Summary
경미토콘드리아 사이브리드는 미토콘드리아 장애에 의해 영향을 받는 환자로부터 유래된 세포플라스트(enucleated cells)와 미토콘드리아 DNA(mtDNA)-고갈 세포(rho0 cells)를 융합시켜 얻은 하이브리드 세포이다. 그들은 질병의 핵 또는 미토콘드리아 기원의 결정, 생화학 적 활성의 평가 및 mtDNA 관련 변이체의 병원성 역할의 확인을 허용합니다.
Abstract
산화적 인산화(OXPHOS)를 수행하는 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 결핍은 인간 미토콘드리아 장애의 생화학적 마커이다. 유전 적 관점에서 볼 때, OXPHOS는 핵 DNA (nDNA)와 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 두 가지 별개의 유전 시스템의 보완으로 인해 발생하기 때문에 독특한 예를 나타냅니다. 따라서, OXPHOS 결함은 핵 및 미토콘드리아 코딩된 유전자에 영향을 미치는 돌연변이에 기인할 수 있다.
1989년에 발표된 King과 Attardi의 획기적인 연구는 mtDNA가 고갈된 인간 세포주(rho0)가 외인성 미토콘드리아에 의해 재채워져 소위 "트랜스미토콘드리아 사이브리드"를 얻을 수 있음을 보여주었다. 미토콘드리아 장애 (MDs) 환자로부터 유래 된 미토콘드리아와 rho0 세포의 핵을 포함하는 이들 사이브리드 덕분에 결함이 mtDNA- 또는 nDNA와 관련이 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 사이브리드는 또한 돌연변이의 병원성을 검증하고 생화학 적 수준에서 그 영향을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 백서에서는 cybrid 생성, 선택 및 특성화를 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
미토콘드리아 장애 (MDs)는 핵 (nDNA) 또는 미토콘드리아 (mtDNA) DNA1의 돌연변이로 인한 미토콘드리아 기능의 손상으로 인한 다계통 증후군의 그룹입니다. 그들은 가장 흔한 유전 된 대사 질환 중 하나이며 1 : 5,000의 유병률이 있습니다. mtDNA 관련 질병은 미토콘드리아 유전학의 규칙을 따릅니다 : 모성 상속, 이종 혈질 및 역치 효과, 유사분열분리 2. 인간 mtDNA는 복제 및 전사에 필요한 서열, 13개의 단백질 코딩 유전자(호흡 사슬의 모든 서브유닛), 22개의 tRNA 및 2개의 rRNA 유전자를 갖는 짧은 조절 영역을 포함하는 16.6 kb의 이중 가닥 DNA원이다.
건강한 개체에는 하나의 단일 mtDNA 유전자형 (동종 플라스마)이 있지만 병리학 적 조건에서 하나 이상의 유전자형 (헤테로 플라스마)이 공존합니다. 해로운 이질성 돌연변이는 OXPHOS를 방해하고4 세에 모든 장기에 영향을 줄 수있는 질병을 일으키는 중요한 임계 값을 극복해야합니다. OXPHOS의 이중 유전학은 상속을 지시합니다 : 상염색체 열성 또는 우성 및 nDNA 돌연변이에 대한 X 연결, mtDNA 돌연변이에 대한 모성, nDNA 및 mtDNA 모두에 대한 산발적 인 경우.
미토콘드리아 의학 시대가 시작될 때, King과 Attardi5의 획기적인 실험은 mtDNA가 완전히 고갈된 종양 세포주(rho0 cells)와 MD 환자의 미토콘드리아로부터 핵을 포함하는 하이브리드 세포를 만들어 MD를 담당하는 돌연변이의 기원을 이해하는 기초를 확립했습니다. 돌연변이가 핵 또는 미토콘드리아 게놈에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 쉽지 않았습니다. 1989 년에 설명 된이 방법은 미 토콘드리아 의학 6,7,8,9 분야에서 일하는 여러 연구자들에 의해 사용되었습니다. 자세한 프로토콜은 최근10 번 게시되었지만 아직 비디오가 제작되지 않았습니다. NGS가 돌연변이가 어디에 있는지 정확하고 신속하게 식별 할 수있을 때 왜 그러한 프로토콜이 요즘 관련이 있어야합니까? 대답은 cybrid 생성이 여전히 새로운 mtDNA 돌연변이의 병원성 역할을 이해하고, 이종 형질의 비율을 질병의 중증도와 상관 관계시키고, 환자의 자가성 핵 배경의 기여가 결여되어있는 균질 핵 시스템에서 생화학 적 조사를 수행하는 최첨단 프로토콜이라는 것입니다11, 12,13년.
이 프로토콜은 35mm 페트리 접시에서 자란 합류성 환자 유래 섬유아세포로부터 세포플라스트를 얻는 방법을 기술한다. 시토칼라신 B의 존재하에 접시를 원심분리하면 enucleated cytoplasts의 분리가 가능하며, 이는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 존재하에 rho0 세포와 융합됩니다. 생성 된 cybrids는 클론이 발생할 때까지 선택적 배지에서 배양됩니다. 대표적인 결과 섹션은 mtDNA가 공여체 환자의 섬유아세포의 그것과 동일하고 nDNA가 종양 rho0 세포주의 핵 DNA와 동일하다는 것을 증명하기 위해 생성된 사이브라이드의 분자 특성화의 예를 보여준다.
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Protocol
참고: 인간 섬유아세포의 사용은 윤리적 승인이 필요할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 섬유 아세포는 MD 환자로부터 유래되었으며 윤리적 요구 사항을 준수하여 기관 바이오 뱅크에 보관되었습니다. 세포의 사용을 위해 정보에 입각한 동의가 제공되었다. 모든 세포 배양 절차를 멸균된 층류 캐비닛 하에 실온(RT, 22-25°C)에서 수행한다. 세포 배양 및 멸균 장비에 적합한 멸균 여과 용액을 사용하십시오. 모든 세포주를 5%CO2로 37°C의 가습 인큐베이터에서 성장시킨다. 마이코플라즈마 검사는 마이코플라즈마가 없는 배양을 보장하기 위해 매주 실시되어야 합니다. 143BTK-rho0 세포는 앞서 기술한 바와 같이 생성될 수 있다5.
1. 세포의 배양
- 임의의 절차를 시작하기 전에, MD 환자(들)로부터 유래된 섬유아세포에서 돌연변이의 존재를 검증하고, 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 및/또는 전체 mtDNA 시퀀싱 분석(14)에 의해 이형질 또는 동형질의 백분율을 정량화한다.
- 종자 섬유아세포를 네 개의 35mm 페트리 접시에 넣고, 각각 2mL의 완전 배양 배지를 함유한다(표 1). 세포가 80 % 합류 할 때까지 성장하게하십시오 (48 h).
- 143BTK-rho 0 세포를100 mm 페트리 디쉬에서 보충된 배지 8 mL (표 1)에서 성장시킨다.
- 세포를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에서 유지시킨다.
- 시퀀싱 기술14에 의해 rho0 세포에서 mtDNA의 부재를 확인한다.
2. 섬유아세포의 핵형성
- 적합한 병을 오토클레이브 멸균에 의해 네 개의 250 mL 원심분리기를 20분 사이클 동안 121°C에서 멸균한다. 실험실 오븐이나 RT에서 건조시킵니다.
- 원심분리기를 37°C에서 예열한다.
- 섬유아세포가 들어있는 35mm 접시를 두 번 씻고, 칼슘과 마그네슘이 없는 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 2mL를 사용합니다.
- 70 % 에탄올로 접시의 바깥 표면을 닦고 알코올이 증발 할 때까지 기다리십시오.
- 접시에서 뚜껑을 제거하고 병에서 나사 캡을 제거하십시오. 뚜껑없이 각 접시를 각 250 mL 원심 분리기 병의 바닥에 거꾸로 놓습니다.
- 각 병에 32mL의 Enucleation Medium을 천천히 첨가하고(표 1), 배지가 접시에 들어가 세포와 접촉할 수 있도록 한다. 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시에서 거품을 제거하고 Bunsen 불꽃으로 팁을 휘어줍니다.
참고 : 배지가 접시에 들어가서 세포와 접촉 할 수 있도록 거품을 제거하는 것이 중요합니다. - 나사 캡으로 각 병을 닫고 원심 분리기로 옮깁니다.
- 37°C 및 8,000 × g, 최대 가속도, 감속 둔에서 20분 동안 원심분리한다. 원심 분리기의 균형에주의하십시오 : 각 병의 무게를 줄이십시오. 필요한 경우, 적절한 부피의 핵형성 배지를 첨가하여 무게를 조절한다.
- 원심분리 중에 진공 또는 10 mL 혈청 학적 피펫을 사용하여 흡인하고 143BTK-rho0 배양 플레이트에서 배지를 버리고 칼슘 및 마그네슘을 함유 한 1x PBS 4 mL를 사용하여 두 번 세척하십시오.
- 트립신 2 mL를 첨가하여 세포 단층을 완전히 덮으십시오.
- 접시를 ~ 2 분 동안 37 °C 인큐베이터에 놓습니다.
- 인큐베이터에서 접시를 제거하고, 살아있는 세포 (목표 4x 또는 10x)에 대해 거꾸로 현미경을 사용하여 세포 박리를 관찰하고, 보충 된 배양 배지 2 mL를 첨가하여 효소 활성을 억제하십시오.
- 4 mL의 세포 현탁액을 10 mL 피펫으로 접시 중의 흡인하고, 이를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다.
- Burker 혈구측정기 챔버 또는 자동 카운터를 사용하여 세포를 계수하십시오.
- 원심분리가 끝나면 (단계 2.8), 병에서 배지를 흡인하고 버린다.
- 이전에 70 % 에탄올로 뿌려진 멸균 거즈에 병을 뒤집어서 접시를 제거하십시오. 접시의 바깥 표면과 뚜껑을 70 % 에탄올로 닦으십시오. 알코올이 증발 할 때까지 기다린 다음 접시를 닫으십시오.
- 진행하기 전에 살아있는 세포 (목표 4x 또는 10x)에 대해 거꾸로 된 현미경을 사용하여 세포 플라스트 (유령) 형성을 확인하십시오. 시토칼라신 B에 의해 유도된 핵의 압출로 인해 매우 길쭉한 섬유아세포를 찾으십시오.
- 각 35 mm 접시에, 5% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 143BTK-rho0 배지 2 mL에 재현탁된 143BTK-rho 0 세포의 1 ×10 6을 첨가한다.
- 접시를 37°C 및 5%CO2의 가습된 인큐베이터에 3시간 동안 방치하고 143BTK-rho0 세포가 유령 위에 정착하게 한다. 접시를 방해하지 마십시오.
3. enucleated 섬유아세포와 rho 0 세포의 융합
- 3 시간의 인큐베이션 후, 흡인하고 접시에서 배지를 버립니다.
- 혈청이 없는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 고포도당 2mL 또는 최소 필수 배지(MEM)로 부착성 세포를 두 번 세척하십시오.
- 매체를 흡인하고 버리십시오.
- 500 μL의 PEG 용액 ( 물질 표 참조)을 세포에 첨가하고 정확히 1 분 동안 인큐베이션한다.
- 흡인물은 PEG 용액을 버린다.
- 혈청 없이 또는 MEM으로 DMEM 고글루코스 2mL를 사용하여 세포를 세 번 세척하십시오.
- 퓨전 배지 2 mL(표 1)를 첨가하고, 5%CO2와 함께 37°C의 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
4. 사이브리드 선택 및 확장
- 밤새 인큐베이션 후, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 상기 기재된 바와 같이 세포를 트립신화하고(단계 2.9-2.13), 각 35 mm 디쉬의 함량을 100 mm 디쉬로 옮긴다.
- 선택 배지 8 mL(표 1)를 첨가하고, 플레이트를 5%CO2가 있는 37°C의 인큐베이터에 놓는다.
- 2-3 일마다 배지를 교체하십시오.
- 세포의 콜로니가 나타날 때까지 ~ 10-15 일 동안 기다리십시오.
- 모든 클론을 수집하고 사이브리드의 백업으로 "거대한"배양물을 생성하여 네 개의 페트리 접시 중 하나를 동결시켜 결국 재복제하여 추가 조사에 사용할 수 있습니다.
- 남은 배양 접시에 있는 세포를 트립신화하고, 계수하고, 클론이 나타날 때까지 보충된 배양 배지(표 1)의 50-100 세포/접시에 있는 하나 이상의 페트리 접시에 종자한다. 그들이 며칠 동안 자라게하십시오.
- RT에서 3분 동안 1,200 × g 에서 원심분리하여 나머지 세포를 펠릿화하고 상청액을 버린다.
- 펠렛에서 DNA를 추출 합니다 (물질 표 참조).
- 이전에 보고된 바와 같이 가변 수의 탠덤 반복(VNTR) 분석에 의한 지노타이핑을 수행한다(15).
- 클로닝 실린더 또는 피펫 팁이 있는 페트리 접시에서 클론을 집어 들고 입체 현미경을 사용하여 서로 다른 클론의 풀링을 피하고 200μL의 보충 배양 배지를 포함하는 각 웰의 96웰 플레이트로 옮깁니다(표 1).
- DNA를 동결하고 추출하기에 충분한 세포가있을 때까지 모든 클론을 확장하십시오.
- RFLP 또는 다른 시퀀싱 방법으로 각 클론의 돌연변이 백분율을 검증한다. 이상적으로는 야생형 mtDNA (0% 돌연변이)를 가진 클론과 돌연변이 비율이 다른 클론을 모두 얻어 동형질 돌연변이 mtDNA (100% 돌연변이)를 합산하는 것이 이상적이다. 사이브리드 생성 프로토콜의 개략도에 대해서는 도 1 을 참조한다.
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Representative Results
사이브리드를 생성하려면 3 일간의 실험실 작업과 선택 기간 (~ 2 주)과 클론 성장을위한 추가 1-2 주가 필요합니다. 중요한 단계는 세포 플라스트의 품질과 선택 기간입니다. 사이브리드의 형태학은 rho 0 공여체 세포의 형태와 유사합니다. 사이브리드에서 정확한 mtDNA 및 nDNA의 할당은 세포의 동일성을 확인하기 위해 필수적이다. 그림 2에 예가 나와 있습니다. 이 경우, 우리는 미토콘드리아 근병증, 뇌병증, 젖산증 및 뇌졸중 유사 에피소드 (MELAS)와 관련된 가장 흔한 mtDNA 돌연변이 중 하나 인 헤테로 플라스마 m.3243A>G를 운반하는 환자로부터 유래 된 섬유 아세포로부터 유래 된 사이브리드를 생성했다. VNTR의 분석은 cybrid nDNA가 rho0 세포의 그것과 동일하다는 것을 보여주었고 (도 2A), 환자의 nDNA를 143B 게놈으로 대체하는 것을 확인하였다. RFLP 및/또는 시퀀싱 분석은 mtDNA 돌연변이의 존재 및 헤테로플라스마 백분율을 평가하는 데 사용될 수 있다(도 2B,C).
그림 1: 사이브리드 생성 프로토콜의 개략도. 환자 유래 섬유아세포를 시토칼라신 B로 처리하고 원심분리하여 세포플라스트(enucleated cells)를 얻는다. 세포플라스트와 mtDNA-고갈 세포(143BTk-rho0)의 세포질 융합은 적절한 배지에서 선택 후 단리될 수 있는 사이브리드의 생성을 허용한다. 단일 클론의 픽업 및 증폭은 이론적으로 100 % 야생형에서 100 % 돌연변이까지 다양 할 수있는 다른 헤테로 플라스마 비율을 산출합니다. 약어: mtDNA = 미토콘드리아 DNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 사이브리드의 분자 특성화 . (A) Apo-B 마이크로위성의 분석은 생성된 사이브라이드로부터 추출된 nDNA가 rho0 세포주의 핵 DNA와 동일하다는 것을 보여준다. (b) MELAS-관련 m.3243A>G에 걸친 PCR 산물의 HaeIII 제한 지도, WT) 및 뮤트 mtDNA 종의 양을 정량하는데 사용된다. (c) 상이한 사이브리드 클론에서 m.3243A>G 헤테로플라스마 수준을 보여주는 RFLP 분석의 대표적인 결과(c1, c2, c3). 약어: M = 마커; bp = 염기쌍; WT = 야생형; 뮤트 = 돌연변이체; RFLP = 제한 단편 길이 다형성; MELAS = 미토콘드리아 근병증, 뇌증, 젖산증, 뇌졸중 유사 에피소드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미디어 구성 | |
| 완전한 배양 배지 | 최종 conc. |
| DMEM 고 글루코스 (L- 글루타민 W / 피루베이트 나트륨 포함) | [1:1] |
| FetalClone III (소 혈청 제품) | 10% |
| 피루베이트 나트륨 100 mM | 1 밀리지미터 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 (용액 100x) | 1% |
| L- 글루타민 200 mM (100x) | 2 밀리지미터 |
| 보충된 배양 배지 | 최종 conc. |
| DMEM 고 글루코스 (L- 글루타민 W / 피루베이트 나트륨 포함) | [1:1] |
| FetalClone III (소 혈청 제품) | 10% |
| 피루베이트 나트륨 100 mM | 1 밀리지미터 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 (용액 100x) | 1% |
| L- 글루타민 200 mM (100x) | 4 밀리지미터 |
| 우리딘 | 50 μg/mL |
| 핵형성 배지 | 최종 conc. |
| DMEM 고 글루코스 (L- 글루타민 W / 피루베이트 나트륨 포함) | [1:1] |
| FetalClone III (소 혈청 제품) | 5% |
| 피루베이트 나트륨 100 mM | 1 밀리지미터 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 (용액 100x) | 1% |
| L- 글루타민 200 mM (100x) | 2 밀리지미터 |
| Drechslera dematioidea의 Cytochalasin B | 10 μg/mL |
| 퓨전 매체 | 최종 conc. |
| DMEM 고 글루코스 (L- 글루타민 W / 피루베이트 나트륨 포함) | [1:1] |
| FetalClone III (소 혈청 제품) | 5% |
| 피루베이트 나트륨 100 mM | 1 밀리지미터 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 (용액 100x) | 1% |
| L- 글루타민 200 mM (100x) | 2 밀리지미터 |
| 선택 매체 | 최종 conc. |
| DMEM 고 글루코스 (L- 글루타민 W / 피루베이트 나트륨 포함) | [1:1] |
| 투석된 FBS | 5% |
| 피루베이트 나트륨 100 mM | 1 밀리지미터 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 (용액 100x) | 1% |
| L- 글루타민 200 mM (100x) | 2 밀리지미터 |
| 5-브로모-2'-데옥시우리딘 | 100 μg/mL |
표 1: 사이브리드 생성에 사용되는 매체의 세부사항.
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Discussion
mtDNA는 보호 히스톤의 부족 및 호흡 사슬에 가까운 그의 위치 때문에 nDNA에 비해 매우 높은 돌연변이율을 가지며, 이는 분자를 복구 시스템(16)에 의해 효율적으로 상쇄되지 않는 손상된 산화 효과에 노출시킨다. 최초의 병원성 mtDNA 돌연변이는 1988 년17,18 년에 확인되었으며, 그 이후로 많은 수의 돌연변이가 설명되었습니다. NGS 기술은 전체 미토콘드리아 게놈을 스크리닝하고 변이체14를 쉽게 식별하기 위한 관련 접근법이다. 그러나, 결코 기술되지 않은 mtDNA 돌연변이의 병원성 역할을 평가하는 것은 어려울 수 있으며, 여전히 이 프로토콜11,12,13에 기술된 사이브리드 세포의 생성과 같은 "구식" 방법에 의존한다. 여기에 설명 된 cybrid 세대는 King과 Attardi5가 묘사 한 원래의 방법을 되풀이합니다. 그러나, 다른 프로토콜들은 주로 셀 에뉴클레네이션(10)을 위한 시스템들과 관련된 사소한 변형들을 포함한다. 다른 예에서, enucleation은 불필요한, 예를 들어, 환자 유래 생물학적 물질이 핵(19)을 함유하지 않는 혈소판으로 구성될 때이다.
Transmitochondrial cybrids는 몇 가지 중요한 특징을 가지고 있으며, 높은 처리량의 분자 기술이 단일 세포 수준에서 DNA와 RNA를 프로파일 링 할 수있는 경우에도 관련 연구 도구로 만듭니다. 선구적인 연구에서, 사이브리드는 미토콘드 리아 장애 6,7,8,9,20으로 임상적, 생화학적으로 정의된 장애의 유전적 기원을 확립하거나 확인하기 위해 사용되었다. 실제로, 이 시스템은 독점적으로 프로밴드의 핵 유전자의 영향없이 그리고 rho0 세포의 균질 한 핵 배경에서 mtDNA 돌연변이의 기여에 대한 연구를 허용합니다.
또한, 정량적 유전자형-표현형 상관관계는 돌연변이의 상이한 백분율을 운반하는 상이한 사이브리드 클론의 단리 덕분에 수행될 수 있다. 상이한 클론은 투석된 FBS로 보충된 선택 배지 (표 1)를 사용하여 선택되었고, 우리딘 및 피루베이트를 함유하지 않고, 세포플라스트와 융합된 rho0 세포의 성장을 허용하였다. 따라서, 무손상 섬유아세포(bi- 또는 다핵세포)와 융합되지 않았거나 융합되지 않은 rho0 세포뿐만 아니라 임의의 잔류 비-침윤된 무손상 섬유아세포는 제거된다. 실제로, rho0 세포는 미토콘드리아 감마 중합효소21의 강력한 억제제인 에티듐 브로마이드의 저농도에 장기간 노출됨으로써 mtDNA를 완전히 고갈시킨다.
기능적 호흡 사슬이 결여된 rho0 세포는 에너지 요구 사항에 따라 당분해에만 의존하고 피루베이트에 의존하게 됩니다. 또한, rho0 세포는 미토콘드리아 내에서 기능하고 피리미딘 생합성에 관여하는 효소인 디하이드로로테이션 데하이드로게나제의 결핍으로 인해 피리미딘(우리딘은 피리미딘 전구체임)에 대한 영양영양적이 되었다. rho0 세포는 인간 골육종 143B 티미딘 키나제 결핍 (TK-) 세포로부터 유래되는 반면, 섬유아세포, 세포플라스트, 및 다핵 하이브리드는 TK+이다. 따라서, TK+ 세포는 5-브로모-2'-데옥시우리딘에 대한 노출로 인해 제거된다. 사실,이 우리딘 유사체는 데옥시티미딘의 인산화를 촉매하는 TK에 의해 인식되며, 이는 DNA 생합성에 사용됩니다. 이 과정은 세포 사멸을 일으키는 치명적인 돌연변이를 초래합니다. cybrids의 또 다른 장점은 변경없이 오랜 문화 시간 동안 동결 및 / 또는 재사용 할 수 있다는 것입니다. 또한, 종양 세포와 마찬가지로, 그들의 높은 성장 속도는 실험 연구 기간을 감소시킨다.
이 시스템을 유용하고 신뢰할 수 있게 만들기 위한 분자 전제 조건은 핵 및 미토콘드리아 DNA의 정확한 유전적 기여와 재채워진 사이브라이드 내의 mtDNA 양을 검증하는 것이다. 요즘에는 NGS 기술을 사용하여 전체 mtDNA 분자를 분석하여 하플로 그룹을 정의하고 조사중인 변이체 외에도 다른 원치 않는 병원성 변이체의 존재를 지속적으로 검증함으로써 쉽게 수행 할 수 있습니다. 헤테로 플라스마 조건의 경우, 이상적으로 0 % ~ 100 %의 다른 돌연변이 부하를 가진 클론의 분리는 돌연변이 백분율을 미토콘드리아 손상의 중증도와 상관 관계를 맺는 데 사용할 수 있습니다.
이러한 사이브리드 생성 절차에서 숨겨진 가능한 함정은 핵 공여체로서 사용되는 rho0 세포의 종양 기원과 관련이 있다. 이들 세포는 이수성이며, 이것이 결국 미토콘드리아 기능과 핵 및 미토콘드리아 DNA에 의해 각각 코딩되는 상이한 호흡 사슬 서브유닛의 번역 및 조립에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지는 명확하지 않다. 일반적으로, 다른 기원의 rho0 세포를 사용하여 사이브리드를 생성하고 얻은 클론이 비교 가능한 표현형을 표시하는지 확인하는 것이 좋습니다. 또 다른 한계는 종양 세포가 주로 글리콜 성 반면 미토콘드리아 장애는 OXPHOS에 크게 의존한다는 것입니다. 따라서 mtDNA 돌연변이의 결과에 대한 글리콜 핵 (rho0 세포)의 영향은 신중하게 확립되어야합니다.
위의 한계에도 불구하고, 사이브리드의 생성은 미토콘드리아 의학 분야에 혁명을 일으켰으며 여전히 새로운 mtDNA 돌연변이의 병원성 역할을 확립하는 데 사용됩니다. 또한, 사이브리드 기술은 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병과 같은 일반적인 신경퇴행성 질환 22,23,24,25,26, 암 및 항암 치료 27,28에 이르기까지 다양한 질병에 대한 미토콘드리아의 기여도를 조사하는 데 사용됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Mariani Foundation이 자금을 지원하는 미토콘드리아 소아 질환 연구 센터 (http://www.mitopedia.org)에서 수행되었습니다. VT는 희귀 신경근 질환에 대한 유럽 참조 네트워크 (ERN EURO-NMD)의 회원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
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