Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Wanjie Wu; Xuesong Li; Jianan Y. Qu; Sicong He

doi:10.3791/63411

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Methodenartikel

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

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DOI:

10.3791/63411

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20. Dezember 2021

Wanjie Wu¹ , Xuesong Li¹ , Jianan Y. Qu¹^,²^,³^,⁴ , Sicong He⁵

¹Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, ²State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, ³Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, ⁴Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, ⁵Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ermöglicht eine markierungsfreie Abbildung des biologischen Gewebes in seiner natürlichen Mikroumgebung auf der Grundlage intrinsischer molekularer Schwingungen und ist somit ein perfektes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung biologischer Prozesse bei subzellulärer Auflösung. Durch die Integration der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzbildgebung (TPEF) in das SRS-Mikroskop kann die dual-modale In-vivo-Bildgebung von Geweben kritische biochemische und biophysikalische Informationen aus mehreren Perspektiven erfassen, die helfen, die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau usw. beteiligt sind. In diesem Videoprotokoll wird der Aufbau eines TPEF-SRS-Mikroskopsystems sowie das in vivo bildgebende Verfahren des tierischen Rückenmarks vorgestellt. Das Rückenmark spielt als Teil des zentralen Nervensystems eine entscheidende Rolle bei der Kommunikation zwischen dem Gehirn und dem peripheren Nervensystem. Myelinscheide, die reich an Phospholipiden ist, umgibt und isoliert das Axon, um eine salzige Leitung von Aktionspotentialen zu ermöglichen. Die In-vivo-Bildgebung von Myelinscheiden im Rückenmark ist wichtig, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt auch die Tierpräparation und in vivo TPEF-SRS-Bildgebungsverfahren zur Aufnahme hochauflösender biologischer Bilder.

Einleitung

Die Raman-Mikroskopie1,2 entwickelt sich zu einer leistungsstarken markierungsfreien Methode^, um biologisches Gewebe basierend auf den charakteristischen Frequenzen verschiedener chemischer Bindungen in Biomolekülen abzubilden. Aufgrund ihrer nicht-invasiven und gut adaptiven Bildgebungsfähigkeit wurde die Raman-Mikroskopie häufig für die Bildgebung von lipidangereicherten Komponenten in biologischen Geweben wie Myelinscheide3,4,5, Adipozyten6,7 und Lipidtröpfchen eingesetzt8,9,10 ....