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Methodenartikel

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

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DOI:

10.3791/63433

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16. März 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Studie beschreibt die Methodik der FRET-Kartierung, einschließlich der Auswahl der Markierungsstellen, der Auswahl der Farbstoffe, der Erfassung und der Datenanalyse. Diese Methodik ist effektiv bei der Bestimmung von Bindungsstellen, Konformationsänderungen und dynamischen Bewegungen in Proteinsystemen und ist am nützlichsten, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen 3D-Strukturinformationen durchgeführt wird.

Zusammenfassung

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist eine etablierte fluoreszenzbasierte Methode, mit der Abstände in und zwischen Biomolekülen sowohl in vitro als auch innerhalb von Zellen erfolgreich gemessen werden. In FRET bezieht sich die Effizienz der Energieübertragung, gemessen an Änderungen der Fluoreszenzintensität oder Lebensdauer, auf den Abstand zwischen zwei fluoreszierenden Molekülen oder Markierungen. Die Bestimmung von Dynamik und Konformationsänderungen aus den Entfernungen sind nur einige Beispiele für die Anwendung dieser Methode auf biologische Systeme. Unter bestimmten Bedingungen kann diese Methodik bestehende Röntgenkristallstrukturen ergänzen und verbessern, indem sie Informationen über Dynamik, Flexibilität und Anpassung an Bindungsoberflächen liefert. Wir beschreiben die Verwendung von FRET und zugehörigen Entfernungsbestimmungen zur Aufklärung struktureller Eigenschaften durch die Identifizierung einer Bindungsstelle oder der Orientierungen von Dimer-Untereinheiten. Durch die umsichtige Auswahl der Markierungsstellen und oft den Einsatz mehrerer Markierungsstrategien haben wir diese Mapping-Methoden erfolgreich angewendet, um globale strukturelle Eigenschaften in einem Protein-DNA-Komplex und dem SecA-SecYEG-Proteintranslokationssystem zu bestimmen. Im SecA-SecYEG-System haben wir FRET-Mapping-Methoden verwendet, um die Präproteinbindungsstelle zu identifizieren und die lokale Konformation der gebundenen Signalsequenzregion zu bestimmen. Diese Studie beschreibt die Schritte zur Durchführung von FRET-Mapping-Studien, einschließlich der Identifizierung geeigneter Markierungsstellen, der Diskussion möglicher Markierungen einschließlich nicht-nativer Aminosäurereste, der Markierungsverfahren, der Durchführung von Messungen und der Interpretation der Daten.

Einleitung

Für Proteine führt die Aufklärung der Dynamik zusammen mit 3-dimensionalem (3-D) Strukturwissen zu einem verbesserten Verständnis von Struktur-Funktions-Beziehungen biomolekularer Systeme. Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie und kryogene Elektronenmikroskopie erfassen eine statische Struktur und erfordern häufig die Bestimmung mehrerer Strukturen, um Aspekte der Biomolekülbindung und -dynamik aufzuklären1. In diesem Artikel wird eine lösungsbasierte Methode zum Zuordnen globaler Strukturelemente wie Bindungsstellen oder Bindungsinteraktionen erläutert, die potenziell vorübergehender sind und von statischen Methoden weniger leicht erfasst werden können. Starke Kandidatensysteme für diese Methodik sind solche, bei denen eine 3D-Struktur zuvor durch Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie oder andere Strukturmethoden bestimmt wurde. In diesem Fall nutzen wir die Röntgenkristallstruktur des SecA-SecYEG-Komplexes, einem zentralen Akteur im allgemeinen Sekretionsweg des Proteins, um die Position einer Signalpeptid-Bindungsstelle mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) vor dem Transport des Präproteins über die Membranabzubilden 2. Die Manipulation des biologischen Systems durch genetische Modifikationen in Verbindung mit unserem Wissen über die 3-D-Struktur ermöglichte die Bestimmung der Konformation der Signalsequenz und der frühen reifen Region unmittelbar vor dem Einfügen in den Kanal 3.

FRET beinhaltet die strahlungslose Übertragung von Energie von einem Molekül (Donor) zu einem anderen (Akzeptor) in einer entfernungsabhängigen Weise, die durch Raum 4,5 erfolgt. Die Effizienz dieses Transfers wird entweder durch eine Abnahme des Spenders oder eine Erhöhung der Akzeptorfluoreszenzintensität überwacht. Die Effizienz der Energieübertragung kann wie folgt beschrieben werden:

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

wobei derR0-Wert der Abstand ist, bei dem die Übertragung einen Wirkungsgradvon 50 % aufweist 6. Die Technik wurde zuvor als molekulares Lineal beschrieben und ist wirksam bei der Bestimmung von Abständen im Bereich von 2,5-12 nm, abhängig von der Identität der Spender-Akzeptor-Farbstoffe 4,7,8,9. Die Fluoreszenzintensitäten und Lebensdauern des Spenders mit oder ohne Akzeptor ermöglichen die Bestimmung der Transfereffizienzen und folglich der Abstände 5,8. Aufgrund der Verfügbarkeit der Technologie, der Empfindlichkeit der Methode und der Benutzerfreundlichkeit hat FRET auch breite Anwendung in Bereichen wie der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie und der konfokalen Mikroskopiegefunden 6. Das Aufkommen fluoreszierender Proteine wie grün fluoreszierendes Protein hat die Beobachtung der intrazellulären Dynamik und der Lebendzellbildgebung relativ einfach gemacht10,11. Viele FRET-Anwendungen wie diese werden in dieser virtuellen Ausgabe ausführlich diskutiert.

In dieser Studie konzentrieren wir uns insbesondere auf die Verwendung von FRET-Messungen, um Abstandswerte zur Bestimmung struktureller Details zu erhalten. Bisher wurden FRET-Messungen effektiv verwendet, um die Konformation von DNA-Molekülen zu bestimmen, wenn sie an Protein 12,13,14, die interne Dynamik von Proteinen und Proteinbindungsinteraktionen 15,16,17 gebunden sind. Die Vorteile dieser Methode liegen in der Fähigkeit, flexible und dynamische Strukturelemente in einer Lösung mit relativ geringen Materialmengen zu bestimmen. Bezeichnenderweise ist diese Methode besonders effektiv, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen Strukturinformationen verwendet wird, und kann nicht als Mittel zur 3D-Strukturbestimmung verwendet werden. Die Methode bietet den besten Einblick und die beste Verfeinerung der Struktur, wenn die Arbeit auf vorhandenen Strukturinformationen aufbaut, die häufig mit einer computergestützten Simulation gekoppelt sind18,19. Hierbei wird die Verwendung von Abständen beschrieben, die aus stationären und zeitaufgelösten FRET-Messungen gewonnen werden, um eine Bindungsstelle, deren Lage nicht bekannt war, auf einer bestehenden kristallographischen Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes, Hauptproteinen im allgemeinen sekretorischen Weg3, abzubilden.

Der allgemeine sekretorische Weg, ein hochkonserviertes System von Prokaryoten über Eukaryoten bis hin zu Archaeen, vermittelt den Transport von Proteinen entweder über oder in die Membran zu ihrem funktionellen Ort in der Zelle. Für gramnegative Bakterien, wie E. coli, den in unserer Studie verwendeten Organismus, werden Proteine in das Periplasma eingeführt oder über diese transloziert. Der bakterielle SecY-Kanalkomplex (Translokon genannt) koordiniert sich mit anderen Proteinen, um das neu synthetisierte Protein zu translozieren, das durch eine Signalsequenz, die sich typischerweise am N-Terminus20,21 befindet, zu seiner korrekten Position in der Zelle geleitet wird. Für Proteine, die für das Periplasma gebunden sind, assoziiert das ATPase SecA-Protein mit dem Austrittstunnel des Ribosoms und mit dem Präprotein, nachdem etwa 100 Reste transzitiert wurden22. Zusammen mit dem SecB-Chaperonprotein hält es das Präprotein in einem entfalteten Zustand. SecA bindet an den SecYEG-Translokon und erleichtert durch viele Zyklen der ATP-Hydrolyse den Proteintransport über die Membran23,24.

SecA ist ein Multi-Domain-Protein, das in zytosolischer und membrangebundener Form vorkommt. SecA ist ein homodimeres Protein im Zytosol und besteht aus einer Präproteinbindungs- oder Vernetzungsdomäne25, zwei Nukleotid-bindenden Domänen, einer helikalen Flügeldomäne, einer spiralförmigen Gerüstdomäne und dem Zwei-Helix-Finger (THF) 26,27,28,29 (Abbildung 1). In früheren kristallographischen Studien des SecA-SecYEG-Komplexes deutete die Lage des THF darauf hin, dass er aktiv an der Proteintranslokation beteiligt war, und nachfolgende Vernetzungsexperimente mit dem Signalpeptid belegten die Bedeutung dieser Region bei der Proteintranslokation30,31. Frühere Studien unter Verwendung der FRET-Mapping-Methodik zeigten, dass exogene Signalpeptide an diese Region von SecA 2,32 binden. Um die Konformation und Lage der Signalsequenz und der frühen reifen Region des Präproteins vor dem Einfügen in den SecYEG-Kanal vollständig zu verstehen, wurde eine Proteinchimäre erstellt, in der die Signalsequenz und die Reste der früh reifen Region durch einen Ser-Gly-Linker an SecA gebunden wurden (Abbildung 1). Unter Verwendung dieses biologisch lebensfähigen Konstrukts wurde weiter gezeigt, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins parallel an den THF binden2. Anschließend wurde die FRET-Mapping-Methodik verwendet, um die Konformation und Position der Signalsequenz und der frühen reifen Region in Gegenwart von SecYEG aufzuklären, wie untenbeschrieben 3.

Die Kenntnis der 3D-Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes33,34,35 und der möglichen Lage der Bindungsstelle ermöglichte es uns, Spender-Akzeptor-Etiketten umsichtig an Orten zu platzieren, an denen der Schnittpunkt einzelner FRET-Entfernungen den Standort der Bindungsstelle identifiziert. Diese FRET-Mapping-Messungen zeigten, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins eine Haarnadel bilden, wobei sich die Spitze an der Mündung des SecYEG-Kanals befindet, was zeigt, dass die Haarnadelstruktur vor dem Einfügen des Kanals mit einer Vorlage versehen ist.

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Protokoll

1. Auswahl der Kennzeichnungsstellen

  1. Identifizieren Sie mindestens drei potenzielle Markierungsstellen, um die mutmaßliche Bindungsstelle auf den vorhandenen Proteinstrukturen zu triangulieren. In diesem Fall wurden SecA, SecYEG und Präprotein, die durch genetische Fusion an SecA gebunden sind, identifiziert2.
    1. Wählen Sie Markierungsstellen innerhalb von 25-75 Å der mutmaßlichen Bindungsstelle und in relativ statischen Regionen des Proteins bestimmt der Abstand das spezifische FRET-Farbstoffpaar, das verwendet werdensoll 36. Lokalisieren Sie die Markierungsstellen in Proteinregionen, die sich relativ voneinander unterscheiden, so dass die Stellen die Eckpunkte eines Dreiecks mit der mutmaßlichen Bindungsstelle in der Mitte beschreiben (Abbildung 1A-D).
    2. Führen Sie Cysteinrückstände (Cys) an Markierungsstellen von Interesse in einem Protein ein, das keine anderen Cys-Rückstände enthält, um die Markierungseffizienz der spezifischen Stellezu verbessern 37,38.
    3. Unnatürliche Aminosäuren, z.B. p-Azidophenylalanin zur Markierung mit Klickchemie einführen, um ein Protein an zwei verschiedenen Positionen mit unterschiedlichen Farbstoffen effektiv zu markieren39,40.
    4. Testen Sie die Cys-Mutanten auf Funktionsverlust. Überprüfen Sie die Aktivität der Cys-losen Mutante und der unnatürlichen Aminosäuremutante mit einem geeigneten Aktivitätsassay. In diesem Fall wurde die Aktivität mit einem Wachstumsassay überprüft, gefolgt von einem in vitro Malachit-Green-ATPase-Assay32,41,42

2. Kennzeichnung des Proteins

  1. Reinigen Sie das Protein oder die Proteine von Interesse auf mindestens 95% Reinheit für eine genaue Markierung. Reinigen Sie SecA- und SecYEG-Proteine gemäß den in Referenz3 aufgeführten Protokollen. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 5 μg gereinigtes Protein für diesen Schritt haben, da während des Markierungsprozesses etwas Protein verloren geht.
  2. Wählen Sie zwei Farbstoffe für FRET-Messungen in Abhängigkeit von ihremR0-Wert und den vorhergesagten Abständen zwischen den markierten Standorten. SchätzenSie R0-Werte und beobachten Sie die Überlappung von Donoremission und Akzeptorabsorption unter Verwendung der Informationen aus der fluoreszierenden Proteindatenbank, die auch Spektren für häufig verwendete Farbstoffe liefert (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    HINWEIS: R 0 ist definiert als der Abstand, bei dem derÜbertragungswirkungsgrad für ein gegebenes Farbstoffpaar 50% beträgt. Für Mapping-Experimente sollten die vorhergesagten Entfernungen nahe demR0-Wert des Farbstoffpaares liegen, um sicherzustellen, dass die Entfernungen genau gemessen werden können.
  3. Beschriften Sie die in Schritt 1.1.1 identifizierten Positionen. mit dem Spender-Akzeptor-Farbstoffpaar.
    1. Kennzeichnen Sie das Protein gemäß den Anweisungen des Herstellers unter besonderer Berücksichtigung von Parametern wie optimaler Proteinkonzentration, Temperatur, pH-Wert, Zeitdauer und Puffer für die spezifischen verwendeten Farbstoffe43,44.
    2. Das Protein wird in einer Konzentration von 1-2 mg/ml oder etwa 10 μM in einem 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) Puffer hergestellt. Farbstoff in Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 1 mM auflösen. Fügen Sie den Farbstoff unter Rühren tropfenweise zur Lösung hinzu, um ein Farbstoff: Proteinmolverhältnis von 5:1 (50 μM Farbstoff: 10 μM Protein) zu erreichen.
    3. Lassen Sie die Reaktion 4 h bei Raumtemperatur (RT) in einem Glasfläschchen mit sanftem Schaukeln oder über Nacht bei 4 °C ablaufen. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie β-Mercaptoethanol hinzufügen.
      HINWEIS: Wenn Protein nicht mit Tris-Puffer kompatibel ist, können Phosphat- oder HEPES-Puffer verwendet werden. Halten Sie den pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,5 aufrecht. Wenn das Protein Disulfidbindungen aufweist, fügen Sie vor der Markierung ein Reduktionsmittel wie DTT oder TCEP hinzu. Entfernen Sie DTT durch Dialyse oder Gelfiltration, bevor Sie Farbstoff hinzufügen.
  4. Für genaue FRET-Messungen entfernen Sie den freien Farbstoff mit einem Zentrifugalkonzentrator mit einem geeigneten Molekulargewichts-Cut-off (MWCO), um den freien Farbstoff durchfließen zu lassen, während das markierte Protein erhalten bleibt.
    1. Bereiten Sie die Konzentratormembran vor, indem Sie ~ 1 ml Wasser in den oberen Teil eines 3-ml-Konzentrators geben und dann das Wasser durch die Membran zentrifugieren (mindestens 10 min bei 4.300 x g).
    2. Entfernen Sie den freien Farbstoff, indem Sie die markierte Probe im Konzentrator zentrifugieren (20 min bei 4.300 x g). Wiederholen Sie dies 3-4 Mal und entsorgen Sie den Durchfluss.
    3. Überprüfen Sie die Markierungseffizienz des markierten Proteins mithilfe der UV-Vis-Absorptionsspektroskopie.
      HINWEIS: FRET-Messungen erfordern Kennzeichnungswirkungsgrade von 50% oder mehr. Geringere Kennzeichnungseffizienzen reduzieren das FRET-Signal und können zu Ungenauigkeiten bei der Messung führen.
    4. Erhalten Sie ein UV-Vis-Spektrum des markierten Proteins mit einem Bereich von 250-700 nm, um sowohl das Proteinabsorptionsband als auch das maximale Farbstoffabsorptionsband zu beobachten. Messen Sie die Absorption an der Absorptionsspitze des Farbstoffs und bei 280 nm für Protein.
    5. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und korrigieren Sie alle Beiträge des Farbstoffs mit dem Korrekturfaktor CF und den folgenden Gleichungen45,46:
      figure-protocol-1
      wobei C die Konzentration des Proteins (M), A 280 die Probenabsorption bei 280 nm, A max die Absorption am Farbstoffabsorptionsmaximum, ε Protein der Extinktionskoeffizient für das Protein bei 280 nm und CF der Korrekturfaktor ist, A'280/A'max, wobei A'280 die Absorption bei 280 nm und A'max die Absorption am Peak-Maximum für den Farbstoff ist.
    6. Bestimmen Sie die Beschriftungseffizienz mithilfe der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-2
      wobei ε Farbstoff der molare Extinktionskoeffizient des Farbstoffs ist, C die Konzentration des Proteins gemäß Schritt 2.4.5 und E die Markierungseffizienz ist. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2, bis der Etikettiereffizienzwert ein Plateau erreicht hat und weniger als 100 % beträgt.

3. Ermitteln Sie die R0-Werte

  1. MessenSie die R0-Werte in situ. Bereiten Sie zwei Proteinproben mit der gleichen Konzentration des Gesamtproteins vor, 4 μM, eine mit dem Protein, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist, und eine mit dem Protein, das nur mit dem Akzeptorfarbstoff markiert ist. Für SecA eignet sich eine Proteinkonzentration von 4 μM SecA-Monomer gut für diese Messungen.
    1. Bereiten Sie Probenvolumina von 2,5 ml für eine 1 cm x 1 cm große Küvette, 600 μL für eine 5 mm x 5 mm Küvette oder 200 μL für eine 3 mm x 3 mm Küvette vor.
  2. Schalten Sie das Fluorometer ein und öffnen Sie das Spektralerfassungs- und Analyseprogramm in der Fluoreszenzsoftware, wenn Sie ein Spektrofluorometer verwenden. Klicken Sie auf das rote M, um den Computer mit dem Gerät zu verbinden (Abbildung 2A) und wählen Sie Emission Spectra.
    1. Geben Sie über den Menüpunkt "Experiment sammeln" Scanparameter wie die Anregungswellenlänge, den Bereich für den Emissionsscan, die Temperatur und die Position des Probenwechslers ein (Figure 2B).
    2. Klicken Sie auf RTC und optimieren Sie die Instrumenteneinstellungen (z. B. spektrale Schlitze), indem Sie die Fluoreszenzemission am Peak mit einer Anregungswellenlänge überwachen, die auf das Absorptionsmaximum des Farbstoffs eingestellt ist. Legen Sie für SecA die folgenden Einstellungen fest: Bandpass als 1 nm; Anregungs- und Emissionsschlitze als 1 bzw. 1,5 mm, wobei die Temperatur bei 25 °C und die Rührgeschwindigkeit bei 250 U/min liegen.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Anzahl pro Sekunde (cps) Kapazität des Instruments (typischerweise 2 x 106 cps).
  3. Legen Sie die vom Spender markierte Proteinprobe in den Probenhalter und klicken Sie auf Ausführen , um einen Emissionsscan des Proteins zu erstellen, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist (nur Spenderprotein), indem Sie die Probe am Farbstoffabsorptionsmaximum anregen (z. B. 488 nm für AF488) und über den Emissionspeak scannen (505-750 nm für SecA-Protein nur für Spender, das mit AF488 markiert ist).
  4. Legen Sie eine Baseline für den Scan fest, indem Sie den Scan um 25 bis 50 nm über das Ende des Peaks hinaus verlängern. Messen Sie die Quantenausbeute des reinen Spenderproteins, indem Sie Absorptions- und Fluoreszenzmessungen an Proben unterschiedlicher Konzentration durchführen, wie beschrieben47. Pflegen Sie die gleichen Spalteinstellungen für diese Messungen.
    1. Verwenden Sie freien Donorfarbstoff als Referenz für die Quantenausbeute. Erhalten Sie mindestens vier Messungen des reinen Spenderproteins und des freien Farbstoffs in verschiedenen Konzentrationen für eine genaue Bestimmung.
    2. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität oder den integrierten Bereich im Vergleich zur Absorption für das reine Spenderprotein und den freien Farbstoff oder die Referenz auf. Bestimmen Sie die Steigungen für das reine Spenderprotein (SteigungD) und die Referenz (SteigungR).
    3. Die Quantenausbeute (Φ) wird mit der folgenden Gleichung berechnet:
      figure-protocol-3
      hier ist Φ D die Quantenausbeute des reinen Donorproteins, Φ R ist die Quantenausbeute des freien Farbstoffs (diese kann in der Regel vom Hersteller bezogen werden), Steigung D und Steigung R sind die in Schritt 3.4.2 für das reine Donorprotein bzw. Referenz bestimmten Steigungen und η D und ηR stellen den Brechungsindex des reinen Spenderproteins bzw. der referenzfreien Farbstofflösungen dar 47.
  5. Erhalten Sie ein Absorptionsspektrum Ihres reinen Akzeptorproteins mit einer Zelllänge von 1 cm. Erzeugen Sie ein Extinktionskoeffizientenspektrum Ihres reinen Akzeptorproteins, indem Sie das Absorptionsspektrum durch die Farbstoffkonzentration dividieren.
  6. Erzeugen Sie das spektrale Überlappungsintegral J (λ) mit einem grafischen Analyseprogramm. Für diesen Prozess kann auch ein Standard-Arbeitsblattprogramm (z. B. Tabellenkalkulation) verwendet werden.
    1. Multiplizieren Sie das Fluoreszenzemissionsspektrum des reinen Donorproteins (Schritt 3.4) mit dem Extinktionskoeffizientenspektrum des reinen Akzeptorproteins, um das Überlappungsspektrum zu erzeugen.
    2. Multiplizieren Sie das resultierende Überlappungsspektrum mit λ4.
    3. Bestimmen Sie die Fläche unter der Kurve durch Integration des Überlappungsbereichs. Die Überlappungsregion ist definiert als der Bereich, in dem das Spenderemissionsspektrum multipliziert mit dem Akzeptorextinktionskoeffizientenspektrum positive Werte ergibt. Das spektrale Überlappungsintegral ist definiert als:
      figure-protocol-4
      wobei FD (λ) das Emissionsspektrum des reinen Donorproteins (erhalten in Schritt 3.4) und εA(λ) das Extinktionskoeffizientenspektrum des reinen Akzeptorproteins ist und Einheiten von M-1 cm-1(erhalten in Schritt 3.5) aufweist. Das resultierende spektrale Überlappungsintegral sollte Einheiten von M-1 cm-1nm 4 haben.
    4. Normalisieren Sie das spektrale Überlappungsintegral. Teilen Sie das Überlappungsintegral durch den integrierten Bereich des reinen Donorproteinspektrums über den gleichen Spektralbereich:
      figure-protocol-5
    5. Berechnen Sie den Wert R0 in Å mit der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-6
      wobei κ2 der Orientierungsfaktor ist, typischerweise als 2/3 für frei rotierende Farbstoffe, η der Brechungsindex ist und für verdünnte wässrige Lösungen als 1,33 angenähert werden kann, Q D die Quantenausbeute des Donors (Schritt 3.4) und J(λ) das spektrale Überlappungsintegral gemäß Schritt 3.6.35 ist. HINWEIS: Wenn sich die Farbstoffe nicht frei drehen, können Korrekturen eingeführt werden, wie von Ivanov 48 beschrieben und von Auclair49 und Zhang 2,3 implementiert.

4. Führen Sie FRET-Spektralmessungen durch

  1. Bereiten Sie Spenderprotein, reines Akzeptorprotein und Spender-Akzeptor-Proteinproben in der gleichen Konzentration vor; eine Konzentration von 4 μM wird empfohlen. Verwenden Sie 200 μL Lösung, wenn Sie eine 3 mm x 3 mm große Küvette verwenden, 600 μL bei Verwendung einer 5 mm x 5 mm Küvette oder 2,5 ml, wenn Sie eine 1 cm x 1 cm große Küvette verwenden.
    1. Bereiten Sie die Spender-Akzeptor-Proteinprobe vor, indem Sie gleiche molare Mengen des Spender-Only- und des Acceptor-Only-Proteins verwenden.
    2. Halten Sie die gleiche Menge der markierten Probe in Kontrollspender- und Akzeptor-Only-Proteinproben durch die Einführung von nicht markiertem Protein in gleicher molarer Menge entweder nur für den Spender oder nur für Akzeptorproben. Zum Beispiel würde für Lösungen mit der gleichen Konzentration jede FRET-Probe nur für Spender 100 μL Spenderprotein und 100 μL unmarkiertes Protein für ein Volumen von 200 μL enthalten.
  2. Erzeugen Sie Fluoreszenzemissionsspektren nur der Spender-, Akzeptor- und Spender-Akzeptor-Proben. Optimieren Sie das Signal wie in Schritt 3.2 beschrieben. Nach der Optimierung behalten Sie die gleichen Einstellungen für alle Stichproben bei.
    1. Holen Sie sich den Scan nur für Spender, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Erregen Sie die Lösung am maximalen Absorptionsmaximum des Spenderfarbstoffs und scannen Sie über die Spender- und (erwarteten) Akzeptoremissionsspitzen.
    2. Tauschen Sie entweder die Probe in das reine Akzeptorprotein aus oder ändern Sie die Position des Probenwechslers in die Küvette, die das reine Akzeptorprotein enthält.
    3. Sie erhalten einen Emissionsscan des Proteins, das nur mit Akzeptorfarbstoff (nur Akzeptorprotein) markiert ist, mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 4.2.1. Stimulieren Sie die Probe bei der Wellenlänge der Spenderanregung.
      HINWEIS: Dieses Spektrum liefert eine Korrektur für die Menge des Akzeptors, der bei der Spenderwellenlänge angeregt wird (FA in Schritt 5.1.2).
    4. Tauschen Sie die Probe in die Spender-Akzeptor-Proteinprobe aus oder ändern Sie die Position des Probenwechslers in die Küvette, die das mit dem Spender-Akzeptor markierte Protein enthält.
    5. Es wird ein Emissionsscan der Spender-Akzeptor-Proteinprobe mit den gleichen Einstellungen wie in den Schritten 4.2.1 und 4.2.3 durchgeführt.
    6. Korrigieren Sie für alle Spektren die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die am Ende des Scans gemessenen Hintergrundzahlen subtrahieren.
  3. Messen Sie nur die Lebensdauer des Spenders und die Spender-Annahme-Proben, die wie in Schritt 4.1.2 beschrieben hergestellt wurden. Verwenden Sie ein zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zähl-Fluoreszenzinstrument, das in der Lage ist, fluoreszierende Zerfälle im Nanosekunden-Zeitbereich (10-9 s) zu messen und aufzulösen.
    HINWEIS: Passen Sie bei FRET-Farbstoffpaaren die Anregungslichtquelle an das Absorptionsmaximum des Spenderfarbstoffs an.
    1. Schalten Sie das Instrument ein. Öffnen Sie die Erfassungssoftware, verwenden Sie die Gerätesteuerungssoftware für die Datenerfassung mit dem Fluoreszenzspektrometer.
    2. Wählen Sie für die Erfassung TCSPC Decay mit einem Zeitbereich von 55 ns, einer Verstärkung von 1 und 4096 Kanälen.
    3. Erhalten Sie eine Instrumentenreaktionsfunktion (IRF) unter Verwendung einer Lösung von Nicht-Milchkännchen oder kommerzieller Streulösung und überwachen Sie die Streuung bei 490 nm. Passen Sie die Spalteinstellung an und verwenden Sie bei Bedarf Neutraldichtefilter, um eine ausreichend niedrige Zählrate aufrechtzuerhalten, um eine Impulsstapelungzu vermeiden 5. Klicken Sie auf Akzeptieren und dann auf Starten. Damit wird die Akquisition beginnen.
      HINWEIS: Für eine Wiederholungsrate von 180 kHz wird eine maximale Zählrate von 4000 cps verwendet.
    4. Sammeln Sie den IRF bei 490 nm, bis der Spitzenkanal maximal 20.000 Zähler aufweist. Sammeln Sie einen IRF vor und nach der Messung jedes Fluoreszenzzerfalls.
    5. Erhalten Sie die Fluoreszenzzerfälle nur des Spenders und der Spender-Akzeptor-Proben, indem Sie die Fluoreszenzemission bei der Spenderemissionswellenlänge von 520 nm überwachen.
    6. Passen Sie die Spalteinstellungen für eine maximale Zählrate von 4000 cps oder weniger an. Die Spalteinstellungen sind typischerweise 15-20 nm Bandpass für Proteinproben. Sammeln Sie den Zerfall, bis 20.000 Zählungen im Peakkanal erhalten sind.
  4. Analysieren Sie den Zerfall oder die Fluoreszenzintensität ( I ) als Funktion der Zeit ( t) für die Fluoreszenzlebensdauer (τ). Passen Sie den Zerfall mit der folgenden Gleichung an eine Summe von Exponentialen an:
    figure-protocol-7
    wobei α I der präexponentielle Faktor der i-ten Komponente und τ I die Lebensdauer ist. Die Passform wird mit dem IRF neu verwoben, um dem Fluoreszenzzerfall zu entsprechen. Beurteilen Sie die Qualität der Passform anhand der reduzierten Parameter Χ2.

5. Analyse von FRET-Daten

  1. Berechnen Sie die FRET-Effizienz aus der Abnahme der Spenderintensität der Spender-Akzeptor-Stichprobe relativ zum Spender nur mit der folgenden Gleichung.
    figure-protocol-8
    wobei FDA die Fluoreszenzintensität der Spender-Akzeptor-Probe und FD die Fluoreszenzintensität der Spenderprobe auf dem Höhepunkt der Spenderfluoreszenz ist. Verwenden Sie die integrierten Bereiche der Peaks, wenn die Daten verrauscht sind.
    1. Korrigieren Sie alle Unterschiede in der Kennzeichnung zwischen der Spender-Only- und der Spender-Akzeptor-Probe. Berechnen Sie Korrekturen basierend auf dem Spendergrad der Kennzeichnung wie folgt.
      figure-protocol-9
      wobei f DA die Spenderkennzeichnungseffizienz in der Spender-Akzeptor-Probe und fD die Etikettierungseffizienz in der reinen Spenderprobe ist.
    2. Korrigieren Sie alle Beiträge der Akzeptorfluoreszenz zum Donor-angeregten Spektrum durch Subtraktion des reinen Akzeptor-Proteinspektrums (Schritt 4.2) vom Spender-Akzeptor-Proteinspektrum.
      figure-protocol-10
    3. Korrigieren Sie die Unterschiede in der Markierungseffizienz des Akzeptorproteins relativ zur Spender-Akzeptor-Proteinprobe, was die folgende Gleichung für die Berechnung der Effizienz ergibt:
      figure-protocol-11
      wobei fA den Bruchteil der Akzeptorkennzeichnung bezeichnet. Diese Gleichung umfasst alle Korrekturen aufgrund der Farbstoffmarkierung und Akzeptorfluoreszenz.
    4. Berechnen Sie FRET-Abstände aus den Wirkungsgraden mit der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-12
      unter Verwendung des in Schritt 3.6.5 erhaltenen R0-Werts.
    5. Berechnen Sie die FRET-Effizienz unter Verwendung der Fluoreszenzlebensdauer nur des Spenders und der in Schritt 4.3.3-4.3.5 gemessenen Spender-Akzeptor-Proben:
      figure-protocol-13
    6. Verwenden Sie die amplitudengewichtete Lebensdauer, um FRET-Wirkungsgrade zu berechnen und mit stationären Ergebnissenzu vergleichen 5.
      figure-protocol-14
    7. Berechnen Sie den Abstand wie in Schritt 5.1.4 von den Wirkungsgraden, die durch die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt werden. Vergleichen Sie stationäre und zeitaufgelöste Werte für FRET-Wirkungsgrade und -Entfernungen und stellen Sie sicher, dass sie innerhalb des Fehlers voneinander liegen.

6. Kartierung der Entfernungen

  1. Verwenden Sie die berechneten Entfernungen, um die Bindungsstelle auf der dreidimensionalen Struktur abzubilden. Berechnen Sie die Abstände und Fehler für alle untersuchten Farbstoffpaare und -stellen unter Verwendung der in Schritt 5.1.4 angegebenen Gleichung undR0-Werte, die in Schritt 3.6.5 für jedes FRET-Paar erhalten wurden.
    1. Verwenden Sie ein grafisches 3D-Anzeigeprogramm wie PyMOL50, um die Entfernungen auf die Struktur abzubilden (Skript in der Zusatzdatei angegeben). Befehle aus dem Skript können direkt in das Befehlsfenster mit den entsprechenden Entfernungsinformationen eingegeben werden.
    2. Generieren Sie eine Shell für jede gemessene Entfernung und den zugehörigen Fehler (Abbildung 3, Abbildung 4, Ergänzende Abbildungen 1-3).
    3. Bilden Sie die Position durch den Schnittpunkt der verschiedenen Schalen ab (Ergänzende Abbildungen 1-3). Die Signalpeptid-Bindungsstelle wurde durch die drei verschiedenen Positionen auf SecA und SecYEG und vier verschiedene Positionen auf dem Signalpeptid abgebildet (Abbildung 1).

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Ergebnisse

Diese Studie konzentrierte sich auf die Bestimmung der Position der Präproteinbindungsstelle auf SecA vor dem Einfügen des Präproteins in den SecYEG-Kanal. Um die Bindungsstelle zu kartieren, wurden FRET-Experimente zwischen verschiedenen Regionen des Präproteins und drei verschiedenen Stellen an den Proteinen SecA und SecYEG durchgeführt (Abbildung 1A-D). Aus den erhaltenen Entfernungen und dreidimensionalen Strukturen von SecA, SecYEG und dem Präprotein wu...

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Diskussion

Durch die Verwendung der FRET-Mapping-Methodik identifizierten wir die Signalsequenz-Bindungsstelle auf dem SecA-Protein. Wichtig ist, dass das Vorhandensein einer 3D-Kristallstruktur des Komplexes unsere Studie erheblich erleichtert hat. Die Stärke dieser Mapping-Methodik liegt in der Fähigkeit, eine vorhandene Struktur zu verwenden, um Standorte für die Kennzeichnung zu identifizieren. Diese Methodik kann nicht verwendet werden, um eine 3D-Struktur zu bestimmen; Die Bestimmung der Strukturelemente 56, die Verfeinerung ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health-Zuschuss R15GM135904 (verliehen an IM) und den National Institutes of Health Grant GM110552 (an DBO vergeben) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
490 nm LED-LaserHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimid//DIBO AlkinenLife TechnologiesA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimid/DIBO AlkinenLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkinenLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­ 4 Zentrifugalfilter (50kDa MWCO)SigmaUFC805008
Dodecylmaltosid (DDM)AnatraceD310<
em>E. coli alkalisches Phosphatase-Signalpeptid SP22Biomoleküle MidwestN/ASynthetisiertes
kundenspezifisches Peptid mit erweitertem Signalpeptid SP41Biomoleküle MidwestN/ASynthetisiertes kundenspezifisches Produkt
FluorEssenceHoribaVersion 2.4Spektralaufnahmeprogramm für Fluoromax4 Spektrofluorometer
Fluoromax 4 SpektrofluorometerHoribaN/A
GlobalsWELaboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, IrvineSpektralanalyseprogramm für zeitaufgelöste Zerfälle
H­ 4&schüchtern; Azido&schüchtern; Pheu & schüchtern; OHBACHEM4020250.0001
LB (Miller) BouillonFisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 kolloidales Siliciumdioxid (40 Gew.-% Suspension in H2O)Sigma-Aldrich420816Verdünnung ist erforderlich, um eine geeignete Streulösung herzustellen
PTI Felix GXHoribaVersion 4.1.0.4096spektrales Erfassungsprogramm für PTI Time Master Instrument
PTI Time Master InstrumentHoribaNA
Pymol Molekulares GrafikprogrammSchrödingerVersion 2.4
WasserbadThermo ScientificNESLAB RTE 10

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FRET MappingAnalyse der ProteinstrukturLigandenbindungsstelleProteinmarkierungFluoreszenzspektroskopieDonor Akzeptor PaarQuantenausbeutemessungProtein DNA KomplexSecA SecYEG System
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale
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