Summary
Transmitochondriala cybrider är hybridceller erhållna genom att smälta mitokondriellt DNA (mtDNA) -utarmade celler (rho0-celler ) med cytoplaster (enukleerade celler) härrörande från patienter som drabbats av mitokondriella störningar. De möjliggör bestämning av sjukdomens nukleära eller mitokondriella ursprung, utvärdering av biokemisk aktivitet och bekräftelse av den patogenetiska rollen hos mtDNA-relaterade varianter.
Abstract
Brist på mitokondriella andningskedjekomplex som utför oxidativ fosforylering (OXPHOS) är den biokemiska markören för humana mitokondriella störningar. Ur genetisk synvinkel representerar OXPHOS ett unikt exempel eftersom det härrör från komplementeringen av två distinkta genetiska system: kärn-DNA (nDNA) och mitokondriellt DNA (mtDNA). Därför kan OXPHOS-defekter bero på mutationer som påverkar kärn- och mitokondriella kodade gener.
Det banbrytande arbetet av King och Attardi, som publicerades 1989, visade att mänskliga cellinjer utarmade av mtDNA (kallad rho0) kunde återbefolkas av exogena mitokondrier för att erhålla de så kallade "transmitochondriala cybriderna". Tack vare dessa cybrider som innehåller mitokondrier härrörande från patienter med mitokondriella störningar (MD) och kärnor från rho0-celler är det möjligt att verifiera om en defekt är mtDNA- eller nDNA-relaterad. Dessa cybrider är också ett kraftfullt verktyg för att validera patogeniciteten hos en mutation och studera dess inverkan på biokemisk nivå. Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll som beskriver cybridgenerering, urval och karakterisering.
Introduction
Mitokondriella störningar (MD) är en grupp multisystemsyndrom som orsakas av en försämring av mitokondriella funktioner på grund av mutationer i antingen nukleärt (nDNA) eller mitokondriellt (mtDNA) DNA1. De är bland de vanligaste ärftliga metaboliska sjukdomarna, med en prevalens på 1: 5000. mtDNA-associerade sjukdomar följer reglerna för mitokondriell genetik: moderns arv, heteroplasma och tröskeleffekt och mitotisk segregering2. Humant mtDNA är en dubbelsträngad DNA-cirkel på 16,6 kb, som innehåller en kort kontrollregion med sekvenser som behövs för replikation och transkription, 13 proteinkodande gener (alla subenheter i andningskedjan), 22 tRNA och 2 rRNA-gener3.
Hos friska individer finns det en enda mtDNA-genotyp (homoplasi), medan mer än en genotyp samexisterar (heteroplasmi) vid patologiska tillstånd. Skadliga heteroplasmatiska mutationer måste övervinna en kritisk tröskel för att störa OXPHOS och orsaka sjukdomar som kan påverka alla organ vid alla åldrar4. Oxphos dubbla genetik dikterar arv: autosomalt recessivt eller dominerande och X-länkat för nDNA-mutationer, moder för mtDNA-mutationer, plus sporadiska fall både för nDNA och mtDNA.
I början av mitokondriell medicin era, ett landmärke experiment av King och Attardi5 etablerade grunden för att förstå ursprunget till en mutation som är ansvarig för en MD genom att skapa hybridceller som innehåller kärnor från tumörcellinjer där mtDNA var helt utarmat (rho0-celler) och mitokondrier från patienter med MD. Nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) var inte tillgängliga vid den tiden, och det var inte lätt att avgöra om en mutation var närvarande i kärn- eller mitokondriellt genom. Metoden, som beskrevs 1989, användes sedan av flera forskare som arbetar inom mitokondriell medicin 6,7,8,9; ett detaljerat protokoll har nyligen publicerats10, men ingen video har gjorts ännu. Varför skulle ett sådant protokoll vara relevant idag när NGS exakt och snabbt kunde identifiera var en mutation finns? Svaret är att cybridgenerering fortfarande är det senaste protokollet för att förstå den patogena rollen hos någon ny mtDNA-mutation, korrelera andelen heteroplasmi med svårighetsgraden av sjukdomen och utföra en biokemisk undersökning i ett homogent kärnsystem där bidraget från patientens autoktona kärnbakgrund är frånvarande11, 12,13.
Detta protokoll beskriver hur man erhåller cytoplaster från sammanflytande, patienthärledda fibroblaster odlade i 35 mm petriskålar. Centrifugering av diskarna i närvaro av cytokalasin B möjliggör isolering av enukleerade cytoplaster, vilka sedan smälts med rho0-celler i närvaro av polyetylenglykol (PEG). De resulterande cybriderna odlas sedan i selektivt medium tills kloner uppstår. Det representativa resultatavsnittet visar ett exempel på molekylär karakterisering av de resulterande cybriderna för att bevisa att mtDNA är identiskt med det hos givarpatienternas fibroblaster och att nDNA är identiskt med kärn-DNA i tumöral rho 0-cellinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Användningen av humana fibroblaster kan kräva etiskt godkännande. Fibroblaster som användes i denna studie härleddes från MD-patienter och lagrades i den institutionella biobanken i enlighet med etiska krav. Informerat samtycke lämnades för användning av cellerna. Utför alla cellodlingsprocedurer under ett sterilt laminärt flödesskåp vid rumstemperatur (RT, 22-25 ° C). Använd sterilfiltrerade lösningar som är lämpliga för cellodling och steril utrustning. Odla alla cellinjer i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. Mykoplasmatester bör utföras varje vecka för att säkerställa mykoplasmafria kulturer. 143BTK- rho0-celler kan genereras som tidigare beskrivits5.
1. Odling av celler
- Innan du påbörjar något förfarande, kontrollera förekomsten av mutationen i fibroblaster som härrör från MD-patienter och kvantifiera procentandelen heteroplasmi eller homoplasi genom RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) och /eller hela mtDNA-sekvenseringsanalyser14.
- Fröfibroblaster i fyra 35 mm petriskålar, var och en innehållande 2 ml komplett odlingsmedium (tabell 1). Låt cellerna växa tills 80% sammanflytande (48 timmar).
- Odla 143BTK- rho0-celler i 8 ml kompletterat odlingsmedium (tabell 1) i en 100 mm petriskål.
- Håll cellerna i en inkubator vid 37 °C med 5 % CO2.
- Kontrollera frånvaron av mtDNA i rho0-celler genom sekvenseringstekniker14.
2. Enukleation av fibroblaster
- Sterilisera fyra 250 ml centrifug-lämpliga flaskor genom autoklavsterilisering vid 121 ° C under en 20 minuters cykel. Torka dem i en laboratorieugn eller vid RT.
- Förvärm centrifugen vid 37 °C.
- Tvätta 35 mm diskarna som innehåller fibroblasterna två gånger, med 2 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan (w/o) kalcium och magnesium.
- Rengör diskens yttre yta med 70% etanol och vänta tills alkoholen avdunstar.
- Ta bort locken från diskarna och skruvlocken från flaskorna. Placera varje skål, utan lock, upp och ner på botten av varje 250 ml centrifugflaska.
- Tillsätt långsamt 32 ml enukleationsmedium till varje flaska (tabell 1), så att mediet kan komma in i skålen och komma i kontakt med cellerna. Ta bort eventuella bubblor från diskarna med en lång Pasteur-pipett i glas och böj spetsen i en Bunsen-låga.
OBS: Det är viktigt att ta bort bubblorna så att mediet kan komma in i skålen och komma i kontakt med cellerna. - Stäng varje flaska med skruvlocket och överför dem till centrifugen.
- Centrifug i 20 min vid 37 °C och 8 000 × g, acceleration max, retardation långsam. Var uppmärksam på att balansera centrifugen: motvikt varje flaska. Justera vid behov vikten genom att lägga till en lämplig volym Enucleation Medium.
- Under centrifugering, använd vakuum eller en 10 ml serologisk pipett för att aspirera och kassera mediet från odlingsplattorna 143BTK- rho0 och tvätta dem två gånger med 4 ml 1x PBS utan kalcium och magnesium.
- Tillsätt 2 ml trypsin för att täcka cellmonoskiktet helt.
- Lägg diskarna i en 37 ° C inkubator i ~ 2 min.
- Ta bort diskarna från inkubatorn, observera cellavskiljning med hjälp av ett inverterat mikroskop för levande celler (mål 4x eller 10x) och hämma enzymaktiviteten genom att tillsätta 2 ml kompletterat odlingsmedium.
- Aspirera 4 ml av cellsuspensionen i skålen med en 10 ml pipett och överför den till ett 15 ml koniskt rör.
- Räkna cellerna med hjälp av en Burker hemocytometerkammare eller en automatiserad räknare.
- I slutet av centrifugeringen (steg 2.8), aspirera mediet från flaskorna och kassera det.
- Ta bort diskarna genom att invertera flaskorna på en steril gasbindning som tidigare sprutats med 70% etanol. Rengör diskens yttre yta och locken med 70% etanol. Vänta tills alkoholen avdunstar och stäng sedan diskarna.
- Innan du fortsätter, kontrollera om cytoplast (spöke) bildas med hjälp av ett inverterat mikroskop för levande celler (mål 4x eller 10x). Leta efter extremt långsträckta fibroblaster på grund av extrudering av deras kärnor inducerade av cytokalasin B.
- Tillsätt 1 × 106 av 143BTK- rho 0-celler till varje 35 mm skål, som återanvänds i 2 ml 143BTK- rho0 odlingsmedium kompletterat med 5 % fetalt bovint serum (FBS).
- Låt diskarna stå i 3 timmar i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 och låt 143BTK- rho 0-cellerna sätta sig på spökena. Stör inte disken.
3. Fusion av de enukleerade fibroblasterna med rho 0-celler
- Efter 3 timmars inkubation, aspirera och kassera mediet från diskarna.
- Tvätta de vidhäftande cellerna två gånger med 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) högglukos utan serum eller med Minimum Essential Medium (MEM).
- Aspirera och kassera mediet.
- Tillsätt 500 μL PEG-lösning (se materialförteckningen) till cellerna och inkubera i exakt 1 min.
- Aspirera och kassera PEG-lösningen.
- Tvätta cellerna tre gånger med 2 ml DMEM hög glukos utan serum eller med MEM.
- Tillsätt 2 ml fusionsmedium (tabell 1) och inkubera över natten i inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2.
4. Cybridval och expansion
- Efter inkubation över natten, ta bort plattorna från inkubatorn, trypsinisera cellerna enligt beskrivningen ovan (steg 2.9-2.13) och överför innehållet i varje 35 mm skål till en 100 mm skål.
- Tillsätt 8 ml urvalsmedium (tabell 1) och placera plattorna i inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2.
- Byt medium var 2-3: e dag.
- Vänta i ~ 10-15 dagars urval tills kolonier av celler visas.
- Frys en av de fyra petriskålarna genom att samla alla kloner och generera en "massiv" kultur som en säkerhetskopia av cybriderna, som så småningom kan återstjämnas och användas för ytterligare undersökningar.
- Trypsinisera cellerna i de återstående odlingsrätterna, räkna och fröa i en eller flera petriskålar vid 50-100 celler / skål i det kompletterade odlingsmediet (tabell 1) tills kloner dyker upp. Låt dem växa i några dagar.
- Pelletera de återstående cellerna genom centrifugering vid 1 200 × g i 3 min vid RT och kassera supernatanten.
- Extrahera DNA från pelletsen (se materialförteckningen).
- Utför genotypning genom variabelt antal tandemupprepade (VNTR) analyser som tidigare rapporterats15.
- Plocka upp kloner från petriskålen med kloningscylindrar eller en pipettspets, med hjälp av ett stereomikroskop för att undvika sammanslagning av olika kloner, och överför dem till en 96-brunnsplatta, var och en väl innehållande 200 μL kompletterat odlingsmedium (tabell 1).
- Expandera varje klon tills det finns tillräckligt med celler för att frysa och extrahera DNA.
- Kontrollera mutationsprocenten för varje klon med RFLP eller andra sekvenseringsmetoder. Försök helst att få både kloner med vildtyp mtDNA (0% mutation) och kloner med olika mutationsprocent, båda lägger till homoplasmatisk mutant mtDNA (100% mutation). Se figur 1 för ett schematiskt diagram över cybridgenereringsprotokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att generera cybrider kräver 3 dagars laboratoriearbete plus en urvalsperiod (~ 2 veckor) och ytterligare 1-2 veckor för tillväxt av kloner. De kritiska stegen är kvaliteten på cytoplaster och urvalsperioden. Cybridernas morfologi liknar den hos rho 0-givarcellerna. Tilldelning av rätt mtDNA och nDNA i cybriderna är obligatorisk för att bekräfta cellernas identitet. Ett exempel ges i figur 2. I detta fall genererade vi cybrider med utgångspunkt från fibroblaster härrörande från en patient som bär heteroplasmisk m.3243A>G, en av de vanligaste mtDNA-mutationerna associerade med mitokondriell myopati, encefalopati, mjölksyraacidos och strokeliknande episoder (MELAS). Analys av VNTR visade att cybrid nDNA är identiskt med rho 0-cellerna (figur 2A), vilket bekräftar ersättningen av patientens nDNA med 143B-genomet. RFLP- och/eller sekvenseringsanalyser kan användas för att bedöma förekomsten av mtDNA-mutationen och heteroplasminprocenten (figur 2B,C).
Figur 1: Schematiskt diagram över cybridgenereringsprotokollet. Patient-härledda fibroblaster behandlas med cytokalasin B och centrifugeras för att erhålla cytoplaster (enukleerade celler). Cytoplasmatisk fusion av cytoplaster och mtDNA-utarmade celler (143BTk- rho0) möjliggör generering av cybrider som kan isoleras efter selektion i lämpligt medium. Att plocka upp och amplifiera enstaka kloner ger olika heteroplasmiprocent, som i teorin kan variera från 100% vildtyp till 100% muterad. Förkortning: mtDNA = mitokondriellt DNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Molekylär karakterisering av cybrider. (A) Analys av Apo-B-mikrosatelliter visar att nDNA extraherat från de genererade cybriderna är identiskt med kärn-DNA i rho0-cellinjen . (B) HaeIII-begränsningskartor över PCR-produkten som spänner över MELAS-associerade m.3243A>G, som används för att kvantifiera mängden WT) och Mut mtDNA-arter. (C) Representativa resultat av RFLP-analys som visar m.3243A>G heteroplasminivåer i olika cybridkloner (c1, c2, c3). Förkortningar: M = markör; bp = baspar; WT = vildtyp; Mut = mutant; RFLP = restriktionsfragmentlängd polymorfism; MELAS = mitokondriell myopati, encefalopati, laktacidos och strokeliknande episoder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mediekomposition | |
| Komplett odlingsmedium | Slutlig konc. |
| DMEM hög glukos (utan L-glutamin med natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (bovin serumprodukt) | 10% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-streptomycin (lösning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Kompletterat odlingsmedium | Slutlig konc. |
| DMEM hög glukos (utan L-glutamin med natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (bovin serumprodukt) | 10% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-streptomycin (lösning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 4 mM |
| Uridin | 50 μg/ml |
| Enukleationsmedium | Slutlig konc. |
| DMEM hög glukos (utan L-glutamin med natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (bovin serumprodukt) | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-streptomycin (lösning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Cytochalasin B från Drechslera dematioidea | 10 μg/ml |
| Fusionsmedium | Slutlig konc. |
| DMEM hög glukos (utan L-glutamin med natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (bovin serumprodukt) | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-streptomycin (lösning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Urval medium | Slutlig konc. |
| DMEM hög glukos (utan L-glutamin med natriumpyruvat) | [1:1] |
| Dialyserad FBS | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-streptomycin (lösning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-brom-2'-deoxiuridin | 100 μg/ml |
Tabell 1: Uppgifter om medier som används för cybridgenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MtDNA har en mycket hög mutationshastighet jämfört med nDNA på grund av bristen på skyddande histoner och dess placering nära andningskedjan, vilket utsätter molekylen för skadliga oxidativa effekter som inte effektivt motverkas av reparationssystemen16. De första patogena mtDNA-mutationerna identifierades 198817,18, och sedan dess har ett stort antal mutationer beskrivits. NGS-teknik är ett relevant tillvägagångssätt för att screena hela mitokondriella genomet och enkelt identifiera varianter14. Att bedöma den patogena rollen hos en aldrig beskriven mtDNA-mutation kan dock vara utmanande och bygger fortfarande på "gammaldags" metoder som generering av cybridceller som beskrivs i detta protokoll 11,12,13. Cybridgenerationen som beskrivs här sammanfattar de ursprungliga metoderna som beskrivs av King och Attardi5. Andra protokoll innehåller emellertid mindre modifieringar huvudsakligen relaterade till system för cellenukleation10. I andra fall är enukleation onödig, till exempel när det patienthärledda biologiska materialet består av blodplättar, som inte innehåller en kärna19.
Transmitochondriala cybrider har flera viktiga egenskaper, vilket gör dem till ett relevant forskningsverktyg även när molekylär teknik med hög genomströmning kan profilera DNA och RNA på encellsnivå. I banbrytande verk användes cybrider för att fastställa eller bekräfta det genetiska ursprunget till störningar kliniskt och biokemiskt definierade som mitokondriella störningar 6,7,8,9,20. Faktum är att systemet uteslutande tillåter studier av bidraget från mtDNA-mutationen utan påverkan av probandets kärngener och i en homogen kärnbakgrund hos rho0-cellerna.
Dessutom kan en kvantitativ genotyp-till-fenotypkorrelation utföras tack vare isoleringen av olika cybridkloner som bär olika procentandelar av mutationerna. De olika klonerna valdes med hjälp av Selection Medium (tabell 1) kompletterat med dialyserad FBS och inte innehållande uridin och pyruvat, vilket möjliggjorde tillväxt av rho0-celler smälta med endast cytoplaster. Således elimineras rho0-celler som inte hade smält samman eller hade smält samman med intakta fibroblaster (bi- eller polynukleerade celler), liksom eventuella kvarvarande icke-enukleerade intakta fibroblaster. Faktum är att rho0-celler är helt utarmade av mtDNA genom långvarig exponering för låga koncentrationer av etidiumbromid, en potent hämmare av mitokondriellt gammapolymeras21.
I avsaknad av en funktionell andningskedja förlitar sig rho0-celler uteslutande på glykolys för sina energibehov och blir pyruvatberoende. Dessutom har rho0-celler blivit auxotrofa för pyrimidiner (uridin är en pyrimidinprekursor) på grund av bristen på dihydrooroteatdehydrogenas, ett enzym som fungerar inom mitokondrier och involverat i pyrimidinbiosyntesen. Medan rho 0-celler härrör från human osteosarkom 143B tymidinkinas-bristfälliga (TK-) celler, fibroblaster, cytoplaster och polynukleerade hybrider är TK +. Därför avlägsnas TK + -celler på grund av exponering för 5-brom-2'-deoxiuridin. Faktum är att denna uridinanalog känns igen av TK som katalyserar fosforyleringen av deoxytymidin, som sedan används i DNA-biosyntes. Denna process resulterar i dödliga mutationer som orsakar celldöd. En annan fördel med cybrider är möjligheten att frysa och/eller återanvända dem under långa odlingstider utan förändringar. Dessutom, som tumörceller, minskar deras höga tillväxthastighet den experimentella studietiden.
Den molekylära förutsättningen för att göra detta system användbart och tillförlitligt är att verifiera det korrekta genetiska bidraget från kärn- och mitokondriellt DNA och mtDNA-mängden i de repopulerade cybriderna. Numera kan detta enkelt utföras genom att använda NGS-tekniker som gör det möjligt att analysera hela mtDNA-molekylen för att definiera haplogrupper och kontinuerligt verifiera närvaron av andra oönskade patogena varianter utöver den undersökta varianten. Vid heteroplasmatiska tillstånd kan isoleringen av kloner med olika mutationsbelastningar, som helst sträcker sig från 0% till 100%, användas för att korrelera mutationsprocenten med svårighetsgraden av mitokondriell försämring.
Möjliga fallgropar dolda i dessa cybridgenereringsprocedurer är kopplade till tumörursprunget hos rho0-cellerna som används som kärndonatorer. Dessa celler är aneuploida, och det är inte klart hur detta så småningom kan påverka mitokondriella funktioner och översättningen och sammansättningen av de olika andningskedjans underenheter som kodas av kärn- respektive mitokondriellt DNA. I allmänhet skulle det vara tillrådligt att generera cybrider med hjälp av rho0-celler av olika ursprung och verifiera att de erhållna klonerna visar jämförbara fenotyper. Ytterligare en begränsning är att tumörceller huvudsakligen är glykolytiska medan mitokondriella störningar är massivt beroende av OXPHOS. Därför måste effekten av en glykolytisk kärna (rho0-celler ) på konsekvenserna av en mtDNA-mutation noggrant fastställas.
Trots ovanstående begränsningar har genereringen av cybrider revolutionerat det mitokondriella medicinfältet och används fortfarande för att fastställa den patogena rollen hos nya mtDNA-mutationer. Dessutom används cybridteknik för att undersöka mitokondriellt bidrag till olika sjukdomar, allt från vanliga neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons, Alzheimers och Huntingtons sjukdom 22,23,24,25,26, till cancer och anticancerbehandling27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie genomfördes i Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), finansierad av Mariani Foundation. VT är medlem i det europeiska referensnätverket för sällsynta neuromuskulära sjukdomar (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
