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Methodenartikel

Direktkontakt-Co-Kultur von Astrozyten und Glioblastomzellen, die mit Polyelektrolyt-Multilayer-Templates strukturiert wurden

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DOI:

10.3791/63420

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22. Juni 2022

 , 
1Complex Biosystems Graduate Program, University of Nebraska, Lincoln, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, Lincoln, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center, 5Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, Lincoln, 6Nebraska Center for the Prevention of Obesity Diseases, University of Nebraska, Lincoln, 7Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska, Lincoln, 8Mary and Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine gemusterte Gliom-Astrozyten-Kokultur mit direktem Kontakt, bei der Mikrokontaktdruck auf Polyelektrolyt-Multischichten (PEMs) verwendet wird, um U87- oder A172-GBM-Zellen und primäre Astrozyten zu strukturieren.

Zusammenfassung

Das Glioblastoma Multiforme (GBM) ist der häufigste und tödlichste bösartige Hirntumor. In den Vereinigten Staaten werden in den Jahren 2020 und 2021 mehr als 13.000 Fälle prognostiziert. GBM-Tumoren entstehen am häufigsten aus Astrozyten und zeichnen sich durch ihre invasive Natur aus, bei der oft gesundes Gewebe in das Tumorgewebe rekrutiert wird. Das Verständnis der Kommunikation zwischen Astrozyten und Glioblastomzellen ist für das molekulare Verständnis der Tumorprogression von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige gemusterte Co-Kultur-Methode zur Untersuchung der kontaktvermittelten Effekte von Astrozyten auf GBM unter Verwendung von Schicht-für-Schicht-Assemblierung und Mikrokapillarkraft-getriebener Strukturierung. Zu den Vorteilen gehören eine proteinfreie Zellkulturumgebung und eine präzise Kontrolle der zellulären Interaktion, die durch die Abmessungen des Musters vorgegeben wird. Diese Technik bietet ein vielseitiges, wirtschaftliches und reproduzierbares Protokoll zur Nachahmung der zellulären Interaktion zwischen Gliomen und Astrozyten in Gliomtumoren. Dieses Modell kann weiterhin verwendet werden, um Veränderungen in der GBM-Molekularbiologie aufgrund des physikalischen Kontakts mit Astrozyten oder der berührungslosen Kommunikation mit löslichen Cofaktoren zu entschlüsseln.

Einleitung

Das Glioblastoma Multiforme (GBM) ist mit einer medianen Überlebenszeit von etwa 15 Monaten der häufigste und tödlichste Hirntumor in den Vereinigten Staaten1. Weniger als 7 % der GBM-Patienten überleben mehr als 5 Jahre nach der Diagnose 1,2. Nach 10 Jahren sinkt diese Zahl auf weniger als 1 %1,2. Obwohl andere Krebsarten in den letzten Jahrzehnten das Überleben deutlich verbessert haben, bleibt der Erfolg von GBM-Patienten hinter den Erwartungen zurück. Um erfolgreiche therapeutische Interventionen zu entwickeln, muss ein geeignetes in situ-Modell verwendet werden, um ein tieferes Verständnis der GBM-Tumorbiologie zu entwickeln. Dieses Verständnis ist entscheidend für die Verbesserung der klinischen Ergebnisse für GBM-Patienten.

Das Gehirn enthält eine große Vielfalt an Zelltypen, von denen jeder bestimmte Nischen füllt, um die Funktion und das Überleben des Organismus zu fördern. Neben Neuronen gibt es eine Vielzahl von Gliazellen, darunter Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia. Insbesondere Astrozyten wurden durch die Sekretion von pro-migratorischen löslichen Faktoren mit dem Wachstum und der Invasion von GBM-Tumoren in Verbindung gebracht3. Darüber hinaus gibt es einige Berichte, dass physischer Kontakt die treibende Kraft für die Migration und Invasion von Astrozyten-vermittelten Gliomzellen ist 4,5. Die molekularen Grundlagen, die diesen Wandel antreiben, sind jedoch weitgehend unbekannt.

Um die kontaktvermittelten Effekte von Astrozyten auf das Tumorwachstum zu untersuchen, wird in diesem Protokoll über die Entwicklung einer reproduzierbaren, proteinfreien Methode zur in vitro Zellmusterung berichtet. Bei dieser Methode werden Polyelektrolyt-Multischichten (PEMs) systematisch zu einer einheitlichen proteinfreien Oberfläche zusammengefügt. PEMs werden unter Verwendung eines Polykationen-Polyanionen-Systems hergestellt, das Poly(diallylmethylammoniumchlorid) (PDAC) bzw. sulfoniertes Poly(steren) (SPS) umfasst. Diese Polymere wurden auf der Grundlage früherer Studien ausgewählt, die über eine bevorzugte Bindung von Zellen an SPS gegenüber PDACberichteten 6,7,8,9,10. Auf diesen PEM-Oberflächen verwendet dieses Protokoll die Mikrokapillarkraftlithographie, um gemusterte Co-Kulturmodelle von primären Astrozyten und GBM-Zellen zu entwickeln.

Die hierin vorgestellten Techniken ermöglichen die präzise Gestaltung spezifischer Zell-Zell-Wechselwirkungen durch die Kontrolle der Oberflächenstrukturierung, wodurch die hochgradig reproduzierbare Untersuchung der zellulären Kommunikation unterstützt wird. Darüber hinaus ermöglicht die biomimetische Oberfläche dieser Plattform die Untersuchung der direkten Zell-Zell-Kommunikation, die für die Vertiefung des mechanistischen Verständnisses der Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus ist die Methode kostengünstig und bietet einen erheblichen Vorteil für die Durchführung von In-vitro-Studien zur Erforschung der zellulären Kommunikation. Insbesondere nutzt dieses Protokoll die differentielle Bindung von GBM an SPS (-) über PDAC (+), um gemusterte Co-Kulturen von GBM-Zelllinien und primären Astrozyten zu erzeugen.

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Protokoll

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Committee on the Ethics of Animal Experiments der University of Nebraska-Lincoln genehmigt (Projekt-ID: 1046). Primäre Astrozyten wurden von 1-3 Tage alten Sprague-Dawley-Rattenbabys in Übereinstimmung mit dem IACUC-Protokoll 1046 der UNL und gemäß dem Protokoll mitleichten Modifikationen 7,11 hergestellt.

1. Vorbereitungen

  1. Rufen Sie ein Master-Muster der gewünschten Geometrie ab, bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen.
    HINWEIS: In diesem Protokoll werden kommerziell erhältliche Siliziumwafer verwendet, die mit Standard-Photolithographietechniken hergestellt wurden. Das empfohlene Ausgangsmuster sind 100-200 μm Linien.
  2. Bereiten Sie Puffer und Medien vor.
    1. Bereiten Sie Poly(diallylmethylammoniumchlorid) (PDAC) und sulfonierte Poly(steren) (SPS)-Polymerlösungen vor, um die Platten zu beschichten.
      1. Die PDAC-Beschichtungslösung besteht aus 0,3 Gew.-% PDAC und 0,1 M NaCl in ddH2O.
      2. Die SPS-Beschichtungslösung besteht aus 30 μM SPS und 0,1 M NaCl in ddH2O.
        HINWEIS: 1 l PDAC-Beschichtungslösung und 1 l SPS-Beschichtungslösung reichen aus, um sechs 6-Well-Platten zu beschichten. Lösungen können 2-5 Mal wiederverwendet werden. Tauschen Sie die Lösungen aus, wenn sie trüb werden.
    2. Bereiten Sie bei Bedarf Standard-Zellkulturmedien vor.
      1. Typische Astrozyten- und GBM-Medien sind 10 % fötales Rinderserum (FBS) bzw. 1 % Penicillin-Streptomycin in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM).
  3. Gewinnen, vorbereiten oder auftauen Zellen.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wird für primäre Ratten-Astrozyten beschrieben, die aus 1-3 Tage alten neugeborenen Ratten und U87MG- oder A172-MG-Gliomzellen isoliert wurden. Dieses Protokoll kann auf ähnliche Zelllinien ausgeweitet werden, nachdem die differentielle Bindung von Zelllinien von Interesse auf Polymeroberflächen bestätigt wurde.
    1. Aufgrund von Zellverlust während der Färbung sollten mindestens 200.000 GBM-Zellen an Tag 0 und 400.000 lebende primäre Ratten-Astrozyten an Tag 1 pro Well in einer 6-Well-Platte verwendet werden. Passen Sie die Zellnummern an, wenn Sie eine andere Vertiefungsgröße oder Platte verwenden.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll werden primäre Astrozyten aus den Passagen 2-4 empfohlen, die wie von Wilson und Mitarbeitern12 beschrieben vorbereitet wurden. Gliomzellen wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).

2. Stanzformen von Polydimethylsiloxan (PDMS)

  1. Wiegen Sie in einem Einwegbehälter 12 Teile (nach Gewicht) PDMS-Prepolymer und 1 Teil (nach Gewicht) Härter. 2-4 Minuten kräftig mixen, bis die gesamte Mischung mit Blasen gefüllt ist.
    HINWEIS: 26 g der Mischung reichen für eine 100 mm Petrischale.
  2. Geben Sie Fluorsilan in den Fluorsilan-Exsikkator. Stellen Sie den Einwegbehälter mit der Polymermischung in den Exsikkator, um ihn 20 Minuten lang zu entgasen.
    HINWEIS: Dadurch können Blasen aus der Mischung aufsteigen. Es kann mehr Zeit benötigt werden, wenn nach 20 Minuten immer noch große Blasen vorhanden sind.
  3. Legen Sie den vorgemusterten Strukturmaster in eine Petrischale. Gießen Sie die PDMS-Mischung langsam in die Petrischale über dem vorgemusterten Strukturmaster, wobei Sie darauf achten, dass der Master vollständig bedeckt ist. Die optimale Tiefe der PDMS-Schicht beträgt ca. 2-3 mm Dicke.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, indem Sie die Mischung langsam einfüllen. Stellen Sie sicher, dass der Silikonmaster flach in der Petrischale liegt.
  4. Bewahren Sie die Petrischale im Fluorsilkan-Exsikkator auf, bis alle Blasen entfernt sind. Die Petrischale im Backofen bei 60 °C 1 h aushärten. Wenn 60 °C nicht zur Verfügung stehen, härten Sie die Petrischale über Nacht bei 37 °C aus.
  5. Schneiden Sie mit einem scharfen Skalpell gleichmäßig und sanft um den Master herum.
    VORSICHT: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie ein Skalpell verwenden. Lassen Sie die freiliegende Klinge niemals unbeaufsichtigt. Skalpelle sind scharf. Treffen Sie geeignete Sicherheitsvorkehrungen, um Verletzungen zu vermeiden.
  6. Entfernen Sie den Stempel mit einer Pinzette und legen Sie ihn auf eine Schneidefläche, z. B. ein Schneidebrett. Schneiden Sie die Stempel mit einem Skalpell so klein aus, dass sie in 6-Well-Platten (ca. 2,5 cm x 2,5 cm) passen.

3. Aufbau von Polyelektrolyt-Multilayern (PEMs)

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Plasmabeschichtung mit einem angeschlossenen Sauerstoffdruckbehälter und Gasmischzubehör (siehe Materialtabelle). Jede Methode zur gleichmäßigen Plasmareinigung der Oberfläche aus Gewebekulturpolystyrol (TCPS) ist geeignet. Zeit und Intensität müssen möglicherweise vom Benutzer optimiert werden, wenn eine andere Plasmareinigungsmethode verwendet wird.

  1. Reinigen Sie eine 6-Well-Platte 7 Minuten lang mit Plasma.
    1. Entlüften Sie die Kammer, indem Sie das Dreiwegeventil an der Vorderseite der Tür nach rechts drehen, bis das Zischen des Luftaustritts zu hören ist. Drehen Sie das Dreiwegeventil wieder in die vertikale Position, sobald der Druckwert über 1800 mTorr liegt.
    2. Öffnen Sie die Tür und setzen Sie die 6-Well-Platte in die Kammer ein. Schließen Sie die Tür und schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Die Kammer wird evakuiert, bis der Druck bei etwa 100 mTorr stabil ist.
      HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass der Sauerstofftank geöffnet ist und der Ausgangsdruck des Sauerstoffs 10 psi beträgt, während die Kammer evakuiert wird.
    3. Öffnen Sie das Dreiwegeventil nach links, um die Leitung mit dem Sauerstoffzufuhrschlauch auszurichten. Lassen Sie das Sauerstoffgas in die Kammer entweichen, bis sich der Druck zwischen 400 und 450 mTorr stabilisiert hat.
      HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass der Eingangsdruck am Durchflussmesser 10 mm beträgt, und passen Sie ihn bei Bedarf an.
    4. Schalten Sie die HF-Stromversorgung ein. Warten Sie, bis sich das Plasma gebildet hat (~15 s), und starten Sie dann den Timer für 7 Minuten.
    5. Schalten Sie nach 7 Minuten die HF-Stromversorgung aus und drehen Sie das Dreiwegeventil wieder in seine vertikale Position. Lassen Sie die Kammer auf 150 mTorr evakuieren.
    6. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus und warten Sie, bis der Druck auf 1500 mTorr ansteigt. Entlüften Sie die Kammer, indem Sie das Dreiwegeventil nach rechts drehen, bis das Zischen des Luftauslasses zu hören ist. Wenn der Druckwert über 1800 mTorr liegt, drehen Sie das Dreiwegeventil wieder in seine vertikale Position, öffnen Sie die Tür und entnehmen Sie die Probe.
  2. Legen Sie plasmabeschichtete Platten wie folgt in Bäder mit Raumtemperatur: PDAC für 20 min, DI-Wasser für 5 min, DI-Wasser für 5 min, SPS für 20 min, DI-Wasser für 5 min und DI-Wasser für 5 min. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Plattenoberfläche untergetaucht ist.
    HINWEIS: Optional kann ein automatisierter Objektträgerfärbeer verwendet werden, um die aktive Zeit zu verkürzen. Falls verfügbar, leichtes Rühren verwenden.
  3. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt insgesamt 10 Mal. Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.
    HINWEIS: Die getrockneten Platten können vor der Verwendung bis zu mehreren Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.

4. PEM-Strukturierung durch Mikrospritzen in Kapillaren

  1. Waschen Sie die PDMS-Stempel mit milder Laborseife, gefolgt von DI-Wasser. Trocknen Sie die Stempel mit einem Luftkompressor und legen Sie sie auf eine ebene, bewegliche Fläche, z. B. einen unbenutzten 6-Well-Plattendeckel.
    OPTIONAL: Die Stempel können auch luftgetrocknet werden. Die Stempel müssen abgedeckt und während des Trocknens vor Staub geschützt werden.
  2. Beschichten Sie die Stempel, wie in Schritt 3 beschrieben, 1 Minute lang mit Plasma. Entfernen Sie umgehend die Stempel aus dem Plasmareiniger und legen Sie sie mit der Vorderseite nach unten auf die vorbereiteten 6-Well-Platten.
  3. Pipettieren Sie 10 μl PDAC-Lösung entlang der Unterkante des Stempels und dosieren Sie das Polymer gleichmäßig über die gesamte Länge des Stempels. Stellen Sie sicher, dass Sie das Polymer an der Seite des Stempels mit Öffnungen aus den Linienmustern hinzufügen, damit die Kapillarwirkung stattfinden kann.
  4. Lege ein 350 g schweres Gewicht für 20 s auf jeden Stempel, um das Muster zu verstärken. Lassen Sie die Stempel 20 Minuten auf den Platten ruhen.
  5. Tauchen Sie die Platte in DI-Wasser und ziehen Sie die Stempel in Richtung der Linienmuster ab. Waschen Sie den Teller zweimal für jeweils 5 min in DI-Wasser.
  6. Waschen Sie die Stempel mit Seife und DI-Wasser und trocknen Sie sie mit einem Luftkompressor. Lassen Sie die Platte an der Luft trocknen.
  7. Wenn die Platten für die Zellkultur bereit sind, sterilisieren Sie sie unmittelbar vor der Verwendung mindestens 8 Stunden lang unter UV-Licht in einer Biosicherheitshaube der Klasse II. Die empfohlene minimale UV-C-Gesamtdosis beträgt 400 mJ/cm2 bei 265 nm. Wenn Sie Muster visualisieren, überspringen Sie den Schritt der UV-Sterilisation und führen Sie Schritt 5 aus. Wenn Sie für die Zellkultur bereit sind, führen Sie Schritt 6 nach der UV-Sterilisation durch.

5. Visualisierung von Stanzmustern mit Carboxyfluorescein (CFSE)

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren aus, um gestanzte Muster zu visualisieren, oder überspringen Sie diesen Schritt und bereiten Sie stattdessen Muster für die Zellkultur vor. Sobald die Muster gefärbt sind, können sie nicht mehr für die Zellkultur verwendet werden. Sobald genügend Vertrauen in die Prägung gewonnen ist, können die Muster für die Zellkultur verwendet werden. Carboxyfluorescein ist lichtempfindlich. Färben und Transportieren im Dunkeln.

  1. Getrocknete, gestanzte Modelle für 60-90 min in CFSE-Musterfärbelösung (0,1 μM CFSE in 0,1 M NaOH) legen. Die gestanzten Muster zweimal 5 min in DI H2O waschen.
    HINWEIS: Wenn Sie Objektträger aus Glas verwenden, legen Sie den gesamten Objektträger in ein 50-ml-Röhrchen, das die Färbelösung enthält. Wenn Sie Vertiefungsplatten verwenden, fügen Sie genügend Färbelösung hinzu, um das gesamte Muster zu bedecken.
  2. Visualisieren Sie Muster mit einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop.
    1. Schalten Sie die Leuchtstofflampe ein, damit sie sich 10 Minuten lang aufwärmen kann. Da Muster mit CFSE gefärbt sind, verwenden Sie den Interferenzblaufilter (IB), um die grünen Muster zu visualisieren. Sehen Sie sich die Muster an und machen Sie Fotos.

6. Färben und Aussäen von Glioblastomzellen mit Carboxyfluorescein

HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten sollten in einer geeigneten Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchgeführt werden.

  1. Die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA von der Kulturoberfläche lösen, bei 200 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Zellkulturmedium ohne Serum (DMEM und 1 % Penicillin-Streptomycin), zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
  3. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS und überführen Sie sie in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie 10 μl 10 μg/ml CFSE hinzu und mischen Sie sofort gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführen.
  4. Mindestens 1 ml Zellkulturmedium (siehe Schritt 1.2.2.1) zugeben, um die CFSE-Farbstoffreaktion abzuschrecken. Bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Zellkulturmedium und geben Sie sie in ein frisches steriles 15-ml-Röhrchen.
  5. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Zellkulturmedium.
  6. Wiederholen Sie den vorherigen Waschschritt zweimal.
  7. Aussaat der gefärbten Gliomzellen (100 Zellen/mm,2 oder 100.000 Zellen/Well) in der gemusterten 6-Well-Gewebekulturplatte aus Schritt 4 mit Astrozyten-Kulturmedien. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) für 24 h, bevor Sie in Schritt 7 gefärbte Astrozyten hinzufügen.

7. Färben und Aussäen von primären Astrozyten mit PKH26

HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten sollten in einer geeigneten Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchgeführt werden.

  1. Die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA von der Kulturoberfläche lösen, bei 200 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Zellkulturmedium ohne Serum (DMEM und 1 % Penicillin-Streptomycin), zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
  3. Bereiten Sie eine 2x Zellsuspension vor, indem Sie das Zellpellet in 0,5 ml Diluent C bei Raumtemperatur aus dem PKH26-Kit resuspendieren.
  4. Bereiten Sie eine 2x Farbstofflösung (4 x 10-6 M) vor, indem Sie 2 μl PKH26 zu 0,5 mL Diluent C in einem sterilen 1,5 mL Röhrchen hinzufügen. Bereiten Sie die Färbelösung direkt vor Gebrauch vor.
  5. 2x Zellsuspension in 2x Farbstofflösung geben und sofort durch Auf- und Abpipettieren mischen.
  6. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 1-5 Minuten.
    HINWEIS: Die Färbung erfolgt schnell und Verdünnungsmittel C ist schädlich für die Zellen. Eine längere Inkubation bedeutet nicht eine bessere Färbung.
  7. Quenden Sie die Färbung ab, indem Sie mindestens das 5-fache Volumen des Zellkulturmediums hinzufügen und 1 Minute lang inkubieren, um den überschüssigen Farbstoff zu binden.
  8. Bei 200 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Zellkulturmedium und überführen Sie sie in ein neues steriles 15-ml-Röhrchen.
  9. Bei 200 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen und in 5 mL PBS resuspendieren.
  10. Bei 200 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen und in 5 mL Zellkulturmedium resuspendieren.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 7.9 und 7.10 für insgesamt drei Wäschen.
  12. Die gefärbten Astrozyten (200 Zellen/mm,2 oder 200.000 Zellen/Well) werden mit Astrozytenmedium (siehe Schritt 1.2.2.1) in die gemusterte 6-Well-Gewebekulturplatte ausgesät, die mit Gliomzellen aus Schritt 6 besiedelt ist. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 °C, 5% CO2 -Inkubator für die Zeit, in der die Experimente durchgeführt werden.

8. Fluoreszenzbildgebung von gemusterten Monokulturen und Cokulturen

  1. Schalten Sie die Leuchtstofflampe ein, damit sie sich 10 Minuten lang aufwärmen kann.
  2. Nehmen Sie die Zellkultur aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf den Tisch eines inversen Mikroskops, das Fluoreszenzbildgebung ermöglicht.
  3. Setzen Sie den entsprechenden Filter ein oder setzen Sie ihn auf. Wenn die abzubildenden Zellen mit CFSE gefärbt sind, verwenden Sie den Interferenzblaufilter (IB), um die grünen Zellen sichtbar zu machen. Wenn die abzubildenden Zellen mit PKH26 gefärbt sind, verwenden Sie einen Rhodaminfilter, um die roten Blutkörperchen sichtbar zu machen.
  4. Betrachten Sie das Exemplar und machen Sie Fotos.
    HINWEIS: Die Zellen können nun mittels Durchflusszytometrie getrennt werden, um die biologischen Auswirkungen der kontaktvermittelten Kommunikation zu analysieren.

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Ergebnisse

Das Protokoll beschreibt hier die Entwicklung der direkten Kontaktmuster-Co-Kultur von Gliomzellen und Astrozyten. Diese Plattform bietet ein biomimetisches multizelluläres Modell, um die Rolle des direkten Kontakts in der Kommunikation zwischen Astrozyten und Gliomzellen bei der Progression des Glioblastoma multiforme (GBM) zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt ein Schema der oben beschriebenen schrittweisen Oberflächenmodifikation und zellulären Einführung. Der erste Schritt besteht darin, ein...

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Diskussion

Zu den entscheidenden Schritten, um den erfolgreichen Aufbau einer reproduzierbaren gemusterten Co-Kultur zu gewährleisten, gehören: 1) die erfolgreiche Strukturierung der Oberfläche durch Mikrospritzen in Kapillaren, 2) das erfolgreiche Waschen der gefärbten Zellen und 3) die Analyse der Co-Kultur im Fenster der "reifen Kultur". Erstens ist die erfolgreiche Reproduktion von Mustern mit Mikroformung in Kapillaren entscheidend für die Reproduzierbarkeit der Interaktion, da dies die gemust...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde ganz oder teilweise durch die NIH-Zuschüsse 1R01AA027189-01A1 (an S.K.), P20 GM104320 (an das Nebraska Center for the Prevention of Obesity Diseases Pilot Grant an S.K.), P20 GM113126 (an das Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication-Projektleiter S.K.); UNL Office of Research and Development Biomedical Seed Grant und Nebraska Research Initiative-Systems Grant (an S.K.). K.M.S. wurde durch T32GM107001, ein Ausbildungsstipendium, finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTAFisher Scientific25200056
15 ml Nunc Konische sterile Polypropylen-ZentrifugenröhrchenFisher Scientific12-565-268
5(6)-Carboxyfluoresceindiacetat N-SuccinimidylesterMillipore SigmaCat#21888
50 ml Nunc Konische sterile Polypropylen-ZentrifugenröhrchenFisher Scientific12-565-270
A172-MG GBM ZelllinieATCCCRL-1620
Bright-Line HämazytometerSigmaZ359629 Oder ein anderes geeignetes Zellzählgerät
ZellinkubatorN/AN/A
Gekühlte Tischzentrifuge für 15 mL RöhrchenN/AN/A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)MP BiomedicalsICN 1033120
Erweiterter PlasmareinigerPlasma HarrickPDC-001-HPMit angeschlossenem Sauerstoffdrucktank und PlasmaFlo Gasmischer (PDC-FMG) Zubehör
Fötales Rinderserum (FBS)Atlanta BiologicalsS11550H
FluorsilanSigma Aldrich667420Vollständiger chemischer Name: 1H,1H,2H,2H-Perfluoroctyltriethoxysilan
Inverses TischmikroskopN/AN/A-Mikroskopfür Fluoreszenzbildgebung mit λ ex = 551 nm; λ em 567 nm [z.B. Rhodamin-Filter] (PKH26-Farbstoff) und λ ex 492 nm; λ em 517 nm [z.B. Interferenzblaufilter (IB)] (CFSE-Farbstoff)
NaClSigma AldrichS7653
NaOHSigma Aldrich567530
Penicillin-StreptomicenFisher Scientific15140122
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini KitMillipore SigmaCat#MINI26-1KT
Poly(dialyldimethylammoniumchlorid) lösung (PDAC)Sigma Aldrich40901420 Gew.-% in H2O
Poly(sodium 4-styrolesulfonat) (SPS)Sigma Aldrich243051durchschnittlich ~70.000
primäre Astrozyten, isoliert aus Srague Dawley RattenCharles RiverCrl:SDRatten aus Charles River; Laborisolierte Zellen
SkalpellN/AN/A
NatriumbicarbonatSigma AldrichS5761
Sylgard 184 Silikonelastomer KitDow ChemicalCat#2646340
Trypan Blue StainFisher Scientific15-250-061
TryplEFisher ScientificGibco TrypLE
U87-MG GBM ZelllinieATCCHTB-14
Vakuum-ExsikkatorN/AN/A

Referenzen

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