Doppelfärbungsmethode zum Nachweis von Pektin in der Pflanzen-Pilz-Interaktion

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine mikroskopische Methode zum Nachweis von Pektin in der Kaffee-Pilz-Interaktion.

Zusammenfassung

Pflanzenzellen nutzen verschiedene strukturelle Mechanismen, entweder konstitutiv oder induzierbar, um sich vor einer Pilzinfektion zu schützen. Die Verkapselung ist ein effizienter induzierbarer Mechanismus, um die pilzliche Haustoria aus dem pflanzlichen Zell-Protoplasten zu isolieren. Umgekehrt ist Pektin, einer der polymeren Bestandteile der Zellwand, ein Ziel mehrerer pektolytischer Enzyme in nekrotrophen Wechselwirkungen. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis von Pektin und Pilzhyphen durch optische Mikroskopie vorgestellt. Untersucht werden die pektinreiche Verkapselung in den Zellen von Kaffeeblättern, die mit dem Rostpilz Hemileia vastatrix infiziert sind, und die durch Cercospora coffeicola induzierte Mesophyll-Zellwandmodifikation . Läsionierte Blattproben wurden mit der Karnovsky-Lösung fixiert, dehydriert und für 2-4 Tage in Glykolmethacrylat eingebettet. Auf alle Schritte folgte ein Vakuumpumpen, um Luft in den Interzellularräumen zu entfernen und den Einbettungsprozess zu verbessern. Die eingebetteten Blöcke wurden in 5-7 μm dicke Abschnitte geschnitten, die auf einem mit Wasser bedeckten Glasobjektträger abgeschieden und anschließend 30 min lang auf 40 °C erhitzt wurden. Als nächstes wurden die Objektträger mit 5% Baumwollblau in Lactophenol doppelt gefärbt, um den Pilz nachzuweisen, und 0,05% Rutheniumrot in Wasser, um Pektin (saure Gruppen von Polyuronsäuren von Pektin) nachzuweisen. Es wurde festgestellt, dass pilzartige Haustorien von Hemileia vastatrix von Pektin eingekapselt sind. Bei der Kaffeezerkosporiose zeigten Mesophyllzellen eine Auflösung der Zellwände, und interzelluläre Hyphen und Konidiophoren wurden beobachtet. Die hier vorgestellte Methode ist effektiv, um eine Pektin-assoziierte Reaktion in der Pflanzen-Pilz-Interaktion nachzuweisen.

Einleitung

Zellwand-Abwehrmechanismen in Pflanzen sind entscheidend, um Pilzinfektionen einzudämmen. Studien haben über Veränderungen der Zellwanddicke und -zusammensetzung seit dem 19^{. Jahrhundert} berichtet ^1,2. Diese Veränderungen können durch einen pilzlichen Krankheitserreger induziert werden, der die Bildung einer Papille stimuliert, die verhindert, dass Pilze in die Zelle eindringen, oder könnte verwendet werden, um die Hyphen zu verkapseln, um den Wirtszellprotoplast von der pilzlichen Haustoria zu isolieren. Die Herstellung einer dynamischen Zellwandbarriere (d.h. Papillen und ein vollständig ummantelt....

Protokoll

1. Herstellung der Pufferlösung und der Reagenzien

1. Bereiten Sie 2 M Cacodylatpuffer vor, indem Sie 4,28 g Natriumcacodylat zu 100 ml destilliertem Wasser hinzufügen und den pH-Wert mit 0,2 N HCl auf 7,25 einstellen.
2. Bereiten Sie 100 ml der Karnovsky-Fixierlösung vor, indem Sie 10 ml 25% wässriges Glutaraldehyd, 10 ml 10% wässriges Formaldehyd, 25 ml 2 M Cacodylatpuffer und 0,5 ml 0,5 M CaCl_{2 26} mischen. Erhöhen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml.
   HINWEIS: Die Lösung kann 6 Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden.
   ACHTUNG: Die Cacodylat-Pufferlösung ist giftig; Behandeln Sie ....

Ergebnisse

Die baumwollblaue Lactophenolfärbung auf dem GMA-eingebetteten Abschnitt zeigte das Vorhandensein mehrerer Pilzstrukturen zwischen und in Kaffeemesophyllzellen sowohl in biotrophen als auch in nekrotrophen Pilzinteraktionen.

Im biotrophen Pathosystem erscheinen Hemileia vastatrix-Hyphen mit Zellwänden und der dichte Protoplastengehalt bei der Färbung mit der Doppelfärbungsmethode sowohl im schwammigen als auch im Palisadenparenchym dunkelblau (Abbildung <.......

Diskussion

Die vorliegende Arbeit stellt einen alternativen histochemischen Test zur Doppelfärbung vor, um die Pektinzusammensetzung von Zellwänden zu untersuchen, die Haustoria in einem biotrophen Pathosystem verkapseln. Ziel ist es auch, die Wirksamkeit der Methode zum Nachweis von nekrotrophen Pilzen und dadurch induzierten Zellwandveränderungen nachzuweisen. Hier kann Pektin der Kaffeeparenchym-Zellwände sowohl den Hals als auch das Haustorium des Rostpilzes Hemileia vastatrix verkapseln. Silva et al. haben auch die Ve.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Klingen DB80 HS	Leica	14035838383	Schnitt
Cacodylat Puffer	EMS	# 11652	Fixierung
Baumwolle Blau Lactophenol	Metaquí Glimmer	70SOLSIG024629	Färbemittel
Formaldehyd	EMS	#15712	Fixierung
Glutaraldehyd	EMS	#16216	Fixiermittel
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin zum Einbetten
Heizplatte	Dubesser	SSCD25X30-110V	Färbemikroskopie
	Zeiss	#490040-0030-000	Bilderfassung
Mikrotom (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Schneiden
Kunststoffformbecher	Tablett EMS	10176-30	Färben
Rutheniumrot	LABHouse	#006004	Färbesoftware
Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Bilderfassung
Vakuumpumpe	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixierung