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Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

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DOI:

10.3791/63425

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2. Februar 2022

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1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

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Zusammenfassung

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Zusammenfassung

Die mitotischen bipolaren Kinesin-5-Motoren erfüllen wesentliche Funktionen in der Spindeldynamik. Diese Motoren weisen eine homotetramere Struktur mit zwei Paaren katalytischer motorischer Domänen auf, die sich an gegenüberliegenden Enden des aktiven Komplexes befinden. Diese einzigartige Architektur ermöglicht es Kinesin-5-Motoren, antiparallele Spindelmikrotubuli (MTs) zu vernetzen und auseinander zu schieben und so die nach außen gerichtete Kraft bereitzustellen, die die Spindelpole voneinander trennt. Früher wurde angenommen, dass Kinesin-5-Motoren ausschließlich Plus-End-gesteuert sind. Neuere Studien zeigten jedoch, dass mehrere pilzliche Kinesin-5-Motoren am Minus-Ende auf die Einzelmolekülebene gerichtet sind und die Direktionalität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen umschalten können. Das Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 ist ein Beispiel für ein solches bidirektionales Motorprotein: Unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke bewegen sich einzelne Moleküle von Cin8 in Minus-End-Richtung der MTs. Es wurde auch gezeigt, dass Cin8 bewegliche Cluster bildet, hauptsächlich am Minus-Ende der MTs, und ein solches Clustering ermöglicht es Cin8, die Direktionalität zu wechseln und eine langsame, plus gerichtete Motilität zu durchlaufen. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für alle Schritte der Arbeit mit GFP-getaggtem Kinesin-5 Cin8, von der Proteinüberexpression in S. cerevisiae-Zellen über ihre Aufreinigung bis hin zum In-vitro-Einzelmolekül-Motilitätsassay . Eine hier beschriebene neu entwickelte Methode hilft, einzelne Moleküle und Cluster von Cin8 anhand ihrer Fluoreszenzintensität zu unterscheiden. Diese Methode ermöglicht eine separate Analyse der Motilität einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 und liefert so die Charakterisierung der Abhängigkeit der Cin8-Motilität von ihrer Clustergröße.

Einleitung

Eine große Anzahl von Motilitätsereignissen in eukaryotischen Zellen wird durch die Funktion molekularer Motorproteine vermittelt. Diese Motoren bewegen sich entlang der zytoskelettalen Filamente, Aktinfilamente und Mikrotubuli (MTs) und wandeln die chemische Energie der ATP-Hydrolyse in kinetische und mechanische Kräfte um, die erforderlich sind, um die biologische Motilität in Zellen anzutreiben. Das MT-basierte S. cerevisiae Cin8 ist ein bipolares, homotetrameres Kinesin-5-Motorprotein, das Spindel-MTs vernetzt und auseinanderschiebt1. Cin8 erfüllt wesentliche Funktionen während der Mitose, bei der Spindelmontage 2,3,4 und bei der Spindeldehnung während der Anaphase 5,6,7. Zuvor war gezeigt worden, dass Cin8 ein bidirektionaler Motor ist, der die Richtungsabhängigkeit unter verschiedenen experimentellen Bedingungen schaltet. Zum Beispiel bewegen sich einzelne Cin8-Motoren unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke in Richtung des Minus-Endes der MTs, während sich Cin8-Motoren in Clustern, in mehrmotorigen MT-Gleitassays und zwischen antiparallelen MTs hauptsächlich in Richtung der Plus-Enden der MTsbewegen 8,9,10,11,12 . Diese Ergebnisse waren aus mehreren Gründen höchst unerwartet. Erstens trägt Cin8 seine katalytische motorische Domäne am Amino-Terminus, und es wurde bisher angenommen, dass solche Motoren ausschließlich plus-end gerichtet sind, während Cin8 als minus-end auf der Einzelmolekülebene gerichtet gezeigt wurde. Zweitens wurde angenommen, dass Kinesin-Motoren unidirektional sind, entweder minus-end oder plus-end gerichtet, während Cin8 abhängig von den experimentellen Bedingungen als bidirektional gezeigt wurde. Schließlich konnte aufgrund der MT-Orientierung an der mitotischen Spindel die klassische Rolle von Kinesin-5-Motoren bei der Trennung von Spindelpolen während der Spindelmontage und der Anaphase B nur durch ihre Plus-End-gerichtete Motilität auf den MTs, die sie vernetzen 1,13, erklärt werden. Nach den ersten Berichten über die Bidirektionalität von Cin8 wurde gezeigt, dass einige andere Kinesin-Motoren bidirektional14,15,16 sind, was darauf hindeutet, dass die bidirektionale Motilität von Kinesin-Motoren häufiger sein könnte als bisher angenommen.

Es wurde bereits berichtet, dass sich Cin8 in Zellen auch in einer bidirektionalen Weisebewegt 8, was die Vorstellung unterstützt, dass die bidirektionale Motilität einiger Kinesin-5-Motoren für ihre intrazellulären Funktionen wichtig ist. Da die drei Kinesin-5-Motoren, von denen berichtet wurde, dass sie bidirektional sind, aus Pilzzellen stammen, wurde kürzlich eine mögliche Rolle für die Bidirektionalität von Kinesin-5-Motoren in solchen Zellenvorgeschlagen 10. Nach diesem Modell liefern Kinesin-5-Motoren bei geschlossener Mitose von Pilzzellen, bei denen die Kernhülle während der Mitose nicht zusammenbricht, die Anfangskraft, die die Spindelpole vor der Spindelmontage voneinander trennt. Um diese Aufgabe zu erfüllen, lokalisieren sich Kinesin-5-Motoren vor der Spindelpoltrennung in der Nähe der Spindelpole durch ihre minus-endgerichtete Motilität auf einzelnen Kern-MTs. An dieser Position angekommen, gruppieren, schalten Kinesin-5-Motoren die Richtungsabhängigkeit, erfassen und vernetzen MTs von benachbarten Spindelpolen. Anschließend sorgen Kinesin-5-Motoren für die anfängliche Trennung der Pole durch Plus-End-gerichtete Motilität auf den MTs, die sie vernetzen. Bei diesem Modell sind sowohl eine gerichtete Minus-End-Motilität auf einzelnen MTs als auch eine gerichtete Plus-End-Motilität auf vernetzten MTs während des antiparallelen Gleitens erforderlich, damit Pilzkinesin-5-Motoren ihre Rolle in der Spindelbaugruppe 1,13 erfüllen können.

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Methode besteht darin, hochreines GFP-markiertes Kinesin-5-Cin8 mit hohem Pilz zu erhalten und Einzelmolekül-Motilitätsassays durchzuführen (Abbildung 1), während die Motilität einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 separat analysiert wird. Die Trennung zwischen einzelnen Molekülen und Clustern ist wichtig, da einer der Faktoren, die nachweislich die Richtungsabhängigkeit von Cin8 beeinflussen, seine Akkumulation in Clustern auf den MTs10,12 ist. Alternative Motilitätsassays, wie die MT-Oberflächengleit- und MT-Gleitassays, liefern keine Informationen über die Aktivität einzelner motorischer Proteine17,18. Die hier beschriebenen robusten Einzelmolekül-Motilitätsassay- und Analysemethoden wurden erfolgreich angewendet, um verschiedene Aspekte der Kinesin-5-Motoren, Cin8 und Kip1 10,11,12,14,19,20, zu charakterisieren.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Cin8-Überexpression und -Reinigung, die Polymerisation von MTs und den Einzelmolekül-Motilitätsassay vorgestellt. Darüber hinaus werden auch die Analysen zur Unterscheidung zwischen einzelnen Molekülen und Clustern von Cin8 und zur Bestimmung der Einzelmotor- und Clustergeschwindigkeiten durch mittlere Verschiebung (MD) und mittlere quadratische Verschiebung (MSD) beschrieben. Dieses Protokoll soll Forschern helfen, alle Schritte der Verfahren zu visualisieren und bei der Fehlerbehebung dieser Art von Assays zu helfen.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Einzelmolekül-Motilitätsassays. Biotinylierte fluoreszierende MTs sind an der Glasoberfläche befestigt, die mit Avidin beschichtet ist, das mit dem an der Oberfläche befestigten biotinylierten BSA interagiert. Der grüne Pfeil stellt die Bewegungsrichtung einzelner Cin8-Moleküle unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke dar. +/- stellen die Polarität des MT dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protokoll

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

  1. Puffer
    1. -Leu aa Dropout-Mix: Je 2 g Adenin, Uracil, Tryptophan, Histidin, Lysin und Methionin mischen und bei Raumtemperatur lagern.
    2. Hefeselektives Medium mit Raffinose (1 L): 6,7 g Hefestickstoffbasis (mit Ammoniumsulfat), 2 g -Leu-aa-Tropfenmischung und 20 g Raffinose in doppelt destilliertem Wasser unter Rühren (ohne Erhitzen) mischen, bis sie vollständig aufgelöst sind. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter in eine sterile Flasche.
    3. Lysepuffer: Bereiten Sie 25 ml Lösung in dreifach destilliertem Wasser (TDW) vor, bestehend aus 50 mM Tris, 30 mM Rohren, 500 mM KCl, 10% Glycerin, 1,5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP und 0,1% Triton X-100. Stellen Sie den pH-Wert mit 6 M HCl auf 8 ein.
    4. Elutionspuffer: Bereiten Sie 10 mL Lösung in TDW vor, bestehend aus 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 350 mM Imidazol, 10% Glycerin, 1,5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP und 0,1% Triton X-100. Stellen Sie den pH-Wert mit 6 M HCl auf 7,2 ein.
    5. P12-Puffer: Bereiten Sie 10 mL einer Lösung in TDW vor, die aus 12 mM-Rohren, 1 mM EGTA und 2 mM MgCl2 besteht. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 6,9 ein.
    6. BRB80-Puffer: Bereiten Sie 50 mL einer Lösung vor, die aus 80 mM Rohren, 1 mM EGTA und 2 mMMgCl 2 in Reinstwasser besteht. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 6,9 ein.
    7. Allgemeiner Tubulinpuffer (GTB): Bereiten Sie 50 ml einer Lösung vor, die aus 80 mM Rohren, 0,5 mM EGTA und 2 mMMgCl 2 in Reinstwasser besteht. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 6,9 ein.
    8. Tris-Pipes-Lösung: Bereiten Sie 40 ml 1M Tris-0,6 M Pipes-Lösung vor, indem Sie 6,055 g Tris und 9,07 g Rohre in TDW mischen und den pH-Wert mit 6 M HCl auf 7,2 einstellen. Bringen Sie das endgültige Volumen mit TDW auf 50 ml.
      HINWEIS: P12-, BRB80- und Tris-Pipes-Puffer werden für die Herstellung von Stammlösungen für den Motilitätsassay verwendet. Diese Puffer können in großen Mengen hergestellt, in 1,5-ml-Röhrchen aliquotiert, schockgefroren und bei -20 °C gelagert werden.
  2. Lagerlösungen für den Motilitätstest
    1. Tubulin (10 mg mL-1): 1 mg lyophilisiertes Tubulin in 100 μL kaltem (4 °C) allgemeinem Tubulinpuffer (GTB) auflösen. 1 μL Aliquots einfrieren und bei -80 °C lagern.
    2. Biotinyliertes Tubulin (1 mg mL-1): 20 μg lyophilisiertes Tubulin in 20 μL kaltem GTB auflösen. 1 μL Aliquots einfrieren und bei -80 °C lagern.
    3. Rhodamin-markiertes Tubulin (1 mg ml-1): 20 μg lyophilisiertes Tubulin in 20 μL kaltem GTB auflösen. 0,5 μL Aliquots einfrieren und bei -80 °C lagern.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP wird vom Lieferanten als 100 μL wässrige Lösung erhalten und bei -80 °C gelagert. Tauen Sie das Fläschchen mit GMPCPP auf Eis auf. 1 μL Aliquots zubereiten, einfrieren und bei -80 °C lagern.
    5. ATP: Bereiten Sie 500 μL Lösung von 100 mM ATP in 0,5 M Tris Puffer (pH 8) vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    6. MgCl 2: Bereiten Sie 1 ml Lösung von 200 mMMgCl 2 im P12-Puffer vor. 5 μL Aliquots bei -20 °C lagern.
    7. Kasein: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 5 mg mL-1 Casein in BRB 80 Puffer vor. 10 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    8. D-Glucose: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 M D-Glucose im P12-Puffer vor. 10 μL Aliquots bei -20 °C lagern.
    9. Glucoseoxidase: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 10 mg mL-1 Glukoseoxidase im P12-Puffer vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    10. Katalase: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung mit 0,8 mg ml-1-Katalase im P12-Puffer vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    11. Dithiothreitol (DTT): Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 M DTT in P12-Puffer in einem Abzug vor. 10 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    12. Kreatinphosphat: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 M Kreatinphosphat im P12-Puffer vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    13. Kreatinphosphokinase: Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 5 mg ml-1 Kreatinphosphokinase in 0,25 m Glycylglycin, pH 7,4 vor. 2 μL Aliquots einfrieren und bei -20 °C lagern.
    14. EGTA: Bereiten Sie eine 100 mM EGTA-Lösung in Reinstwasser vor und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
    15. KCl: Bereiten Sie eine 1 M KCl-Lösung in Reinstwasser vor und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
  3. Motilitätspuffer und Reaktionsmischung
    1. Motilitätspuffer (MB) mit 145 mM KCl, 2x Material: Bereiten Sie 1 ml 2x Material des Motilitätspuffers vor, indem Sie 100 μL vorgefertigte Tris-Pipes-Lösung, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl und 590 μL TDW mischen. Halten Sie den Puffer auf Eis.
    2. Motilitätsreaktionsmischung: Motilitätsreaktionsmischung gemäß Tabelle 1 vorbereiten und auf Eis lagern.
VolumenLagerName des Reagenzes
50 μL2-fachMB (aus Schritt 1.3.1)
40 μL-TDW
1 μL100 mMATP
1 μL200 mMMgCl2
2 μL5 mg/mlCasein
1 μL1 Mio.Traubenzucker
1 μL1 Mio.DVB-T
1 μL10 mg/mlGlukoseoxidase
1 μL8 mg/mlKatalase
1 μL1 Mio.Phosphokreatin
1 μL5 mg/mlKreatinphosphokinase
100 μLGesamt

Tabelle 1.

2. Cin8-Überexpression und Reinigung aus S. cerevisiae-Zellen

  1. Züchten Sie S. cerevisiae-Zellen , die das Plasmid zur Überexpression von Cin8-GFP-6His enthalten, bis zur exponentiellen Wachstumsphase (OD600 = 0,6-0,8) in 1 l Hefeselektivmedium, ergänzt mit 2% Raffinose (siehe Schritt 1.1.2) bei 28 °C12.
  2. Induzieren Cin8-GFP-6Seine Überexpression durch Zugabe von 2% Galaktose. Überwachen Sie das Wachstum der Hefekultur, indem Sie die Absorption bei 600 nm messen.
  3. Fünf Stunden nach der Galaktosezugabe die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C ernten, die Zellen im Lysepuffer suspendieren und in Flüssigkeit N2 einfrieren.
    HINWEIS: Gefrorene Zellen können bei -80 °C zur weiteren Verwendung gelagert oder sofort in FlüssigkeitN2 gemahlen werden.
  4. Mahlen Sie die gefrorenen Zellen in Flüssigkeit N2 mit gekühltem Mörser und Stößel. Fügen Sie während des Mahlens Flüssigkeit N2 hinzu, um die Extrakte gefroren zu halten. Es erfordert typischerweise 4-5 mal die Zugabe von Flüssigkeit N2.
  5. Überwachen Sie die Zelllyse durch Beobachtung unter Phasenkontrast- oder DIC-Mikroskop.
  6. Erdzellen auftauen und bei 21.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Laden Sie den Überstand auf eine Schwerkraftsäule, die mit 2 ml Ni-NTA gefüllt und mit Lysepuffer voräquilibriert ist. Lassen Sie den Überstand durch die Säule fließen.
  7. Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina Lysepuffer und dann mit fünf Säulenvolumina Lysepuffer, ergänzt durch 25 mM Imidazol.
  8. Eluierte Cin8-GFP-6His mit Elutionspuffer (siehe Schritt 1.1.4).
  9. Analysieren Sie die eluierten Proben mittels SDS-PAGE-Fraktionierung, gefolgt von Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse, die mit α-GFP-Antikörper19 untersucht wurde.
  10. Poolen Sie die Fraktionen, die Cin8-GFP-6His enthalten (Schritte 2.8 und 2.9). Darüber hinaus reinigen Sie sie durch Größenausschlusschromatographie (SEC) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml min-1 und einer Säulendruckgrenze von 1,5 MPa bei gleichzeitiger Überwachung der Absorption bei 280 nm und der GFP-Fluoreszenzemission mit Anregung bei 488 nm (Abbildung 2A).
  11. Sammeln Sie die Brüche, die dem Cin8-GFP-Tetramer entsprechen, und analysieren Sie sie mittels SDS-PAGE und Western Blotting (siehe Schritt 2.9) (Abbildung 2B).
  12. Schätzen Sie die Proteinkonzentration mithilfe von Spektrophotometrie oder biochemischen Assays wie Bradford-Assay, BCA-Assay usw.
  13. Aliquot die ausgewählten Fraktionen, in FlüssigkeitN2 einfrieren und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. Diese gereinigten Proteinproben können 6 Monate lang verwendet werden.
    HINWEIS: Cin8-GFP wird überexprimiert und gereinigt von einem Protease-defizienten S. cerevisiae-Stamm, der ein 2-μm-Plasmid für Cin8-GFP-6His Überexpression aus dem galaktose-induzierbaren Promotor enthält, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Der Hefestamm und das Plasmid sind auf Anfrage erhältlich.

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Abbildung 2: Reinigung von Cin8-GFP. (A) Das Größenausschlusschromatogramm von Ni-NTA gereinigtem Cin8-GFP mit kontinuierlicher GFP-Fluoreszenzdetektion durch 488 nm Anregung und Emission bei ~510 nm. Das Cin8-GFP-Tetramer eluiert bei ~10 ml aus der SEC-Spalte (markiert mit einem Pfeil). (B) Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel (oben) und α-GFP-Western Blot (unten) von Cin8-GFP-Fraktionen, die aus SEC eluiert werden. Die Proben in den Bahnen sind wie folgt: M - Molekulargewichtsmarker, Ni 2 + - Ni-NTA-gereinigte Cin8-GFP-Probe, die in dieSEC-Spalte geladen wird, GF-Fraktionen: Fraktion, die der Cin8-GFP-SEC-Elution entspricht, wie in Panel A markiert. Der Pfeil rechts markiert die Größe des Cin8-GFP-Monomers (erwartet auf der SDS-PAGE). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Einzelmolekül-Motilitätsassay mit dem gereinigten Cin8

  1. Polymerisation von Biotin- und Rhodamin-markierten MTs, stabilisiert mit GMPCPP.
    1. Beginnen Sie mit der MT-Polymerisation, indem Sie die folgenden Komponenten in einem 1,5-ml-Röhrchen mischen: 1 μL 10 mg/ml Tubulinprotein, 1 μL 1 mg/ml biotinyliertes Tubulin, 0,5 μL 1 mg/ml Rhodamin-markiertes Tubulin, 1 μL 10 mM GMPCPP und 6,5 μL allgemeiner Tubulinpuffer (GTB). Die Mischung für 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Nach der MT-Polymerisation 80 μL warmes (37 °C) GTB hinzufügen, vorsichtig mischen und 20 min bei 16.500 x g zentrifugieren.
    3. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie es mit 50 μL warmem GTB auf und ab pipettieren. Lagern Sie die Suspension bei 28 °C.
    4. Untersuchen Sie die MTs mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des 647-nm-Rhodaminkanals (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Um biotinylierte fluoreszenzmarkierte MTs zu erhalten, enthält die Polymerisationsreaktion unmarkiertes Tubulin sowie biotinyliertes und fluoreszenzmarkiertes Tubulin. In diesem Protokoll wird Rhodamin-markiertes Tubulin verwendet, aber auch andere fluoreszierende Konjugate können verwendet werden.
  2. Durchflusskammer-Montage
    1. Montieren Sie eine Durchflusskammer, indem Sie vier Streifen doppelseitiges Klebeband (~ 4 cm x ~ 3 mm) auf einen fortschrittlichen selbstklebenden Glasschieber (parallel zur längeren Kante und ~ 3-4 mm voneinander entfernt) legen, um drei "Bahnen" zwischen den Bandstreifen zu schaffen. Entfernen Sie das Schutzpapier von den Bandstreifen und legen Sie ein silanisiertes Deckglas 10 auf die Bandstreifen, um drei Durchflusskammern mit einem Volumen von ~10 μL zu erzeugen.
  3. MT-Immobilisierung auf die avidinbeschichtete Oberfläche (Abbildung 1)
    1. Beschichten Sie den silanisierten Deckglas durch Perfusion mit 15 μL 1 mg/ml biotinyliertem Rinderserumalbumin (b-BSA, gelöst in GTB) mit einer Mikropipetette in die Durchflusskammer. Nach 5 min die Kammer mit 80 μL GTB waschen.
    2. Anschließend werden wie in Schritt 3.3.1 15 μL 15 μL 1 mg/ml Avidin (gelöst in GTB) in die Durchflusskammer eingeführt, das an die b-BSA bindet. Nach 5 min die Kammer mit 80 μL GTB waschen.
    3. Passivieren Sie die silanisierte Deckglasoberfläche mit 20 μL 1% Poloxamer. Nach 3 min mit 80 μL GTB waschen.
    4. Befestigen Sie biotinylierte MTs (Schritt 3.1) am b-BSA-avidin-beschichteten Deckglas, indem Sie 20 μL MTs einführen, die typischerweise auf 1:20 in GTB verdünnt sind. Inkubieren Sie die Objektträger in umgekehrter Position, d.h. mit dem Deckglas nach unten in einer dunklen Feuchtigkeitskammer (z. B. einer Petrischale mit nassem Seidenpapier) für 5 min bei Raumtemperatur. Dann mit 200 μL GTB waschen.
    5. 30 μL Motilitätsreaktionsmischung (siehe Schritt 1.3.2) werden in die Durchflusskammer aufgetragen.
    6. Die Cin8-GFP-Motoren (Schritt 2.13) werden in 20 μL Motilitätsreaktionsmischung (siehe Tabelle 1) verdünnt (typischerweise auf eine Endkonzentration von 5-10 μM). Tragen Sie sie auf die Durchflusskammer auf und stellen Sie sofort die Bewegung der Motoren entlang der MTs dar.
  4. Bildgebung der motorischen Motilität
    HINWEIS: Die MT-Bindung und die Motilität der Motoren wurden mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop überwacht, das mit einer Quecksilberbogenlampe, einem numerischen 100x/1,4-Blendenobjektiv und zwei Fluoreszenzbandpass-Filtersätzen ausgestattet war, eines mit einer Wellenlänge von 647 nm (für Rhodamin) und eines mit einer Wellenlänge von 488 nm (für GFP).
    1. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskopobjektiv. Platzieren Sie die Durchflusskammer auf dem Fluoreszenzmikroskoptisch mit dem Deckel nach unten zum Objektiv.
    2. Schalten Sie den Rhodaminkanal ein, um sich auf die an der Deckglasoberfläche angebrachten MTs zu konzentrieren, und erfassen Sie das Bild mit einer Belichtung von 20 ms mit der Micro-Manager ImageJ-Fiji-Software21.
    3. Schalten Sie den GFP-Kanal ein und erfassen Sie 90 Zeitrafferbilder mit einem Intervall von 1 s und einer Belichtung von 800 ms, um die Cin8-GFP-Motilität zu analysieren.

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Abbildung 3: MTs und MT-gebundene Cin8-GFP. (A) Bilder aus zwei Feldern (links und rechts) für MTs, die nach dem in Schritt 3.1 beschriebenen Protokoll polymerisiert und mit 100-fachem Objektiv wie in Schritt 3.4 beschrieben abgebildet wurden. (B) Bilder aus zwei Feldern (links und rechts) für den Cin8-GFP (untere Tafeln, mit Pfeilen markiert), die an der in den oberen Feldern gezeigten MT befestigt sind. Maßstabsbalken: 4 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Motilitätsanalyse

HINWEIS: Führen Sie die gesamte Bildanalyse durch und generieren Sie Kymographen mit der ImageJ-Fiji Software.

  1. Generierung von Kymographen
    1. Öffnen Sie den Zeitrafferfilm und das entsprechende MT-Feldbild. Synchronisieren Sie diese beiden Fenster, indem Sie die folgende Option auswählen: Analysieren > Tools > Windows synchronisieren.
    2. Markieren Sie eine MT mit der Option Segmentierte Linie und verwenden Sie die Registerkarte > Multikymograph analysieren, um einen Kymographen zu erhalten.
  2. Bestimmung der Clustergröße von Cin8-GFP (d.h. die Anzahl der Cin8-Moleküle in einem Cluster)
    1. Führen Sie die Hintergrundsubtraktion und die Korrektur bei ungleichmäßiger Beleuchtung durch, indem Sie die Option Hintergrund > subtrahieren verwenden. Stellen Sie den Radius des rollenden Balls auf 100 Pixel ein und aktivieren Sie die Option Sliding Paraboloid.
    2. Verfolgen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität eines bestimmten nicht beweglichen Cin8-GFP-Motors (Abbildung 3B) als Funktion der Zeit innerhalb eines Kreises von 4 Pixeln Radius mit dem TrackMate-Plugin der ImageJ-Fiji-Software, indem Sie die folgende Option wählen: Plugins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Wiederholen Sie Schritt 4.2.2 für verschiedene Cin8-GFP-Motoren. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität der verschiedenen Cin8-GFP-Motoren als Funktion der Zeit auf.
      HINWEIS: Eine experimentelle Strategie zur Messung der Clustergröße - d.h. der Anzahl der Cin8-Moleküle in einem Cluster - schafft eine Grundlage für die Analyse der Cin8-Clustering-bezogenen Motilität. Photobleaching von GFP, das an Cin8 gebunden ist, wird verwendet, um den Beitrag einzelner GFP-Moleküle zur Gesamtintensität von Cin8-Clustern zu bestimmen. Zum Beispiel nehmen die Fluoreszenzintensitäten in Schritten von ~ 50 beliebigen Einheiten (a.u.) ab, wobei jeder einzelne Schritt wahrscheinlich die Photobleiche eines GFP-Moleküls darstellt (Abbildung 4A). Da Cin8 ein homotetrameres Motorprotein ist, enthält es vier GFP-Moleküle. Daher sind alle Cin8-Motoren mit einer Intensität ≤ 200 a.U. wahrscheinlich einzelne tetramere Cin8-Moleküle. Nach dieser Methode werden die Intensitätsbereiche der motorischen Cin8-Fluoreszenz als <200, 200-400 und >400 für einzelne Cin8-Moleküle, Paare von Cin8-Molekülen (Dimer von Cin8-Tetramer) und Cin8-Oligomere bzw.12 zugewiesen.
  3. Intensitätsverteilungsanalyse für Cin8-GFP-Motoren
    1. Messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität aller fluoreszierenden Cin8-GFP-Motoren im ersten Frame der Zeitraffersequenz mit dem TrackMate-Plugin in ImageJ-Fiji, wie in Schritt 4.2.2 beschrieben.
    2. Zeichnen Sie ein Histogramm der mittleren Intensitäten von Cin8-GFP mit einer Bin-Größe von 20 a.u. und passen Sie den Hauptpeak des Histogramms an eine Gaußsche Kurve an (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Die Intensitätsverteilungsanalyse ergänzt die Clustergrößenbestimmung für Cin8-GFP-Motoren aus den Photobleichexperimenten. Die Gaußsche Kurve, die an das Intensitätsverteilungshistogramm für die Cin8-GFP-Population angepasst ist, erreicht ihren Höhepunkt bei ~ 125 a.e., was mit der durchschnittlichen Intensität einzelner tetramerer Cin8-Moleküle übereinstimmt, die entweder ein, zwei, drei oder vier fluoreszierende (nicht gebleichte) GFP-Moleküle enthalten, wobei jedes fluoreszierende GFP-Molekül ~ 50 a.e. beisteuert. Somit kann mit dieser Intensitätsverteilungsmethode auch der Beitrag eines GFP-Moleküls berechnet werden, der weiter genutzt werden kann, um die Clustergröße von Cin8-GFP-Molekülen zuzuordnen.

figure-protocol-3
Abbildung 4: Cin8-GFP-Bleichprofil und Intensitätsverteilung. (A) Photobleichen von GFP in vier verschiedenen Cin8-GFP-Motoren. Einzelne Photobleichschritte, die wahrscheinlich das Photobleichen eines GFP darstellen, führen zu einem Abfall der Fluoreszenzintensität von ~50 a.u. (B) Die Intensitätsverteilung von Cin8-GFP-Motoren im ersten Frame einer Zeitraffersequenz (Inset). Der Gaußsche Peak (blau) zentriert bei ~ 125 a.U. repräsentiert einzelne Cin8-GFP-Moleküle. Dieser Peak zeigt die durchschnittliche Intensität einzelner Cin8-Tetramere mit einem, zwei, drei oder vier fluoreszierenden GFP-Molekülen, wobei jedes GFP-Molekül ~ 50 AE zur Gesamtintensität beiträgt (dh (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Verfolgung der Motilität der Cin8-GFP-Moleküle entlang der MT-Spuren
    1. Schneiden Sie die MT zu, die in der Zeitraffersequenz der aufgezeichneten Frames analysiert werden soll, indem Sie sie mit dem Rechteckwerkzeug hervorheben und dann Bild > Zuschneiden wählen.
    2. Wählen Sie für die Analyse ein fluoreszierendes Cin8-GFP-Partikel. Zeichnen Sie die Partikelkoordinaten in jedem Frame (Zeitpunkt) der Zeitraffersequenz mit den Optionen " Punkt-Werkzeug " und " Messen" auf. Führen Sie eine ähnliche Aufzeichnung von Koordinaten für andere fluoreszierende Partikel in der Zeitraffersequenz durch.
    3. Weisen Sie allen untersuchten Cin8-GFP-Partikeln im ersten Rahmen ihres Auftretens eine Clustergröße zu, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
  2. Analysen der mittleren Verschiebung (MD) und der mittleren quadratischen Verschiebung (MSD)
    1. Berechnen Sie aus den Koordinaten der Cin8-GFP-Bewegungen, die in Schritt 4.4 bestimmt wurden, die Verschiebungen von Cin8-GFP zu jedem Zeitpunkt in Bezug auf die Anfangskoordinaten unter Verwendung der Gleichung zur Berechnung der Entfernung zwischen zwei Punkten mit bestimmten Koordinaten:
      figure-protocol-4
      wobei d t die Verschiebungen von Cin8-GFP zum Zeitpunkt t, x t und y t die jeweiligen Koordinaten zum Zeitpunkt t sind. x 0 und y 0 sind die jeweiligen Koordinaten von Cin8-GFP beit =0.
    2. Berechnen Sie aus diesen Verschiebungswerten die Verschiebung für alle möglichen Zeitintervalle für ein bestimmtes Cin8-GFP-Partikel. Wiederholen Sie den Vorgang für alle untersuchten Cin8-GFP-Partikel.
    3. Zeichnen Sie die mittlere Verschiebung (MD) aller untersuchten Cin8-GFP-Partikel im Vergleich zum Zeitintervall auf und unterliegen Sie einer linearen Anpassung, MD = v x t + c. Die Steigung dieser Anpassung (v) stellt die mittlere Geschwindigkeit von beweglichen Cin8-GFP-Partikeln dar.
      HINWEIS: Auf diese Weise kann die durchschnittliche Geschwindigkeit aller Cin8-GFP-Moleküle, die zu jeder Clustergröße gehören, separat berechnet werden, wobei die Motilität verschiedener Clustergrößen charakterisiert wird. Zusätzlich zur MD-Analyse kann auch die MSD-Analyse (Mean Square Displacement) durchgeführt werden, indem die in den Schritten 4.5.1 und 4.5.2 berechneten Verschiebungswerte quadriert werden. MSD-Werte werden im Vergleich zum Zeitintervall aufgetragen und an die Polynomkurve MSD = v 2 x t2 +2D x t + c angepasst, wobei der zusätzliche Parameter D ergibt, der der Diffusionskoeffizient der Cin8-GFP-Bewegung ist. Die MD-Analyse sollte an den mit MT 8,10 gekennzeichneten Polarität durchgeführt werden, während für die MSD-Analyse keine Kenntnis der MT-Polarität erforderlich ist.

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Ergebnisse

Das Experiment zielt darauf ab, die Motilitätseigenschaften des bidirektionalen Motorproteins Cin8 verschiedener Clustergrößen auf einzelnen MTs zu untersuchen. Die repräsentative Motilität von Cin8-GFP ist auch aus den Kymographen in Abbildung 5A ersichtlich, wo die räumliche Position des Motors im Laufe der Zeit gezeigt wird.

Für die Analyse der beweglichen Eigenschaften von Cin8-GFP wird zunächst jedem MT-gebundenen beweglichen Cin8-GFP-Partikel die Clustergröß...

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Diskussion

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für den Einzelmolekül-Motilitätsassay mit dem bidirektionalen Kinesin-5 Cin8 und die Motilitätsanalyse vorgestellt. Das Cin818 in voller Länge einschließlich des nativen nuklearen Lokalisierungssignals (NLS) am C-Terminal wurde vom nativen Wirt S. cerevisiae gereinigt. Da das Cin8 ein Kernmotorprotein ist, erweist sich das Mahlen der S. cerevisiae-Zellen unter flüssigem Stickstoff als die effizienteste Methode für die Zelllyse. Nach der Lyse wi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde zum Teil durch das Stipendium der Israel Science Foundation (ISF-386/18) und das Stipendium der Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008) unterstützt, das an L.G.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AdeninFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
biotinyliertes BSASigmaA8549
CaseinSigmaC7078
Katalase (C40)SigmaC40
KreatinkinaseSigmaC3755
Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Fluoreszenzfilter-Set für GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluoreszenz-Filter-Set für RhodaminChroma49004: ET-CY3/TRITC
Fluoreszenz-InversmikroskopZeissAxiovert 200M
GalaktoseTivan BiotechGAL02
GlukoseSigmaG8270
GlukoseoxidaseSigmaG7141
GlycerinSigmaG5516
GlycylGlycinMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBZytoskelettBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidinDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI Softwarehttps://imagej.net/plugins/trackmate/Version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] für Windows 10
ImidazolSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
ObjektivZeiss100x/1.4 Öl DIC Objektiv
LysinFORMEDIUMDOC0161
MagnesiumchloridSigmaM8266
MethioninDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS-Kamera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Phospho-KreatinSigmaP1937
RohreSigmaP1851
Pluronsäure F-127 (Poloxamer)SigmaP2443
KaliumchloridSigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
Größenausschluss-Chromatographie-InstrumentGE HealthcareAKTA Reines
SpektralphotometerThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TryptophanDuchefa BiochemieT0720.0100
Tubulin-ProteinZytoskelettT240
Tubulin, biotinyliertesZytoskelettT333P
Tubulin, TRITC RhodaminZytoskelettTL530M
UracilSigmaU0750-100G
StickstoffbaseFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP AntikörperSanta Cruz BiotechnologySC8036
β-MercaptoethanolSigmaM3148
Hefe

Referenzen

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Schlagwörter

Kinesin 5 Motilit tCin8 MotorproteinEinzelmolek l Motilit tClusterbildung von MotorproteinenMikrotubuli Dynamikbidirektionales MotorproteinGr enausschlusschromatographieFluoreszenzmikroskopieSaccharomyces cerevisiaeGFP Tagging

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