Intraduktale Verabreichung und Röntgenvisualisierung von Ethanol-basierter ablativer Lösung zur Prävention und lokalen Behandlung von Brustkrebs in Mausmodellen

Summary

Es wird ein Verfahren der intraduktalen Injektion von Reagenzien für eine ethanolbasierte ablative Lösung in den maktalen Brustbaum der Maus zur In-vivo-Bildgebung und Brustkrebsprävention beschrieben. Die Injektion direkt in die Brustwarzenöffnung ermöglicht das Targeting von Brustepithelzellen mit minimalen Kollateralschäden.

Abstract

Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache für Frauen in den USA. Für Frauen mit hohem Risiko ist die prophylaktische Mastektomie die effektivste primäre Präventionsstrategie. Die prophylaktische Mastektomie ist ein aggressiver chirurgischer Eingriff, bei dem die Brustepithelzellen, aus denen Brustkrebs entsteht, zusammen mit dem umgebenden Gewebe vollständig entfernt werden. Wir wollen ein minimal-invasives intraduktales Verfahren als Alternative zur prophylaktischen Mastektomie entwickeln, um die Brustepithelzellen lokal abzutragen, bevor sie bösartig werden können. Wir und andere haben ein intraduktales Verabreichungsverfahren entwickelt, um diese Epithelzellen in Nagetiermodellen von Brustkrebs zu erreichen und zu behandeln. Während die Brustdrüse der Maus mit einer einzigen nicht anastomosierten duktalen Baumöffnung an der Brustwarze eine viel weniger komplexe und gewundene Architektur aufweist als die menschliche Brust, sind chemisch induzierte und gentechnisch veränderte Mausmodelle von Brustkrebs wertvoll, um Proof-of-Concept-Studien über neue Präventionsstrategien zu erstellen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur intraduktalen Abgabe einer ethanolbasierten ablativen Lösung, die mikro-CT/Röntgen-Tantal-basiertes Kontrastmittel im Makmus-Duktalbaum der Maus zum therapeutischen Zweck der Primärprävention von Brustkrebs enthält. Die intraduktale Abgabe von wässrigen Reagenzien (z. B. zytotoxische Verbindungen, siRNAs, AdCre) wurde zuvor in Mausmodellen beschrieben. Daher konzentrieren wir unsere Protokollbeschreibung auf methodische Modifikationen und einzigartige experimentelle Überlegungen zur Optimierung der Ethanolabgabe, zur Minimierung lokaler und systemischer Nebenwirkungen der Ethanolverabreichung und zur In-vivo-Visualisierung der duktalen Baumfüllung mittels Mikro-CT / Fluoroskopie-Bildgebung. Die Visualisierung des duktalen Baumes unmittelbar nach der Injektion einer kontrasthaltigen Lösung ermöglicht die Bestätigung der vollständigen Füllung oder erfolgloser Ergebnisse wie Unter- oder Überfüllung. Dieses Verfahren kann für die Abgabe und Bildgebung anderer ablativer Verbindungen angewendet werden, die entweder darauf abzielen, die Tumorbildung zu verhindern oder Tumore im Frühstadium, die über den duktalen Baum zugänglich sind, lokal zu behandeln.

Introduction

Brustkrebs ist eine häufige und potenziell tödliche Krankheit mit wenigen Präventionsmöglichkeiten1. Die wirksamste Intervention ist die prophylaktische Mastektomie; Allerdings entscheiden sich nur Personen mit hohem Risiko für dieses Verfahren, da es sich um eine Operation mit schwerwiegenden lebensverändernden Folgen ^handelt2. Das Verfahren entfernt vollständig die Brustepithelzellen, aus denen Brustkrebs zusammen mit dem umgebenden Gewebe entsteht. Dies kann zu körperlichem, psychischem und sozialem Stress für den Einzelnen führen und hält Einzelpersonen oft davon ab, mit diesem chirurgischen Eingriff als erste primäre Interventionslinie fortzufahren.

Wir haben gezeigt, dass die Abgabe einer ablativen Lösung, die 70% Ethanol (EtOH) enthält, direkt in den duktalen Baum wirksam ist, um Brustepithelzellen mit begrenzten Kollateralgewebeschäden abzutöten und Brusttumoren in Mausmodellen zu ^verhindern3. EtOH wird seit langem klinisch als ablatives oder sklerosierendes Mittel zur lokalen Behandlung eingesetzt. Die perkutane EtOH-Injektion wird als Ablativum bei inoperablen Lebertumoren, Nieren- und Nebennierentumoren sowie pankreaszystischen Tumoren ^{eingesetzt4,5,6}; für Zöliakie-Plexus-Neurolyse zur Schmerzlinderung7; und zur Behandlung von Brust-Pseudoaneurysmen8. Die intravaskuläre EtOH-Injektion wird als Sklerosierungsmittel zur Beseitigung von Schwellungen und Verformungen durch arteriovenöse Fehlbildungen (AVM) und zur kosmetischen Behandlung von Besenreisern und Krampfadern verwendet9,10,11,12,13. Wie bei der prophylaktischen Mastektomie hängt der Erfolg der Prävention mit lokaler Verabreichung einer ablativen Lösung von der Fähigkeit ab, alle Brustepithelzellen, aus denen möglicherweise Krebs entstehen könnte, vollständig zu entfernen. Dies erfordert die Bestätigung, dass die ablative Substanz den duktalen Baum erfolgreich gefüllt hat und somit alle Brustepithelzellen direkt kontaktiert. Klinische Mittel zur Injektion von Substanzen in die Brustdrüsen und deren Visualisierung durch bildgeführte Fluoroskopie oder Duktik sind leicht ^{verfügbar14,15}; Daher wird es möglich sein, sowohl die erfolgreiche Lieferung als auch die Bestätigung zu bestätigen, wenn dieses Verfahren eine Bewertung in klinischen Studien rechtfertigen könnte.

Der Nachweis der Machbarkeit dieses bildgeführten Ansatzes bei Labortieren ist ein wichtiger Schritt, um die Wirksamkeit und translationale Machbarkeit der intraduktalen (ID) Ablation als vorbeugende Maßnahme bei Brustkrebs zu etablieren. In unserem Labor haben wir eine Methode entwickelt, um alle Brustdrüsen bei Mäusen erfolgreich mit einer ablativen Lösung zu injizieren, die ein Kontrastmittel über einen Verlauf wöchentlicher Injektionen enthält, um sicherzustellen, dass das Tier nicht einer Überdosierung von EtOH erliegt (Abbildung 1, Abbildung 2, Referenz Nr. ^3,16). Bei diesem Verfahren wird eine 34 G-Nadel in die Brustwarzenöffnung einer isoflurananästhesierten Maus eingesetzt, um die Testlösung zu injizieren. Zu den wichtigsten Verbesserungen des Verfahrens gehören die Verwendung von gasdichten Spritzen für Flüssigkeiten und Gase, die Injektion höherer Volumina pro duktalen ^Bäumen17 und eine erweiterte entzündungshemmende Behandlung. Die präklinische Behandlung von 5 mg/kg Carprofen, einem NSAID, von 2 d vor bis 7 d nach dem ID-Verfahren steht im Einklang mit der klinischen Sklerosierungstherapie für AVM. Typischerweise erhalten die Patienten nach einer systemischen Anästhesie 2 Tage nach dem Eingriff entzündungshemmende Medikamente wie NSAIDs, die verlängert werden können, um lokale Entzündungen oder Schmerzen zu ^lindern12. Alkoholintoxikation wird durch intraperitoneale Injektion einer 5% igen Saccharoselösung bei Mäusen signifikant gemildert. Bei Verabreichung dieser Saccharoselösung können Mäuse sicher mit bis zu 160 μL 70% EtOH injiziert werden (bis zu vier duktale Bäume; etwa 0,4 g/dl EtOH-Gehalt im Blut); Die Tiere erholten sich innerhalb von 4 Stunden nach der ID-Injektion vollständig. Für die Injektion von mehr als vier Drüsen in Mäuse und / oder höhere EtOH-Konzentrationen führen wir sequenzielle Sitzungen durch, um genügend Erholungszeit zu haben. Alkoholintoxikation bei Frauen wäre aufgrund des geringeren Anteils der Alkoholmenge am Körpergewicht ein geringeres Problem. Angesichts der Anzahl der duktalen Bäume in der menschlichen ^Brust14,15, etwa 16, und des geschätzten Volumens, um jeden Baumkanal zu ^füllen18,19, werden bis zu 32 ml von 70% EtOH verabreicht. Diese Menge wird viel niedriger sein als die 50 ml 95% EtOH, die bei anderen klinischen Verfahren verabreicht ^werden4,9. Die intravenöse Verabreichung von Thiamin und Glukoselösung könnte verwendet werden, um die Auswirkungen einer EtOH-Intoxikation weiter zu minimieren, insbesondere in Fällen, in denen ein größeres Gesamtvolumen von EtOH injiziert werden muss, und / oder bei Frauen, die eine geringere Toleranz gegenüber Alkoholkonsum haben (z. B. allelische Varianten in Alkohol- oder Aldehyddehydrogenasen).

Die Bildgebung mittels Mikro-CT/Fluoroskopie ermöglicht es uns, die erfolgreiche duktale Füllung jeder Drüse zu bestätigen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3). Dies kann für zukünftige Analysen aufgezeichnet oder im Moment durch Echtzeit-Fluoroskopie-Bildgebung bewertet werden, wie es in der klinischen Anwendung der Fall wäre, um die Gesamtstrahlungsbelastung des Tieres zu begrenzen. Um die spezifischen Eigenschaften dieser ablativen Lösung für die bildgeführte Echtzeitabgabe in vivo weiter zu verbessern, haben wir zuvor den von der FDA zugelassenen jodhaltigen Kontrast mit einem Tantaloxid (_TaOx)-haltigen Nanopartikel verglichen, das vom Shapiro-Labor synthetisiert ^wurde3,16. _TaOx zeigte eine überlegene Leistung als Mikro-CT-Kontrastmittel zur Visualisierung der anfänglichen Füllung des duktalen Baumes (Abbildung 2, Abbildung 3). _TaOx kann als Referenzkontrast verwendet werden, um eine systematischere und longitudinale Beurteilung anderer Nanopartikel-basierter Blutpoolkontrastmittel (z. B. jod-, wismut- oder goldhaltige) und der Kompatibilität von _TaOx mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ethylcellulose als Geliermittel ^{durchzuführen20,21}.

Protocol

Alle hier beschriebenen Experimente wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt wurden.

1. Erweiterte entzündungshemmende Behandlung

1. Stellen Sie sicher, dass Mäuse, die Injektionslösungen mit EtOH oder anderen potenziellen Reizstoffen erhalten, von 2 Tagen vor der Injektion bis 7 Tage nach der Injektion eine entzündungshemmende Behandlung erhalten. Die bevorzugte Dosierungsmethode ist die orale Verabreichung durch einen Sucralose-Gelbecher, der Carprofen in einer geeigneten Konzentration enthält.
2. Bereiten Sie Carprofen mit der erforderlichen Konzentration vor. Für dieses Experiment wurde eine Arbeitslösung von 2 mg/ml (Stammlösung ist 50 mg/ml) durch Verdünnen in sterilem PBS hergestellt, um 0,5 ml zu injizieren, um eine Enddosis von 1 mg pro Tasse zu erreichen. Fügen Sie 1% v / v sterilen blauen Lebensmittelfarbstoff (BFD) anstelle eines Bruchteils des PBS des für die Verdünnung erforderlichen Gesamtvolumens hinzu, um eine vollständige Vermischung des Arzneimittels in das Sucralose-Gel besser zu visualisieren.
3. Bereiten Sie eine Tasse für die Carprofen-Zugabe gemäß der Empfehlung des Herstellers vor. Sofern nicht anders empfohlen, stellen Sie die Tasse für 15 min in ein 60 °C warmes Wasserbad. Entfernen Sie die Tassen und trocknen Sie sie ab, um die Möglichkeit einer Kontamination zu minimieren.
   1. Verwenden Sie 70% EtOH oder ein EtOH-Tuch, um die Oberfläche des Tassendeckels zu reinigen und trocknen zu lassen. Verwenden Sie eine Spritze, um die notwendige Menge Carprofenlösung durch den Deckel zu injizieren. Für dieses Experiment werden 500 μL injiziert. Decken Sie die Injektionsstelle mit einem Aufkleber ab und schütteln Sie 15 Sekunden lang kräftig.
   2. Wirbeln Sie den Becher für 15 Sekunden auf und lagern Sie ihn dann für den späteren Gebrauch, nachdem Sie das vollständige Mischen visuell überprüft haben. Überprüfen Sie die Tassen auf homogenes Mischen, indem Sie nach dunkelblauen Klumpen suchen. Lassen Sie die Tassen auf Raumtemperatur kommen, bevor Sie sie bis zu einem Monat in den Kühlschrank stellen.
      HINWEIS: Diese Tassen können bei Bedarf auch bei Raumtemperatur gelagert werden, sobald sie dosiert wurden, aber achten Sie darauf, die Leitlinien des Herstellers zur Wirksamkeit des Arzneimittels zu beachten. Die Datierung des Aufklebers hilft, den Überblick über das Injektionsdatum zu behalten, ohne zu riskieren, dass ein Stift oder ein scharfer Marker den Deckel durchsticht.
4. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, wischen Sie die Außenseite der Tasse mit 70% EtOH ab. Den Deckel abziehen und die Tasse mit den Mäusen in den Käfig stellen. Ersetzen Sie die Tassen jeden zweiten Tag oder wenn sie leer sind. Eine Tasse sollte für bis zu fünf Mäuse für 1-2 Tage ausreichen.

2. Präoperative Vorbereitung

HINWEIS: Dieser Schritt erfolgt 2-3 Tage vor der Injektion.

1. Betäuben Sie die Maus mit einem Isofluran-Verdampfer (2%-3% Isofluran, 1,5 l/min Sauerstoff) und tragen Sie Augengleitmittel auf. Halten Sie die Anästhesie bei 1% -3% Isofluran nach Bedarf während des gesamten Eingriffs mit einem Nasenzapfen aufrecht, während Sie die Atemfrequenz des Tieres sorgfältig überwachen.
2. Tragen Sie das Augengleitmittel auf die Mausaugen auf, während Sie sich am Nasenkegel befinden, und positionieren Sie dann die Maus auf dem Rücken. Verwenden Sie einen Applikator mit Baumwollspitze, um eine rezeptfreie Enthaarungscreme auf den Brustwarzenbereich (den Bereich der Brustdrüse, der injiziert wird) aufzutragen. Reiben Sie die Creme mit dem Applikator für 10-30 s in den Bereich ein, um das Fell schnell zu lockern.
   HINWEIS: Lassen Sie die Creme nicht länger als nötig auf dem Tier und entfernen Sie sie vollständig, um ein Verbrennen der Haut zu vermeiden.
3. Verwenden Sie nach 10-30 s der Anwendung warmes Wasser auf Gaze, um die Creme vollständig zu entfernen und das Fell vom Tier zu lösen. Führen Sie mindestens zwei bis vier Spülungen des Bereichs mit frischer Gaze zur Cremeentfernung durch, bevor Sie nach der endgültigen Spülung mit einer sauberen Trockengaze trocknen. Überprüfen Sie den Bereich der Fellentfernung, um eine gute Sicht und den Zugang zu den Brustwarzen zu bestätigen. Bei Bedarf mit der Enthaarungscreme wiederholen.
4. Legen Sie die Maus in einen separaten, sauberen, trockenen Erholungskäfig auf ein Heizkissen, um sich von der Narkose zu erholen. Beobachten Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat, und bringen Sie sie in den Heimkäfig zurück.
5. Geben Sie Mäusen eine Tasse Sucralose-Gellösung mit Carprofen (1 mg / Tasse) zur Vordosierung des entzündungshemmenden Mittels nach der Genesung. Eine Tasse kann bis zu fünf Mäuse für bis zu 2 Tage mit Carprofen versorgen. Überprüfen Sie die Tasse täglich und ersetzen Sie sie nach Bedarf oder jeden zweiten Tag, wenn sie nicht vollständig verbraucht ist.

3. Intraduktale Injektion

HINWEIS: Dieser Schritt tritt 2-3 Tage nach der präoperativen Vorbereitung auf.

1. Herstellen einer 333,3 mM Tantaloxid (_TaOx)-Stammlösung aus beschaffter Pulverformulierung wie ⁱⁿ¹⁶ beschrieben unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Verwenden Sie sanfte Wärme, wenn sich das Pulver nicht vollständig in der Lösung auflöst.
2. Erstellen Sie eine ablative Bildgebungslösung, indem Sie drei Teile Standard-TaOx mit sieben Teilen 100% EtOH für eine endgültige 70% EtOH 100mM _TaOx-Lösung mischen. Geben Sie 1% v/v blauen Lebensmittelfarbstoff zur endgültigen Lösung hinzu, um die Visualisierung während der Injektion zu unterstützen. Bereiten Sie einen Band basierend auf dem Bedarf für den Test vor.
   HINWEIS: Die Drüsenpaare 1 und 5 können bis zu 30 μL der Lösung aufnehmen, während alle anderen Paare mit bis zu 50 μL bei FVB-Mäusen im Alter von 9 Wochen oder älter injiziert werden können.
3. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran wie in der präoperativen Vorbereitung und bewegen Sie die Maus zum Nasenkegel, sobald sie vollständig betäubt ist. Tragen Sie Augengleitmittel auf, bevor Sie das Tier zur Injektion auf den Rücken legen. Befestigen Sie die Maus bei Bedarf mit Klebeband unter dem Stereoskop.
4. Bereiten Sie die Spritze mit dem gewünschten Volumen der Injektionslösung vor. Laden Sie 21-51 μL der Injektionslösung in eine 50 μL Spritze mit einer 34 G Nadel auf. Laden Sie zusätzliche 1 μL der Lösung ein, um die mögliche Leckage dieses Volumens zu berücksichtigen, nachdem die Nadel aus der Brustwarze entfernt wurde.
   HINWEIS: Die obigen Bände beziehen sich auf die hier vorgestellten typischen Verfahren. Man kann jedes gewünschte Volumen injizieren, mit dem Verständnis, dass die meisten Drüsen überfüllt sind, wenn sie über 30 μL oder 50 μL in den Drüsenpaaren 1 und 5 bzw. 2-4 gehen. Es ist hilfreich, die Nadel mit zusätzlichem Volumen der Injektionslösung zu füllen, um den freien Fluss der Lösung unmittelbar vor der Injektion zu testen. Wenn Sie mehr als eine Brustdrüse injizieren, füllen Sie mehrere Spritzen vor, um Zeit zu sparen. Lassen Sie die Lösung jedoch nicht lange in der Spritze.
5. Bereiten Sie die Brustwarzen für die Injektion vor, indem Sie abgestorbene Haut entfernen, die die Brustwarzenöffnung mit einer feinen spitzen Pinzette bedeckt.
6. Halten Sie die Brustwarze vorsichtig mit einer Pinzette. Wenn die Abschrägung der Nadel sichtbar ist, führen Sie die Nadel in die Nippelöffnung ein, bis die Fase mit Hilfe einer fein bestückten Pinzette vollständig bedeckt ist. Es kann notwendig sein, die Brustwarze auf die Nadel hochzuziehen, anstatt die Nadel in die Brustwarze zu drücken (Tabelle 1).
7. Sobald die Nadelfase vollständig von der Brustwarze umgeben ist und sich im Hauptkanal befindet, beginnen Sie mit der Injektion der Lösung mit einer konstanten Rate von etwa 40 μL / min. Vermeiden Sie es, zu schnell zu injizieren, um sicherzustellen, dass der duktale Baum nicht beschädigt wird. Halten Sie die Nadel 30 s in der Brustwarze, nachdem das Volumen vollständig injiziert wurde, bevor Sie die Nadel mit Hilfe der Pinzette entfernen. Dies geschieht, um zu vermeiden, dass die Lösung aus der Brustwarze austritt (Abbildung 2).
   1. Beurteilen Sie den Bereich auf Anzeichen einer erfolglosen Injektion. Ein gewölbtes Aussehen kann auf eine Fettpolsterinjektion oder ein Trauma in den Bereich hinweisen.
   2. Fahren Sie fort, die verbleibenden Brustdrüsen zu injizieren.
8. Während das Tier noch betäubt ist, injizieren Sie 200-250 μL 5% ige Saccharoselösung (bis zu 10 ml / kg) intraperitoneal, um die möglichen Auswirkungen einer Alkoholintoxikation zu minimieren.

4. Mikro-CT-Bildgebung

1. Nachdem Sie alle gewünschten Drüsen injiziert haben, bewegen Sie das Tier schnell zum Mikro-CT-System und halten Sie die Anästhesie mit dem eingebauten Isofluran-Vaporizer aufrecht. Das Tier kann geklebt werden, um die Bildgebungsposition zu standardisieren. Zum Beispiel hilft das Abkleben jedes Hinterbeins in einer ausgestreckten Position, die Beinknochen des Tieres weiter von den unteren Drüsen entfernt zu halten, die im resultierenden Bild von Interesse sind.
   HINWEIS: Die Tiere können mit verschiedenen Scanparametern für die Visualisierung des duktalen Baumes abgebildet werden, wenn darauf geachtet wird, eine angemessene akzeptable Lebenszeitstrahlendosis für das Tier zu bestimmen, und die kumulativen Dosen diesen Wert nicht überschreiten. Fluoroskopie-Standbilder und -Videos können ohne Scans erzeugt werden, um die Strahlenbelastung weiter zu reduzieren (Abbildung 2).
2. Positionieren Sie die Maus mit der Durchleuchtungsvorschaufunktion im entsprechenden Sichtfeld.
3. Führen Sie eine _{TaOx-Bildgebung} des Duktalbaums der Maus mit guter Auflösung und Möglichkeit für wiederholte Standard-Erfassungsscans (2 Min.) durch. Verwenden Sie die folgenden Scan-Parameter: 90 kVp/88 μA; Sichtfeld (FOV), 36 mm; Anzahl der Scheiben, 512; Schichtdicke, 72 μm; Voxelauflösung, 72 ^μm3.
   1. Erwerben Sie längere (4 oder 14 min) hochauflösende Scans für eine noch bessere Auflösung bei Tieren. Diese sind als terminale Verfahren vor der Euthanasie akzeptabel. Diese sind jedoch nicht akzeptabel für Tiere, die in Längsrichtung mit den gleichen Parametern gescannt werden, da sie eine Strahlenkrankheit verursachen.
4. Entfernen Sie das Tier nach Abschluss des Bildgebungsprotokolls aus der Narkose und bringen Sie es in einen separaten, sauberen, trockenen Aufwachkäfig auf einem Heizkissen. Beobachten Sie das Tier, bis es vollständig genesen ist, und bringen Sie es dann in den Heimkäfig zurück. Bewahren Sie die Tiere, denen eine ablative Lösung auf Carprofen injiziert wird, bis 7 Tage nach der Injektion auf.
5. Erstellen Sie schnelle Wiedergaben aller gescannten Bilder in der Mikro-CT-Software (integriertes System), um Kontrastlecks oder fehlende Füllungen (Abbildung 2) ohne formale Analyse besser zu erkennen.
6. Führen Sie eine weitere formale Bildanalyse zur Veröffentlichung oder eine detaillierte Analyse von Scans durch, die auf Wunsch eine Segmentierung des Interessenbereichs ermöglichen (Abbildung 3).
   HINWEIS: Der Hauptunterschied zwischen diesen Methoden besteht in der Möglichkeit, nur den duktalen Baum (formale Wiedergabe) in einen Schwellenwert zu setzen, im Gegensatz zu der Notwendigkeit, das gesamte Bild in einen Schwellenwert zu bringen (schnelle Wiedergabe). Andere Messungen und Bilder können mit den Softwarepaketen generiert werden, um den Erfolg der duktalen Baumfüllung bestmöglich zu demonstrieren.

5. Bildanalyse

1. Führen Sie das Rendern des injizierten duktalen Baums mit einem speziellen Softwarepaket durch. Um dies zu tun, segmentieren Sie das Brustfettpolster mit weiterer Bildbearbeitung.
   1. Um das Fettpolster (dunkleres Kompartiment im Vergleich zur Peritonealhöhle, den Oberschenkelmuskeln und der Haut), in dem sich der interessierende duktale Baum befindet, zu segmentieren, wählen Sie die Option Spline Trace aus dem manuellen Menü. Verfolgen Sie den Fettpolsterumriss an jedem dritten Datenschnitt.
   2. Klicken Sie im halbautomatischen Menü auf die Option Objekte propagieren , um alle verfolgten und nicht verfolgten Segmente zu einem einzigen Objekt zu verbinden.
2. Wählen Sie die Option Schwellenwertlautstärke aus dem halbautomatischen Menü, um den gewünschten HU-Bereich einzugeben (300-3.000 HE ist ein guter Ausgangspunkt), und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Schwellenwert-Formatvariante, um eine Wiedergabe zu erstellen, die nur den Kontrast (TaOx) innerhalb des duktalen Baums anzeigt und Weichgewebe eliminiert.
3. Schalten Sie die Schaltfläche Ansicht auf Formatvariante als Primär um, um nur die 3D-Formatvariante ohne umgebende Strukturen anzuzeigen.
   HINWEIS: Zusätzliche Softwarefunktionen ermöglichen Messungen der 3D-Wiedergabe (z. B. Länge, Volumen usw.).

Results

Weibliche Mäuse haben fünf Paare von Brustdrüsen mit einem einzigen duktalen Baum, der sich an der Brustwarzenöffnung ^öffnet22. An den Spitzen des sich entwickelnden duktalen Baumes befinden sich die terminalen Endknospen (TEBs), proliferative Strukturen, die Wachstum und Verzweigung steuern. Nach der Pubertät, wenn die Dehnungsphase abgeschlossen ist, bilden sich TEBs zurück und werden funktionell und anatomisch nicht mehr von Terminalgängen oder Alveolarknospen zu ^{unterscheiden23}. Terminale duktale lobuläre Einheiten erfüllen beim Menschen eine ähnliche Funktion wie TEBs bei Mäusen und sind die Stellen, an denen Brustkrebs überwiegend ^{entsteht24,25}. Wir können bis zu 50 μL 70% ige EtOH-Lösung injizieren, um den gesamten duktalen Baum der Brust- und Abdominalmamdrüsen von 9 Wochen alten FVB/N, NSG und anderen Mausstämmen zu füllen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, siehe ^{Referenzen3,16}). In einem typischen Experiment können wir bis zu acht Brustdrüsen mit einer ablativen Lösung von 70% EtOH und 100 mM _TaOx in zwei aufeinanderfolgenden ID-Verfahren im Abstand von 7 Tagen injizieren, um die Erholung der Tiere zu ermöglichen (Abbildung 2). Die Tiere werden unmittelbar nach der letzten ID-Injektion mittels Mikro-CT abgebildet, um die erfolgreiche Abgabe der Lösung an den gesamten duktalen Baum zu beurteilen (Abbildung 2). Nach unserer Erfahrung sind die Brustwarzen der Leistendrüsen bei etwa 60% der Tiere für die Injektion geeignet und die Brustwarzen der Halsdrüsen bei etwa 40%. Wenn geeignet, können wir bis zu 30 μL 70% ige EtOH-Lösung injizieren, um den gesamten duktalen Baum der Zervix- und Leistenmammeldrüsen zu füllen (Abbildung 2). FVB- und NSG-Stämme weisen im Allgemeinen geeignetere Brustwarzen für die Injektion auf als C57BL/6J oder gemischte genetische Hintergrundstämme. Das Dual-Staining-Protokoll der gesamten Montierung oder die konfokale 3D-Mikroskopie sind gute orthogonale Methoden, um zu bestätigen, inwieweit der duktale Baum gefüllt wurde (Abbildung 3). Diese Gewebekorrelatanalysen sind kompatibel mit und können nach der In-vivo-Bildgebung durchgeführt werden. Die offensichtliche Einschränkung dieser orthogonalen Methoden besteht darin, dass sie eine tierische Terminierung für die Gewebeentnahme und -analyse erfordern; In einer Optimierungsphase einer neuen ablativen Formulierung bieten sie jedoch eine unabhängige Validierung.

Abbildung 1: Workflow des intraduktalen Verfahrens und der Bildanalyse. Wichtige Schritte des ID-Verfahrens werden hervorgehoben. Weitere Informationen finden Sie im Video. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Erfolgreiche Kanülierung und Abgabe der ablativen Lösung an mehrere Brustdrüsen. (A) Repräsentative Brustwarzenvarivervielung bei FVB- und NSG-Mausstämmen. Lange Brustwarzen sind leichter zu kanülieren als kurze Brustwarzen, während zu kurze oder verkümmerte Brustwarzen nicht kanüliert werden können. Einmal kanüliert, hat die Größe der Brustwarze keinen Einfluss auf die erfolgreiche intraduktale Verabreichung. (B) Die grobanatomische Analyse des blauen Farbstoffs in einer ablativen Lösung liefert Ex-vivo-Beweise für den Erfolg der Füllung und Verabreichung des duktalen Baumes. (C,D) Echtzeit-Fluoroskopie und Post-Image-Aufnahme 3D-Mikro-CT-Wiedergabe liefern in vivo Beweise für den Liefererfolg. (D) Erfolgreiche Injektion von Bauch- und Leistendrüsen und drei von vier Brustdrüsen (Fettpolsterinjektion in Drüse #2). Maßstabsbalken entsprechen 1 mm in Bildern bei unterschiedlicher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: In-vivo- und Ex-vivo-Demonstration der duktalen Baumfüllung. 70% EtOH/100 mM _TaOx Nanopartikel/Evans Blue Lösung wurde intraduktal in die Brustdrüse der Maus injiziert und sofort per Mikro-CT abgebildet und für die duale Färbung des ganzen Mounts verarbeitet. Der duktale Baum wurde mit einem Bildanalyse-Softwarepaket rekonstruiert. Die Lösung füllt den Karmin-Alaun-gebeizten duktalen Baum vollständig aus. Eine separate Drüse wurde für E-Cadherin (Cdh1) immungefärbt, mit Benzylalkohol:Benzylbenzoat gereinigt und wie beschrieben durch konfokale Mikroskopie ^abgebildet26. Der duktale Baum wurde mit Einer Bildanalyse-Software rekonstruiert. Die Pseudo-Farbwiedergabe von konfokalem Bild (d.h. schwarzer Hintergrund zu Weiß, grünes Markersignal zu Magenta) wurde mit der Bildumkehrfunktion der Bildbearbeitungssoftware erhalten. Maßstabsbalken entsprechen 1 mm in Bildern bei unterschiedlicher Vergrößerung. Diese Zahl wurde gegenüber der Referenz Nr. ³ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ausstellen	Aussehen		Lösung
Kurze Brustwarze (Abb. 2)	Nippel hat ein niedriges Profil – schwer zu greifen		Es ist manchmal einfacher, die Haut in der Nähe der Brustwarze zu halten und die Mitte der Brustwarze mit der Nadel anzuvisieren. Die Nadel wird wahrscheinlich unter die Haut tauchen. Wenn Sie sich langsam nach oben ziehen, kann sich die Brustwarze leicht über der Nadelspitze befinden und Platz zum Greifen geben und den Rest des Weges auf die Nadel ziehen. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie über den Winkel der Nadel unter die Haut tauchen. Es ist leicht, versehentlich eine Fettpolsterinjektion zu bekommen, indem man im falschen Winkel sticht.
Fette Brustwarze	Viel größer als andere Brustwarzen mit wenig abziehbarer abgestorbener Haut – ohne Zielfernrohr gut sichtbar		Sehr einfach, eine Fettpolsterinjektion auf diese Brustwarzen zu bekommen. Seien Sie sehr vorsichtig mit dem Winkel der Nadel, wenn Sie in die Brustwarze einführen.
Fettpolster-Injektion (Abb. 2)	Geschwollen um die Brustwarze und möglicherweise in der Brustwarze selbst - am einfachsten zu sehen, ob der Injektionslösung Farbe zugesetzt wird		Wenn die Brustwarze mit den ersten paar injektionen ul anschwillt, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie erneut, mit mehr Rücksicht auf den Winkel einzuführen. Beginnen Sie erneut mit der Injektion und achten Sie auf weitere Schwellungen. Wenn die Schwellung anhält, geben Sie den Versuch auf. Es ist sehr selten, eine Brustwarze erfolgreich zu injizieren, die als Fettpolsterinjektion begonnen hat.
Wunden/Schorf	Offene Wunde oder Schorf in der Nähe der Injektionsstelle von EtOH-Lösung		Tragen Sie dreifache antibiotische Salbe auf offene Wunden auf, aber lassen Sie schorfige Wunden in Ruhe. Das Auftragen von Salbe auf Schorf kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass das Tier den Schorf stört und entfernt. Überprüfen Sie alle 1-2 Tage, bis sie verheilt sind, abhängig von der Schwere der Wunde. Carprofen sollte bis zur Heilung verabreicht werden, auch wenn es über das normale Fenster hinausgeht.

Tabelle 1: Fehlerbehebung und hilfreiche Tipps.

Discussion

Die prophylaktische Mastektomie ist derzeit die wirksamste Intervention bei Brustkrebs, hat jedoch einige schwerwiegende negative Auswirkungen. Die lokale Ablation von Brustepithelzellen mit einer EtOH-basierten Lösung ist eine vielversprechende alternative Therapie, wie wir in einer Proof-of-Concept-Studie am aggressiven FVB-Tg-C3(1)-TAg-Mausmodell ^{von Brustkrebs3} gezeigt haben. Die ID-Injektion dieser ablativen Lösung ermöglicht das Targeting der Brustepithelzellen, aus denen Brustkrebs mit begrenzten Kollateralschäden entsteht. Die Zugabe eines Röntgenkontrastmittels zur ablativen Lösung ermöglicht ein besseres Verständnis der Wirksamkeit der Lösung bei der Prävention, da wir sehen können, ob jeder duktale Baum nach der Injektion erfolgreich gefüllt wird (Abbildung 2B). Die Betrachtung der injizierten Drüsen durch Fluoroskopie unmittelbar nach der Injektion spiegelt wider, was wahrscheinlich in der Klinik getan wird, um die erfolgreiche Füllung des duktalen Baumes zu bestätigen. Die visuelle Bestätigung der Lösungsbereitstellung informiert am besten darüber, ob alle Teile des Baums in Echtzeit erreicht wurden. Dies könnte es ermöglichen, dass eine weitere Injektion durchgeführt wird, um die Füllung zu diesem Zeitpunkt oder in einer zukünftigen Sitzung abzuschließen. Es ist von großer Bedeutung, dass die ablative Lösung alle Teile des duktalen Baumes erreicht, um sicherzustellen, dass alle Epithelzellen zum Abtöten zugänglich sind (Abbildung 3). Das Zurücklassen lebender Epithelzellen innerhalb des Baumes würde die Möglichkeit eröffnen, dass Brustkrebs immer noch auftreten könnte. Die Verwendung von Kontrast in ID-Injektionen zum Bilderfolg der Injektion könnte auch für andere Formulierungen nützlich sein. Tabelle 1 enthält Eine Problembehandlung und hilfreiche Tipps. Andere Studien haben ID-Lieferprotokolle für virale Partikel (z. B. AdCre, CRISPR-Leit-RNAs), Hormone, zytotoxische Verbindungen, siRNAs und/oder Targeting-Wirkstoffe in Mäusen beschrieben3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ^,38, Ratten24,32,39,40,41 und Kaninchen42,43,44,45,46,47. Unabhängige klinische Studien berichteten über eine erfolgreiche Kanülierung von bis zu acht Kanälen pro Brust für die lokale Verabreichung der Chemotherapie40,48,49. Die Visualisierung einer vollständigen Abfüllung bei der Bereitstellung anderer Lösungen, die auf Prävention abzielen oder auf eine Behandlung ausgerichtet sind, würde sich aus ähnlichen Gründen lohnen. Das Wissen, dass die Lösung alle Zweige und Endenden des Baumes erreicht hat, wird für die Beurteilung der erfolgreichen Prävention oder Behandlung von Bedeutung sein.

Uns sind keine anderen intraduktalen Bildgebungsverfahren bei ^Mäusen33,34 oder anderen Tiermodellen47 bekannt, die die hohe Auflösung von TaOx-Nanopartikeln ermöglichen. Bemerkenswert ist, dass _TaOx im murinen duktalen Baum die von der FDA zugelassenen Kontrastmittel für die diagnostische Duktik ^{übertrifft3,16}. Während wir das ID-ablative Verfahren weiterhin auf seine Fähigkeit zur Vorbeugung von Brustkrebs untersuchen, werden wir in der Lage sein, genauer zu bestimmen, aus welchen Drüsen Krebs entsteht, mit Hilfe von zusätzlichen Daten, die durch Bildgebung nach der ID-Lieferung gegeben werden. Zum Beispiel könnte man feststellen, ob eine Drüse, die nur teilweise gefüllt war, eher als eine nicht injizierte Drüse zu einer Tumorbildung führt, was das Sicherheitsprofil und die Besorgnis erfolgloser Injektionen bei einer Hochrisikofrau anspricht. Diese Technik hat einige Einschränkungen. Dies ist eine relativ anspruchsvolle Maustechnik, die Geschicklichkeit und Geschicklichkeit des Bedieners erfordert, um jeden Kanal zu manipulieren und erfolgreich zu kanülieren. Jede einzelne Injektion ist ein unabhängiges Ereignis, so dass eine erfolglose Injektion auf eine oder mehrere Drüsen die Ergebnisinterpretation beeinträchtigen kann. Angesichts der Größe der murinen Brustdrüse und der Zerbrechlichkeit der Brustwarze ist die Fluoroskopie oder eine ähnliche Bildführungstechnik nicht verfügbar, um in Echtzeit zu informieren, wann die Infusion abgebrochen werden muss. Diese Echtzeit-Bildführung wird eine Voraussetzung für die klinische Implementierung einer lokalen Bereitstellung einer ablativen Lösung sein.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnalyzeDirect v12.0	Messschieber	n/a	Für die Mikro-CT-Bildverarbeitung
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL	Allivet	50647	Für die entzündungshemmende Behandlung
Evans blue	Sigma	E2129-50G	Für die Visualisierung von Injektionen
Heißes Wasserbad	Toolots	Yidu_HH-S2	Für die Vorbereitung von Carprofen-Bechern
Imaris	Bitplane	n/a	Für die konfokale Bildverarbeitung
MediGel Sucralose Cups	ClearH2O	74-02-5022	Für die Lieferung von Carprofen
Modell 1705 RN Spritze, 50μ L	Hamilton	7655-01	Für die intraduktale Injektion
Photoshop 2021	Adobe	n/a	Für die Bildverarbeitung
Quantum GX2 microCT Imaging System	Perkin Elmer	Für die Mikro-CT-Bildaufnahme
Kleine Nabe RN-Nadel, 34 Gauge, benutzerdefiniert (12 Grad; Abschrägungswinkel, 0,375 Zoll, Spitzenform 4)	Hamilton	207434	Für intraduktale Injektion
Stereomikroskop der Serie SZM	AmScope	SM-4TPZ-144	Für die intraduktale
Injektion Steriler blauer Lebensmittelfarbstoff	McCormick	930641	Für die Visualisierung von Injektionen
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	ThermoFisher	14190250	Für die Lösungsvorbereitung
Aufkleber DOT	Scientific	DOTSCI-C50	Für die Zubereitung von Carprofen-Bechern
Saccharose	Calbiochem	8550-5KG	Für intraduktale
Injektionsspritzen	Fisher	14-826-79	Für die Zubereitung von Carprofen-Bechern
Vortex	VWR	10153-834	Für die Zubereitung von Carprofen-Bechern
Wärmende Pumpe/Pad(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	Für die intraduktale Injektion/präoperative Vorbereitung