Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

Zusammenfassung

Ein umfassendes Laborprotokoll und ein Analyse-Workflow werden für einen schnellen, kostengünstigen und unkomplizierten kolorimetrischen zellbasierten Assay zur Erkennung neutralisierender Elemente gegen AAV6 beschrieben.

Zusammenfassung

Rekombinante Adeno-assoziierte Viren (rAAV) haben sich als sicherer und erfolgreicher Vektor für die Übertragung von genetischem Material zur Behandlung verschiedener Gesundheitszustände sowohl im Labor als auch in der Klinik erwiesen. Bereits vorhandene neutralisierende Antikörper (NAbs) gegen AAV-Kapside stellen jedoch eine ständige Herausforderung für die erfolgreiche Verabreichung von Gentherapien sowohl in experimentellen Großtiermodellen als auch in menschlichen Populationen dar. Ein vorläufiges Screening auf Wirtsimmunität gegen AAV ist notwendig, um die Wirksamkeit von AAV-basierten Gentherapien sowohl als Forschungsinstrument als auch als klinisch tragfähiges Therapeutikum sicherzustellen. Dieses Protokoll beschreibt einen kolorimetrischen In-vitro-Assay zum Nachweis neutralisierender Faktoren gegen AAV-Serotyp 6 (AAV6). Der Assay nutzt die Reaktion zwischen einem AAV, das für ein alkalisches Phosphatase (AP)-Reportergen kodiert, und seinem Substrat NBT/BCIP, das bei kombination eine unlösliche quantifizierbare violette Färbung erzeugt.

In diesem Protokoll werden Serumproben mit einem AAV-exprimierenden AP kombiniert und inkubiert, um eine mögliche neutralisierende Aktivität zu ermöglichen. Die Virusserummischung wird anschließend den Zellen zugesetzt, um die virale Transduktion von AAVs zu ermöglichen, die nicht neutralisiert wurden. Das NBT/BCIP-Substrat wird zugegeben und durchläuft eine chromogene Reaktion, die der viralen Transduktion und neutralisierenden Aktivität entspricht. Der Anteil der farbigen Fläche wird mit einem kostenlosen Software-Tool quantifiziert, um neutralisierende Titer zu generieren. Dieser Assay zeigt eine starke positive Korrelation zwischen Färbung und Viruskonzentration. Die Beurteilung von Serumproben von Schafen vor und nach verabreichung eines rekombinanten AAV6 führte zu einem dramatischen Anstieg der neutralisierenden Aktivität (125 bis >10.000-fache Zunahme). Der Assay zeigte eine ausreichende Sensitivität, um neutralisierende Aktivität in >1:32.000 Serumverdünnungen nachzuweisen. Dieser Assay bietet eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis von NAbs gegen AAVs.

Einleitung

Adeno-assoziierte Viren (AAV) werden zunehmend als Vektoren für die Verabreichung von Gentherapien zur Erprobung von Behandlungen für verschiedene Gesundheitszustände verwendet, die sich auf das Herz-Kreislauf-, Kreislauf-, Augen- und Zentralnervensystem auswirken1,2,3,4,5. Die Beliebtheit von AAV-Vektoren als führende Gentherapieplattform beruht auf ihrem positiven Sicherheitsprofil, ihrer langfristigen Transgenexpression und ihren weitreichenden gewebespezifischen ^{Tropismen1,6....}

Protokoll

Alle Aspekte der Tierpflege und -experimente wurden gemäß den Richtlinien des Florey Institute of Neuroscience and Mental Health und dem Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes gemäß ^Reference25 durchgeführt. Für die Studie wurden 1,5-3-jährige Merinoschafe verwendet. Eine schematische Übersicht über das Assay-Protokoll finden Sie in Abbildung 1.

Ergebnisse

Transduktionsassay zur Bestimmung der optimalen Virusdosis für die Plattenabdeckung
HT1080-Zellen, eine etablierte Fibrosarkom-Zelllinie, wurden für diesen Assay ausgewählt. Eine Konzentration von 1 x ¹⁰⁴ HT1080-Zellen/Well lieferte ~50% Zellkonfluenz in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. Um die optimale Viruskonzentration für den Assay zu bestimmen, wurde ein rAAV, das für ein hPLAP(human placental alkaline phosphatase) Reportergen (AAV6-hPLAP)³¹ kodiert, in dre.......

Diskussion

Dieser Bericht beschreibt einen kolorimetrischen Assay, der das Ausmaß der AAV-Neutralisation in einer bestimmten Serumprobe bewertet, indem er eine chromogene Reaktion bewertet, die dem Grad der in vitro viralen Transduktion entspricht. Die Entwicklung des Protokolls basierte auf der bekannten chromogenen Reaktion zwischen dem Enzym alkalische Phosphatase und NBT/BCIP, die weithin als Färbewerkzeug für den Nachweis von Proteintargets in Anwendungen wie der Immunhistochemie und als Reporterwerkzeug zur Bewertung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin/EDTA	Gibco	25300-054
konisches Zentrifugenröhrchen mit 50 mL	Falcon	14-432-22	oder gleichwertig
75 cm2 quadratische Kolben	Falcon	353136	Oder gleichwertige
96-Well-Platte mit flachem Boden	Falcon	353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector			Muskelforschung & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australien) AAV6-CMV-hPLAP kann auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden.
Aluminiumfolie
Monoklonaler Anti-AAV6-Antikörper (intakte Partikel) für die Maus, (ADK6)	PROGEN	610159	Monoklonaler Antikörper mit Positivkontrolle
BCIP/NBT	SIGMAFAST	B5655
			Zell- und Gewebekulturen
Elektronische Pipette			5 & 10 mL Stripetteneinsätze
Fötales Rinderserum	Gibco	10099-141
Hämozytometer
High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965118
HT1080 Zellen	ATCC
ImageJ Software			Frei verfügbar: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Inkubator			37°; C, 5% CO2
Lichtmikroskop mit Kamera			Kann Fotos mit einem 4-fach-Objektiv aufnehmen
Ofen			Für ein 65 &/; C Inkubation
Paraformaldehyd	MERCK	30525-89-4
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
Pipetten und Spitzen			20 μ L, 200 μ L & 1 mL Einzelpipetten und -spitzen & 200 μ L Mehrkanalpipette
Stericup Schnellwechselfilter	Millipore	S2GPU10RE	Wird zum Kombinieren von Medienreagenzien
verwendet Trypanblau-Lösung	Sigma-Aldrich	T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Gerinnselaktivator	Greiner BIO-ONE 455071		Wird für die Serumgewinnung und -verarbeitung von Schafen
verwendet Wasserbad