambridge Technology6215H
SilikongelWorld Precision Inc.KWIK-SIL
Ti:Saphir fs LaserCoherentChamäleon Ultra II
Tubuslinse L6ThorlabsTTL200-S8

Referenzen

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711(1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283(2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012(2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005(2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894(2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715(2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501(2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109(2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008(2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084(2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530(2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691(2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

SRS MikroskopieTPEF BildgebungR ckenmarksbildgebungMyelinscheidedualmodale Mikroskopiesubzellul re Aufl sungneurodegenerativen Erkrankungen
Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.