Methodenartikel

Ein In-vitro-Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Dysfunktion: Ein Cybrid-Modell

DOI:

10.3791/63452

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9. März 2022

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1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Transmitochondriale Cybride sind Hybridzellen, die durch Verschmelzung von mitochondrialen DNA (mtDNA)-deplementierten Zellen (rho0-Zellen ) mit Zytoplasten (enukleierten Zellen) von Patienten mit mitochondrialen Störungen erhalten werden. Sie ermöglichen die Bestimmung des nuklearen oder mitochondrialen Ursprungs der Krankheit, die Bewertung der biochemischen Aktivität und die Bestätigung der pathogenetischen Rolle von mtDNA-bezogenen Varianten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Mangel an den mitochondrialen Atmungskettenkomplexen, die eine oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) durchführen, ist der biochemische Marker für mitochondriale Erkrankungen beim Menschen. Aus genetischer Sicht stellt der OXPHOS ein einzigartiges Beispiel dar, da er aus der Komplementarität zweier unterschiedlicher genetischer Systeme resultiert: Kern-DNA (nDNA) und mitochondrialer DNA (mtDNA). Daher können OXPHOS-Defekte auf Mutationen zurückzuführen sein, die nukleäre und mitochondriale kodierte Gene betreffen.

Die bahnbrechende Arbeit von King und Attardi, die 1989 veröffentlicht wurde, zeigte, dass menschliche Zelllinien, die von mtDNA (genannt Rho0) erschöpft waren, von exogenen Mitochondrien wieder besiedelt werden konnten, um die sogenannten "transmitochondrialen Cybrids" zu erhalten. Dank dieser Cybriden, die Mitochondrien enthalten, die von Patienten mit mitochondrialen Störungen (MDs) und Kernen ausRho-0-Zellen stammen, kann überprüft werden, ob ein Defekt mtDNA- oder nDNA-bezogen ist. Diese Cybriden sind auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Pathogenität einer Mutation zu validieren und ihre Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen. Dieses Dokument enthält ein detailliertes Protokoll, das die Generierung, Auswahl und Charakterisierung von Cybrid beschreibt.

Einleitung

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Mitochondriale Störungen (MDs) sind eine Gruppe von Multisystemsyndromen, die durch eine Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen aufgrund von Mutationen entweder in der Kern- (nDNA) oder der mitochondrialen (mtDNA) DNA1 verursacht werden. Sie gehören mit einer Prävalenz von 1:5.000 zu den häufigsten vererbten Stoffwechselerkrankungen. mtDNA-assoziierte Erkrankungen folgen den Regeln der mitochondrialen Genetik: mütterliche Vererbung, Heteroplasmie und Schwelleneffekt sowie mitotische Segregation2. Human mtDNA ist ein doppelsträngiger DNA-Kreis von 16,6 kb, der eine kurze Kontrollregion mit Sequenzen enthält, die für die Replikation und Transkription benötigt werden, 13 proteinkodierende Gene (alle Untereinheiten der Atmungskette), 22 tRNA und 2 rRNA-Gene3.

Bei gesunden Personen gibt es einen einzigen mtDNA-Genotyp (Homoplasmatik), während mehr als ein Genotyp unter pathologischen Zuständen koexistiert (Heteroplasmie). Schädliche heteroplasmatische Mutationen müssen eine kritische Schwelle überwinden, um OXPHOS zu stören und Krankheiten zu verursachen, die jedes Organ in jedem Alterbetreffen können 4. Die duale Genetik von OXPHOS diktiert die Vererbung: autosomal-rezessiv oder dominant und X-chromosomal für nDNA-Mutationen, mütterlich für mtDNA-Mutationen sowie sporadische Fälle sowohl für nDNA als auch für mtDNA.

Zu Beginn der Ära der mitochondrialen Medizin schuf ein bahnbrechendes Experiment von King und Attardi5 die Grundlage, um den Ursprung einer Mutation zu verstehen, die für einen MD verantwortlich ist, indem Hybridzellen geschaffen wurden, die Kerne aus Tumorzelllinien enthielten, in denen mtDNA vollständig erschöpft war (rho 0-Zellen) und Mitochondrien von Patienten mit MDs. Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) waren zu diesem Zeitpunkt noch nicht verfügbar. Und es war nicht einfach festzustellen, ob eine Mutation im nuklearen oder mitochondrialen Genom vorhanden war. Die 1989 beschriebene Methode wurde dann von mehreren Forschern verwendet, die auf dem Gebiet der mitochondrialen Medizin arbeiteten 6,7,8,9; Ein detailliertes Protokoll wurde kürzlichveröffentlicht 10, aber es wurde noch kein Video gemacht. Warum sollte ein solches Protokoll heutzutage relevant sein, wenn NGS genau und schnell identifizieren könnte, wo sich eine Mutation befindet? Die Antwort ist, dass die Cybrid-Erzeugung immer noch das State-of-the-Art-Protokoll ist, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mtDNA-Mutation zu verstehen, den Prozentsatz der Heteroplasmie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren und eine biochemische Untersuchung in einem homogenen Kernsystem durchzuführen, in dem der Beitrag des autochthonen nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt11, 12,13

Dieses Protokoll beschreibt, wie man Zytoplasten aus konfluierenden, von Patienten abgeleiteten Fibroblasten erhält, die in 35-mm-Petrischalen gezüchtet werden. Die Zentrifugation der Schalen in Gegenwart von Cytochalasin B ermöglicht die Isolierung von enukleierten Zytoplasten, die dann in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) mit Rho-0-Zellen verschmolzen werden. Die resultierenden Cybriden werden dann in selektivem Medium kultiviert, bis Klone entstehen. Der Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" zeigt ein Beispiel für die molekulare Charakterisierung der resultierenden Cybrids, um zu beweisen, dass die mtDNA mit der der Fibroblasten der Spenderpatienten identisch ist und dass die nDNA mit der Kern-DNA der tumoralenRho-0-Zelllinie identisch ist.

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Protokoll

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HINWEIS: Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann eine ethische Genehmigung erfordern. Die in dieser Studie verwendeten Fibroblasten wurden von MD-Patienten abgeleitet und in der institutionellen Biobank in Übereinstimmung mit ethischen Anforderungen gespeichert. Für die Nutzung der Zellen wurde eine Einwilligung nach Aufklärung erteilt. Führen Sie alle Zellkulturverfahren unter einem sterilen Laminar-Flow-Schrank bei Raumtemperatur (RT, 22-25 °C) durch. Verwenden Sie steril gefilterte Lösungen, die für Zellkultur- und Sterilanlagen geeignet sind. Züchten Sie alle Zelllinien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2. Mykoplasmentests sollten wöchentlich durchgeführt werden, um mykoplasmenfreie Kulturen zu gewährleisten. 143BTK- rho0 Zellen können wie zuvor beschriebenerzeugt werden 5.

1. Kultur von Zellen

  1. Bevor Sie mit einem Verfahren beginnen, überprüfen Sie das Vorhandensein der Mutation in Fibroblasten, die von MD-Patienten abgeleitet wurden, und quantifizieren Sie den Prozentsatz der Heteroplasmie oder Homoplasmie durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) und / oder ganze mtDNA-Sequenzierungsanalysen14.
  2. Samenfibroblasten in vier 35-mm-Petrischalen mit jeweils 2 ml Complete Culture Medium (Tabelle 1). Lassen Sie die Zellen wachsen, bis 80% konfluent (48 h).
  3. Züchten Sie143BTK- rho 0 Zellen in 8 ml Supplementiertem Kulturmedium (Tabelle 1) in einer 100 mm Petrischale.
  4. Die Zellen werden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 gehalten.
  5. Überprüfen Sie das Fehlen von mtDNA in rho0-Zellen durch Sequenzierungstechniken14.

2. Enukleation von Fibroblasten

  1. Sterilisieren Sie vier zentrifugentaugliche 250-ml-Flaschen durch Autoklav-Sterilisation bei 121 °C für einen 20-minütigen Zyklus. Trocknen Sie sie im Laborofen oder bei RT.
  2. Die Zentrifuge bei 37 °C vorwärmen.
  3. Waschen Sie das 35-mm-Geschirr, das die Fibroblasten enthält, zweimal mit 2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne (ohne Kalzium und Magnesium).
  4. Reinigen Sie die Außenfläche des Geschirrs mit 70% Ethanol und warten Sie, bis der Alkohol verdunstet.
  5. Entfernen Sie die Deckel vom Geschirr und die Schraubverschlüsse von den Flaschen. Stellen Sie jedes Gericht ohne Deckel kopfüber auf den Boden jeder 250 ml Zentrifugenflasche.
  6. Geben Sie langsam 32 ml Enukleationsmedium in jede Flasche (Tabelle 1), so dass das Medium in die Schale eindringen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann. Entfernen Sie alle Blasen aus dem Geschirr mit einer langen Pasteur-Pipette aus Glas und krümmen Sie die Spitze in einer Bunsenflamme.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Blasen zu entfernen, damit das Medium in die Schale eindringen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann.
  7. Verschließen Sie jede Flasche mit dem Schraubverschluss und geben Sie sie in die Zentrifuge.
  8. Zentrifuge für 20 min bei 37 °C und 8.000 × g, Max. Beschleunigung, Verzögerung langsam. Achten Sie darauf, die Zentrifuge auszugleichen: Gegengewicht jeder Flasche. Falls erforderlich, passen Sie das Gewicht an, indem Sie ein geeignetes Volumen Enukleationsmedium hinzufügen.
  9. Verwenden Sie während der Zentrifugation Vakuum oder eine serologische 10-ml-Pipette, um das Medium aus den 143BTK-rho 0-Kulturplatten abzusaugen und zu entsorgen und sie zweimal mit 4 ml 1x PBS ohne Kalzium und Magnesium zu waschen.
  10. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu, um die Zell-Monoschicht vollständig abzudecken.
  11. Das Geschirr für ~2 min in einen 37 °C Inkubator geben.
  12. Entfernen Sie die Schalen aus dem Inkubator, beobachten Sie die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen (Ziele 4x oder 10x) und hemmen Sie die Enzymaktivität durch Zugabe von 2 ml Supplementiertem Kulturmedium.
  13. Die 4 ml der Zellsuspension in der Schale mit einer 10 ml Pipette absaugen und in ein 15 mL konisches Rohr geben.
  14. Zählen Sie die Zellen mit einer Burker Hämozytometerkammer oder einem automatisierten Zähler.
  15. Am Ende der Zentrifugation (Schritt 2.8) wird das Medium aus den Flaschen abgesaugt und entsorgt.
  16. Entfernen Sie das Geschirr, indem Sie die Flaschen auf einer sterilen Gaze umdrehen, die zuvor mit 70% Ethanol besprüht wurde. Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs und seiner Deckel mit 70% Ethanol. Warten Sie, bis der Alkohol verdunstet ist, und schließen Sie dann das Geschirr.
  17. Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie die Cytoplast (Geister-) Bildung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen (Ziel 4x oder 10x). Suchen Sie nach extrem länglichen Fibroblasten aufgrund der Extrusion ihrer Kerne, die durch Cytochalasin B induziert werden.
  18. Zu jeder 35-mm-Schale fügen Sie 1 × 10 6 von 143BTK- rho 0-Zellen hinzu, die in 2 ml 143BTK- rho 0-Kulturmedium resuspendiert sind, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS).
  19. Das Geschirr 3 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 stehen lassen und die 143BTK- rho 0 Zellen auf den Geistern absetzen lassen. Stören Sie das Geschirr nicht.

3. Fusion der enukleierten Fibroblasten mit Rho-0-Zellen

  1. Nach 3 Stunden Inkubation das Medium absaugen und aus dem Geschirr entsorgen.
  2. Waschen Sie die adhärenten Zellen zweimal mit 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hoher Glukose ohne Serum oder mit Minimum Essential Medium (MEM).
  3. Saugen Sie das Medium ab und verwerfen Sie es.
  4. Geben Sie 500 μL PEG-Lösung (siehe Materialtabelle) in die Zellen und inkubieren Sie für genau 1 min.
  5. Saugen Sie die PEG-Lösung an, und verwerfen Sie sie.
  6. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 2 ml DMEM-hoher Glukose ohne Serum oder mit MEM.
  7. 2 ml Fusionsmedium zugeben (Tabelle 1) und über Nacht im Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 inkubieren.

4. Cybrid-Auswahl und -Erweiterung

  1. Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht die Platten aus dem Inkubator, trypsinisieren Sie die Zellen wie oben beschrieben (Schritte 2.9-2.13) und übertragen Sie den Inhalt jeder 35-mm-Schale in eine 100-mm-Schale.
  2. 8 ml Auswahlmedium hinzufügen (Tabelle 1) und die Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 in den Inkubator stellen.
  3. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
  4. Warten Sie ~ 10-15 Tage der Selektion, bis Kolonien von Zellen erscheinen.
  5. Frieren Sie eine der vier Petrischalen ein, indem Sie alle Klone sammeln und eine "massive" Kultur als Backup der Cybriden erzeugen, die schließlich neu geklont und für weitere Untersuchungen verwendet werden kann.
  6. Trypsinisieren Sie die Zellen in den verbleibenden Kulturschalen, zählen und säen Sie sie in eine oder mehrere Petrischalen bei 50-100 Zellen / Schale im ergänzten Kulturmedium (Tabelle 1), bis Klone erscheinen. Lassen Sie sie für einige Tage wachsen.
  7. Pelletieren Sie die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation bei 1.200 × g für 3 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand.
  8. Extrahieren Sie DNA aus dem Pellet (siehe Materialtabelle).
  9. Führen Sie eine Genotypisierung nach variabler Anzahl der parallel wiederholten (VNTR) Analysen durch, wie zuvor berichtet15.
  10. Nehmen Sie Klone aus der Petrischale mit Klonierungszylindern oder einer Pipettenspitze auf, indem Sie ein Stereomikroskop verwenden, um das Pooling verschiedener Klone zu vermeiden, und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte, die jeweils 200 μL ergänztes Kulturmedium enthält (Tabelle 1).
  11. Erweitern Sie jeden Klon, bis genügend Zellen zum Einfrieren und Extrahieren von DNA vorhanden sind.
  12. Überprüfen Sie den Mutationsprozentsatz jedes Klons durch RFLP oder andere Sequenzierungsmethoden. Versuchen Sie idealerweise, sowohl Klone mit Wildtyp-mtDNA (0% Mutation) als auch Klone mit unterschiedlichen Mutationsprozentsätzen zu erhalten, die sich beide zu homoplasmatischer mutierter mtDNA (100% Mutation) addieren. In Abbildung 1 finden Sie ein schematisches Diagramm des Cybrid-Generierungsprotokolls.

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Ergebnisse

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Die Erzeugung von Cybriden erfordert 3 Tage Laborarbeit plus eine Selektionszeit (~ 2 Wochen) und zusätzliche 1-2 Wochen für das Wachstum von Klonen. Die kritischen Schritte sind die Qualität der Zytoplasten und der Selektionszeitraum. Die Morphologie der Cybriden ähnelt der derrho-0-Spenderzellen. Die Zuordnung der korrekten mtDNA und nDNA in den Cybriden ist zwingend erforderlich, um die Identität der Zellen zu bestätigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 dargestellt. In diesem F...

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Diskussion

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Die mtDNA hat eine sehr hohe Mutationsrate im Vergleich zu nDNA aufgrund des Mangels an schützenden Histonen und ihrer Lage in der Nähe der Atmungskette, die das Molekül schädlichen oxidativen Effekten aussetzt, denen die Reparatursysteme nicht wirksam entgegenwirken16. Die ersten pathogenen mtDNA-Mutationen wurden1988 identifiziert 17,18, und seitdem wurde eine große Anzahl von Mutationen beschrieben. Die NGS-Technologie ist ein relevante...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Studie wurde im Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org) durchgeführt, das von der Mariani Foundation finanziert wird. VT ist Mitglied des European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-Bromo-2'-DesoxyuridinSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6-Well-PlattenCorning3516
96-Well-PlattenCorning3596
Blut- und Zellkultur-DNA-ExtraktionskitQIAGEN13323
ZentrifugeBeckman CoulterAvanti J-257.200 rcf, 37 ° C
Zentrifugenflaschen, 250 mLBeckman Coulter356011
Cytochalasin B von Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
dialysiert FBSGibco26400-036 100mL
DMEM High Glucose (ohne L-Glutamin w/Sodium Pyruvat)EuroCloneECB7501L
Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung - PBS (w/ EuroCloneECB4004L
Ethanol absolut wasserfreiCarlo Erba414601
FetalClone III (Rinderserumprodukt)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
GlaspasteurpipettenVWRM4150NO250SP4
Inverses Forschungsmikroskop für die LebendzellmikroskopieNikonECLIPSE TE200
JA-14 Aluminiumrotor mit festem WinkelBeckman Coulter339247
Laborautoklav Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutamin 200 mM (100x)EuroCloneECB 3000D
Minimum Essential Medium MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonzaLT07-318
PEG (Polyethylen-Glicol-Lösung)Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (Lösung 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC Schalen 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC Schalen 35 mmEuroCloneET2035
Natriumpyruvat 100 mMEuroCloneECM0542D
StereomikroskopNikonSMZ1000
Trypsin 2,5% in HBSSEuroCloneECB3051D
UridinSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

Referenzen

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  1. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
  2. DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
  3. El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  6. Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
  7. Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
  8. Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
  9. Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).
  10. Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
  11. Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
  12. Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).
  13. Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).
  14. Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
  15. Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
  16. Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061(2020).
  17. Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
  18. Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
  19. Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
  20. Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).
  21. Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
  22. Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
  23. Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
  24. Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591(2020).
  25. Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
  26. Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
  27. Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
  28. Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).

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Mitochondriale DNA Mutationoxidative PhosphorylierungAtmungskettenkomplexeCybrid GenerierungHeteroplasmie AnalyseFibroblastenfusionRestriktionsfragmentanalysemitochondriale Myopathie

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