Die Studie beschreibt die Methodik der FRET-Kartierung, einschließlich der Auswahl der Markierungsstellen, der Auswahl der Farbstoffe, der Erfassung und der Datenanalyse. Diese Methodik ist effektiv bei der Bestimmung von Bindungsstellen, Konformationsänderungen und dynamischen Bewegungen in Proteinsystemen und ist am nützlichsten, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen 3D-Strukturinformationen durchgeführt wird.
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Methodenartikel
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist eine etablierte fluoreszenzbasierte Methode, mit der Abstände in und zwischen Biomolekülen sowohl in vitro als auch innerhalb von Zellen erfolgreich gemessen werden. In FRET bezieht sich die Effizienz der Energieübertragung, gemessen an Änderungen der Fluoreszenzintensität oder Lebensdauer, auf den Abstand zwischen zwei fluoreszierenden Molekülen oder Markierungen. Die Bestimmung von Dynamik und Konformationsänderungen aus den Entfernungen sind nur einige Beispiele für die Anwendung dieser Methode auf biologische Systeme. Unter bestimmten Bedingungen kann diese Methodik bestehende Röntgenkristallstrukturen ergänzen und verbessern, indem sie Informationen über Dynamik, Flexibilität und Anpassung an Bindungsoberflächen liefert. Wir beschreiben die Verwendung von FRET und zugehörigen Entfernungsbestimmungen zur Aufklärung struktureller Eigenschaften durch die Identifizierung einer Bindungsstelle oder der Orientierungen von Dimer-Untereinheiten. Durch die umsichtige Auswahl der Markierungsstellen und oft den Einsatz mehrerer Markierungsstrategien haben wir diese Mapping-Methoden erfolgreich angewendet, um globale strukturelle Eigenschaften in einem Protein-DNA-Komplex und dem SecA-SecYEG-Proteintranslokationssystem zu bestimmen. Im SecA-SecYEG-System haben wir FRET-Mapping-Methoden verwendet, um die Präproteinbindungsstelle zu identifizieren und die lokale Konformation der gebundenen Signalsequenzregion zu bestimmen. Diese Studie beschreibt die Schritte zur Durchführung von FRET-Mapping-Studien, einschließlich der Identifizierung geeigneter Markierungsstellen, der Diskussion möglicher Markierungen einschließlich nicht-nativer Aminosäurereste, der Markierungsverfahren, der Durchführung von Messungen und der Interpretation der Daten.
Einleitung
Für Proteine führt die Aufklärung der Dynamik zusammen mit 3-dimensionalem (3-D) Strukturwissen zu einem verbesserten Verständnis von Struktur-Funktions-Beziehungen biomolekularer Systeme. Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie und kryogene Elektronenmikroskopie erfassen eine statische Struktur und erfordern häufig die Bestimmung mehrerer Strukturen, um Aspekte der Biomolekülbindung und -dynamik aufzuklären1. In diesem Artikel wird eine lösungsbasierte Methode zum Zuordnen globaler Strukturelemente wie Bindungsstellen oder Bindungsinteraktionen erläutert, die potenziell vorübergehender sind und von statischen Methoden weniger leicht erfas....
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Protokoll
1. Auswahl der Kennzeichnungsstellen
- Identifizieren Sie mindestens drei potenzielle Markierungsstellen, um die mutmaßliche Bindungsstelle auf den vorhandenen Proteinstrukturen zu triangulieren. In diesem Fall wurden SecA, SecYEG und Präprotein, die durch genetische Fusion an SecA gebunden sind, identifiziert2.
- Wählen Sie Markierungsstellen innerhalb von 25-75 Å der mutmaßlichen Bindungsstelle und in relativ statischen Regionen des Proteins bestimmt der Abstand das spezifische FRET-Farbstoffpaar, das verwendet werdensoll 36. Lokalisieren Sie die Markierungsstellen in Proteinregionen, die....
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Ergebnisse
Diese Studie konzentrierte sich auf die Bestimmung der Position der Präproteinbindungsstelle auf SecA vor dem Einfügen des Präproteins in den SecYEG-Kanal. Um die Bindungsstelle zu kartieren, wurden FRET-Experimente zwischen verschiedenen Regionen des Präproteins und drei verschiedenen Stellen an den Proteinen SecA und SecYEG durchgeführt (Abbildung 1A-D). Aus den erhaltenen Entfernungen und dreidimensionalen Strukturen von SecA, SecYEG und dem Präprotein wu.......
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Diskussion
Durch die Verwendung der FRET-Mapping-Methodik identifizierten wir die Signalsequenz-Bindungsstelle auf dem SecA-Protein. Wichtig ist, dass das Vorhandensein einer 3D-Kristallstruktur des Komplexes unsere Studie erheblich erleichtert hat. Die Stärke dieser Mapping-Methodik liegt in der Fähigkeit, eine vorhandene Struktur zu verwenden, um Standorte für die Kennzeichnung zu identifizieren. Diese Methodik kann nicht verwendet werden, um eine 3D-Struktur zu bestimmen; Die Bestimmung der Strukturelemente 56, die Verfeinerung .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health-Zuschuss R15GM135904 (verliehen an IM) und den National Institutes of Health Grant GM110552 (an DBO vergeben) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 490 nm LED-Laser | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimid//DIBO Alkinen | Life Technologies | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimid/DIBO Alkinen | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkinen | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra 4 Zentrifugalfilter (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodecylmaltosid (DDM) | Anatrace | D310< | |
| em>E. coli alkalisches Phosphatase-Signalpeptid SP22 | Biomoleküle Midwest | N/A | Synthetisiertes |
| kundenspezifisches Peptid mit erweitertem Signalpeptid SP41 | Biomoleküle Midwest | N/A | Synthetisiertes kundenspezifisches Produkt |
| FluorEssence | Horiba | Version 2.4 | Spektralaufnahmeprogramm für Fluoromax4 Spektrofluorometer |
| Fluoromax 4 Spektrofluorometer | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | Spektralanalyseprogramm für zeitaufgelöste Zerfälle | |
| H 4&schüchtern; Azido&schüchtern; Pheu & schüchtern; OH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Miller) Bouillon | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 kolloidales Siliciumdioxid (40 Gew.-% Suspension in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | Verdünnung ist erforderlich, um eine geeignete Streulösung herzustellen |
| PTI Felix GX | Horiba | Version 4.1.0.4096 | spektrales Erfassungsprogramm für PTI Time Master Instrument |
| PTI Time Master Instrument | Horiba | NA | |
| Pymol Molekulares Grafikprogramm | Schrödinger | Version 2.4 | |
| Wasserbad | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
Referenzen
- Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
- Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Cons....
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Nachdrucke und Genehmigungen
