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Methodenartikel

Im lebenden Organismus Positronen-Emissions-Tomographie zur Aufdeckung von Aktivitätsmustern, die durch tiefe Hirnstimulation bei Ratten induziert werden

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DOI:

10.3791/63478

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23. März 2022

 ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine präklinische experimentelle Methode zur Bewertung der metabolischen Neuromodulation, die durch akute Tiefe Hirnstimulation mit in vivo FDG-PET induziert wird. Dieses Manuskript umfasst alle experimentellen Schritte, von der stereotaktischen Chirurgie über die Anwendung der Stimulationsbehandlung bis hin zur Aufnahme, Verarbeitung und Analyse von PET-Bildern.

Zusammenfassung

Die Tiefenhirnstimulation (THS) ist eine invasive neurochirurgische Technik, die auf der Anwendung elektrischer Impulse auf Gehirnstrukturen basiert, die an der Pathophysiologie des Patienten beteiligt sind. Trotz der langen Geschichte der THS bleiben ihr Wirkmechanismus und die entsprechenden Protokolle unklar, was die Notwendigkeit von Forschung unterstreicht, um diese Rätsel zu lösen. In diesem Sinne stellt die Bewertung der In-vivo-Effekte von THS mit funktionellen Bildgebungsverfahren eine leistungsfähige Strategie dar, um den Einfluss der Stimulation auf die Gehirndynamik zu bestimmen. Hier wird ein experimentelles Protokoll für präklinische Modelle (Wistar-Ratten) in Kombination mit einer Längsschnittstudie [18F]-Fluordesoxyclucose-Positronen-Emissions-Tomographie (FDG-PET) beschrieben, um die akuten Folgen von THS auf den Hirnstoffwechsel zu beurteilen. Zunächst wurden die Tiere stereotaktisch operiert, um Elektroden bilateral in den präfrontalen Kortex zu implantieren. Ein postoperativer Computertomograph (CT) jedes Tieres wurde erstellt, um die Elektrodenplatzierung zu überprüfen. Nach einer Woche der Erholung wurde von jedem operierten Tier ein erstes statisches FDG-PET ohne Stimulation (D1) und zwei Tage später (D2) ein zweites FDG-PET erworben, während die Tiere stimuliert wurden. Dazu wurden die Elektroden nach der Verabreichung von FDG an die Tiere mit einem isolierten Stimulator verbunden. So wurden die Tiere während der FDG-Aufnahmephase (45 min) stimuliert und die akuten Auswirkungen von THS auf den Gehirnstoffwechsel aufgezeichnet. Angesichts des explorativen Charakters dieser Studie wurden FDG-PET-Bilder durch einen voxelweisen Ansatz analysiert, der auf einem gepaarten T-Test zwischen D1- und D2-Studien basiert. Insgesamt ermöglicht die Kombination von THS- und Bildgebungsstudien die Beschreibung der Neuromodulationsfolgen auf neuronale Netze, was letztendlich dazu beiträgt, die Rätsel rund um THS zu lösen.

Einleitung

Der Begriff Neurostimulation umfasst eine Reihe verschiedener Techniken, die darauf abzielen, das Nervensystem mit einem therapeutischen Ziel1 zu stimulieren. Unter ihnen sticht die Tiefe Hirnstimulation (THS) als eine der am weitesten verbreiteten Neurostimulationsstrategien in der klinischen Praxis hervor. THS besteht aus der Stimulation tiefer Hirnkerne mit elektrischen Impulsen, die von einem Neurostimulator abgegeben werden, der direkt in den Körper des Patienten implantiert wird, durch Elektroden, die in das Gehirnziel platziert werden, um durch stereotaktische Chirurgie moduliert zu werden. Die Anzahl der Artikel, die die Durchführbarkeit der DBS-Anwendung bei verschiedenen neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen bewerten, wächst kontinuierlich2, obwohl nur einige von ihnen von der Food and Drug Association (FDA) zugelassen wurden (d. h. essentieller Tremor, Parkinson-Krankheit, Dystonie, Zwangsstörung und medizinisch refraktäre Epilepsie)3 . Darüber hinaus wird eine große Anzahl von Gehirnzielen und Stimulationsprotokollen für die THS-Behandlung von viel mehr Pathologien als offiziell genehmigt erforscht, aber keiner von ihnen gilt als endgültig. Diese Inkonsistenzen in der THS-Forschung und den klinischen Verfahren können zum Teil auf ein mangelndes vollständiges Verständnis ihres Wirkmechanismus zurückzuführensein 4. Daher werden große Anstrengungen unternommen, um die In-vivo-Effekte von THS auf die Gehirndynamik zu entschlüsseln, da jeder Fortschritt, wie klein er auch sein mag, dazu beitragen wird, DBS-Protokolle für einen größeren therapeutischen Erfolg zu verfeinern.

In diesem Zusammenhang öffnen molekulare bildgebende Verfahren ein direktes Fenster, um in vivo neuromodulatorische Effekte von THS zu beobachten. Diese Ansätze bieten die Möglichkeit, nicht nur die Auswirkungen der THS während der Anwendung zu bestimmen, sondern auch die Art ihrer Folgen zu entschlüsseln, unerwünschte Nebenwirkungen und klinische Verbesserungen zu verhindern und sogar die Stimulationsparameter an die Bedürfnisse des Patienten anzupassen5. Unter diesen Methoden ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) mit 2-Desoxy-2-[18F]fluor-D-Glucose (FDG) von besonderem Interesse, da sie spezifische Echtzeitinformationen über den Aktivierungszustand verschiedener Hirnregionen liefert6. Insbesondere bietet die FDG-PET-Bildgebung eine indirekte Bewertung der neuronalen Aktivierung basierend auf dem physiologischen Prinzip der metabolischen Kopplung zwischen Neuronen und Gliazellen6. In diesem Sinne haben mehrere klinische Studien DBS-modulierte Gehirnaktivitätsmuster unter Verwendung von FDG-PET berichtet (siehe3 für die Übersicht). Dennoch haben klinische Studien leicht einige Nachteile, wenn sie sich auf Patienten konzentrieren, wie Heterogenität oder Rekrutierungsschwierigkeiten, die ihr Forschungspotenzial stark einschränken6. Dieser Kontext führt dazu, dass Forscher Tiermodelle menschlicher Erkrankungen verwenden, um biomedizinische Ansätze vor ihrer klinischen Translation zu bewerten oder, wenn sie bereits in der klinischen Praxis angewendet werden, den physiologischen Ursprung therapeutischer Vorteile oder Nebenwirkungen zu erklären. Trotz der großen Distanzen zwischen der menschlichen Pathologie und dem modellierten Zustand bei Labortieren sind diese präklinischen Ansätze für einen sicheren und effektiven Übergang in die klinische Praxis unerlässlich.

Dieses Manuskript beschreibt ein experimentelles DBS-Protokoll für murine Modelle, kombiniert mit einer longitudinalen FDG-PET-Studie, um die akuten Folgen von THS auf den Gehirnstoffwechsel abzuschätzen. Die mit diesem Protokoll erzielten Ergebnisse können dazu beitragen, die komplizierten modulatorischen Muster zu entschlüsseln, die durch THS auf die Gehirnaktivität induziert werden. Daher wird eine geeignete experimentelle Strategie zur Untersuchung der Konsequenzen der Stimulation in vivo bereitgestellt, die es Klinikern ermöglicht, therapeutische Effekte unter bestimmten Umständen zu antizipieren und dann die Stimulationsparameter an die Bedürfnisse des Patienten anzupassen.

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Protokoll

Versuchstierversuche wurden gemäß der Richtlinie 2010/63/EU des Rates der Europäischen Gemeinschaften durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche des Krankenhauses Gregorio Marañón genehmigt. Eine grafische Zusammenfassung des Versuchsprotokolls ist in Abbildung 1A dargestellt.

1. Lokalisierung des Gehirnziels durch in vivo Neuroimaging

  1. Tierpräparation
    HINWEIS: Männliche Wistar-Ratten von ~ 300 g wurden verwendet.
    1. Legen Sie das Tier in einen Anästhesie-Induktionskasten und verschließen Sie die Oberseite.
    2. Schalten Sie den Sevofluran-Vaporizer ein (5% für Induktion in 100%O2). Wenn die Ratte betäubt ist, schalten Sie den Gasfluss auf den Nasenzapfen um. Bestätigen Sie den Zustand der Anästhesie, indem Sie die Rattenpfote kneifen.
    3. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf das CT-Bett und behalten Sie die Sevofluran-Anästhesie bei (3% für die Aufrechterhaltung in 100% O2).
  2. CT-Bildgebung
    HINWEIS: Die Auswahl von Stromstärke, Spannung, Anzahl der Projektionen, Anzahl der Aufnahmen und Voxelauflösung hängt vom CT-Scanner ab. Hier wurden folgende Parameter verwendet: 340 mA, 40 KV, 360 Projektionen, 8 Aufnahmen und 200 μm Auflösung 7,8,9.
    1. Befestigen Sie die Gesichtsmaske oder den Nasenkegel an der Ratte.
    2. Sichern Sie den Rattenkörper an Kopf, Schultern, Hüften und Schwanz mit Seidenband, um genügend Halt ohne Beschädigung zu gewährleisten.
    3. Überwachen Sie die Ratte kontinuierlich.
    4. Suchen Sie den Kopf in der Mitte des Sichtfeldes des CT-Scanners.
    5. Fahren Sie mit der Erfassung des CT-Bildes mit den Aufnahmeparametern gemäß den Spezifikationen des Scanners fort.
    6. Nach 10 Minuten, wenn der In-vivo-CT-Scan abgeschlossen ist, stoppen Sie den Sevofluran-Fluss und legen Sie die Ratte in den MRT-Scanner.
  3. MR-Bildgebung
    HINWEIS: Die Spezifikationen der Scanerfassung variieren je nach Scanner, einschließlich verschiedener Softwaresysteme und, was noch wichtiger ist, der spezifischen Forschungsfrage. Hier kam ein 7-Tesla-Scanner zum Einsatz. Es wurde eine T2-gewichtete Spin-Echo-Sequenz 7,8,9 mit TE = 33 ms, TR = 3732 ms und einer Schichtdicke von 0,8 mm (34 Scheiben), Matrixgröße von 256 x 256 Pixel mit einem Sichtfeld von 3,5 x 3,5 cm2 verwendet.
    1. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf das MRT-Bett und behalten Sie die Sevofluran-Anästhesie bei (3% für die Aufrechterhaltung in 100% O2).
    2. Befestigen Sie den Kopf an einem stereotaktischen Rahmen, der auf dem Scannerbett platziert ist, um Kopfbewegungen während der MRT-Erfassung zu vermeiden. Sichern Sie auch den Rest des Rattenkörpers mit Seidenband.
    3. Suchen Sie den Kopf in der Mitte des Sichtfeldes des MRT-Scanners.
    4. Sobald die Position korrekt ist, fahren Sie mit der Aufnahme des MRT-Bildes fort.
    5. Wenn die In-vivo-MRT-Untersuchung abgeschlossen ist, stoppen Sie den Sevofluranfluss und setzen Sie die Ratte in ihren Käfig.
    6. Stellen Sie eine Heizlampe in der Nähe des Käfigs auf, da Ratten während des Scans normalerweise ihre Körpertemperatur senken.
    7. Überwachen Sie die Ratte bis zur Erholung von der Anästhesie.
  4. Atlas-Kolokalisierung und Berechnung der Zielkoordinaten
    1. Sobald CT- und MRT-Bilder nach den Empfehlungen des Scanners aufgenommen und rekonstruiert wurden, registrieren Sie die CT- und MRT-Bilder mit.
    2. Verwenden Sie eine Bildbearbeitungssoftware, um CT und MRT räumlich zu normalisieren, indem Sie einen automatischen starren Registrierungsalgorithmus verwenden, der auf gegenseitigen Informationen basiert10.
    3. Lokalisieren Sie die Bregma-Linie im mitregistrierten Bild und messen Sie den Abstand in der vorderen / hinteren (AP: +3,5 mm), Mittellinie/lateralen (ML: +0,6 mm) und dorsoventralen (DV: -3,4 mm) Achse von Bregma zum Ziel (d. H. Medialer präfrontaler Kortex, mPFC), gemäß dem Paxinos und Watson Rattenhirnatlas11.
      HINWEIS: Die Koordinaten von Bregma zum Ziel können zwischen Ratten unterschiedlich sein, wenn Gewicht, Größe, Geschlecht und Rasse unterschiedlich sind.

2. Stereotaktische Chirurgie

VORSICHT: Autoklavieren Sie alle chirurgischen Materialien, Implantate und stereotaktischen Einheiten vor Gebrauch und desinfizieren Sie den chirurgischen Bereich, um Infektionen und Komplikationen zu vermeiden, die das Tierwohl beeinträchtigen können. Verwenden Sie sterile OP-Handschuhe und bedecken Sie das Tier mit klebrigen Vorhängen, um eine Kontamination zu vermeiden.

  1. Tierpräparation und Anästhesie
    1. Den Tieren wurden am Tag vor der Operation 0,1 mg/kg Buprenorphin intraperitoneal verabreicht. Legen Sie das Tier in eine Anästhesie-Induktionsbox-Kammer und versiegeln Sie die Oberseite.
    2. Schalten Sie den Sevofluran-Vaporizer ein (5% für Induktion in 100%O2).
    3. Wenn die Ratte liegend ist, schalten Sie den Sevofluran-Vaporizer aus und entfernen Sie die Ratte aus der Boxkammer.
    4. Intraperitoneal eine Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) verabreichen, um das Tier zu betäuben.
    5. Warten Sie, bis das Tier vollständig betäubt ist. Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie den Interdigitalbereich kneifen.
    6. Rasieren Sie den Bereich zwischen den Ohren und den Augen.
  2. Platzierung im stereotaktischen Rahmen und Kraniotomie
    1. Stellen Sie das Tier in Bauchlage auf den stereotaktischen Rahmen und verwenden Sie den Kopfhalteadapter für Ratten, um das Tier während der Operation in der richtigen Position zu halten.
    2. Stellen Sie die Unbeweglichkeit des Kopfes sicher, indem Sie die Rattenohrstangen verwenden. Seien Sie vorsichtig mit dem Einführen der Ohrbügel, da ein zu tiefes Einführen das Trommelfell beschädigen kann.
    3. Tragen Sie ein ophthalmologisches Gleitgel auf die Augen auf, um Trockenheit während der Operation zu verhindern, und bedecken Sie sie mit steriler Gaze.
    4. Bedecken Sie das Tier mit klebrigen Vorhängen, um eine Kontamination zu vermeiden.
    5. Tragen Sie Jodpovidonlösung auf den rasierten Bereich auf und reinigen Sie ihn mit steriler Gaze.
    6. Tragen Sie Mepivacain in Gel auf den rasierten Bereich auf, um den lokalen Bereich zu betäuben.
    7. Machen Sie einen Längsschnitt in der Haut über dem Schädel zwischen den Ohren, der sich 1,5-2 cm von Lambda bis Bregma (dh vom Schädelscheitel zu den Augen) erstreckt.
    8. Legen Sie den Schädel mit Hilfe von 2 oder 3 Klemmen frei. Entfernen Sie das Periost mit einem Wattestäbchen und reinigen Sie das Blut mit Kochsalzlösung, um Bregma und die sagittalen Nähte freizulegen. Entfernen Sie die überschüssige Kochsalzlösung mit Gaze.
    9. Kratzen Sie die Schädeloberfläche mit einem Skalpell, um die Haftung des Zahnzements zu verbessern. Reinigen Sie den Bereich mit einem mit Wasserstoffperoxid getränkten Wattestäbchen.
  3. Elektrodenplatzierung und Fixierung am Schädel
    1. Begradigen Sie die Elektroden mit einer Kunststoffpinzette, um die richtige Platzierung während der Operation zu gewährleisten.
      HINWEIS: In diesem Protokoll werden konzentrische bipolare Platin-Iridium-Elektroden mit Masse verwendet.
    2. Suchen Sie eine Elektrode am Halter des rechten Arms des stereotaktischen Rahmens.
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, den Halter an die Elektrode anzupassen, um sie besser zu fixieren (siehe Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Elektrode parallel zur Achse des Halters ist.
    3. Bewegen Sie den rechten Arm, der die Elektrode hält, durch den stereotaktischen Rahmen und legen Sie die Spitze der Elektrode genau über Bregma. Versuchen Sie, die Elektrodenspitze so nah wie möglich an den Schädel zu bringen, ohne sie jedoch zu berühren, um eine Verformung der Elektrode zu vermeiden, und notieren Sie sich die resultierenden Koordinaten für Bregma, die vom stereotaktischen Rahmen bereitgestellt werden. Machen Sie eine Markierung auf dem Schädel, die die Ausgangsposition der Elektrode mit einem chirurgischen Stift anzeigt.
    4. Bewegen Sie den Halter zu den AP- und ML-Koordinaten, die Sie in Schritt 1.4.3 erhalten haben, und markieren Sie den Schädel mit einem chirurgischen Stift, der die Position des Elektrodenziels anzeigt.
    5. Entfernen Sie den rechten Arm des stereotaktischen Rahmens, der die Elektrode hält. Achten Sie darauf, nichts mit der Elektrode zu berühren.
    6. Verwenden Sie eine kleine elektrische Bohrmaschine, um ein Loch durch den Schädel (ca. 1-1,5 mm Durchmesser) in der Zielposition zu machen, bis die Dura sichtbar ist. Stoppen Sie Blutungen mit einem Wattestäbchen.
    7. Bohren Sie 4 Löcher entlang des Schädels, um 4 Schrauben (vorzugsweise Edelstahlschrauben von 2-3 mm Länge) zu finden, um die Oberfläche des Dentalzements zu vergrößern und den Boden zu lokalisieren. Befestigen Sie die 4 Schrauben.
    8. Lokalisieren Sie den rechten Arm des stereotaktischen Rahmens mit der rechten Elektrode. Bewegen Sie den Arm in die berechnete Position, die mit dem Loch übereinstimmen sollte. Senken Sie dann die Elektrode, bis sie die Dura Mater berührt. Diese Position dient als 0-Ebene in DV-Richtung.
    9. Führen Sie die Spitze der Elektrode in DV-Richtung ein, indem Sie die DV-Position in Schritt 1.4.3 verwenden. Reinigen Sie das Blut und die Zerebrospinalflüssigkeit um den Bereich der Elektrode mit einem Wattestäbchen.
    10. Befestigen Sie die Masse an einer der Schrauben, die der Elektrode am nächsten sind.
    11. Tragen Sie Zahnzement um die Elektrode und Schrauben auf und achten Sie darauf, den Zahnzement zu formen und scharfe Kanten zu vermeiden, die das Tier verletzen könnten. Zahnzement wird in einer Schicht aufgetragen, um eine Überhitzung / thermische Verletzung des Gewebes / Schädels zu verhindern. Dicke Schichten benötigen mehr Zeit, um auszuhärten, bevor zusätzliche Schichten hinzugefügt werden. Stellen Sie sicher, dass der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, bevor Sie die Elektrode aus dem Halter entfernen.
      VORSICHT: Bei der Herstellung des Dentalzements entstehen giftige Dämpfe aus der Mischung, die mit der Erstarrung des Zements enden. Tragen Sie daher ab diesem Zeitpunkt und bis zum Ende der Operation eine Schutzmaske, die gegen chemische Gase wirksam ist.
    12. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang aus den Schritten 2.3.2-2.3.11 für die andere Hemisphäre des Gehirns.
    13. Tragen Sie mehr Zahnzement auf, um eine Kappe zu bilden, ohne die Elektrode zu bedecken. Warten Sie, bis es aushärtet.
    14. Verwenden Sie geflochtene Naturseide nicht resorbierbare Naht 1/0, mit einer Dreiecksnadel, um vor und hinter der Kappe zu nähen. Entfernen Sie bei Bedarf die nicht resorbierbaren Nähte zu einem bestimmten Zeitpunkt entsprechend der Körperregion, in der sie sich befinden. Verwenden Sie eine Jodpovidonlösung, um den chirurgischen Bereich zu desinfizieren.
    15. Entfernen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen.
  4. CT-Bildgebung zur Bestätigung der Elektrodenplatzierung
    1. Führen Sie die Schritte 1.2.4-1.2.5 aus und sehen Sie sich Abbildung 1C an.
    2. Sobald der In-vivo-CT-Scan abgeschlossen ist, setzen Sie die Ratte in ihren Käfig.
    3. Führen Sie die Schritte 1.3.6 aus. und 1.3.7.
  5. Nachsorge
    1. Antibiotikum (Ceftriaxon, 100 mg/kg, subkutan) für 5 Tage und Analgetikum (Buprenorphin, 0,1 mg/kg, intraperitoneal) für 3 Tage als postoperative Behandlung verabreichen. Dieses Antibiotika-Regime kann um 5 Tage verlängert werden, wenn Anzeichen einer Infektion (Rötung, Schwellung und Exsudat) um die Kappe herum beobachtet werden.
    2. Führen Sie täglich eine visuelle Inspektion jedes Tieres durch, suchen Sie nach Anzeichen von Schmerzen oder Stress und reinigen Sie die Kappe mit Jodpovidonlösung.
    3. Intensivpflege für bis zu 1 Woche nach der Operation.

3. PET/CT-Bildgebung

HINWEIS: Jedes Tier wird zwei PET/CT-Studien (d. h. in Abwesenheit und während der THS-Verabreichung) unter inhalativer Anästhesie unterzogen, um die akuten Wirkungen der elektrischen Stimulation zu beurteilen. Beide Scan-Sitzungen folgen dem gleichen Bildgebungsprotokoll und werden 1 Woche nach der Operation (D1, ohne Stimulation) und 2 Tage später (D2, während DBS) durchgeführt.

  1. Tierpräparation und Anästhesie
    1. Beschleunigen Sie die Ratte für 8-12 h vor jedem PET-Scan, um eine höhere Gehirnaufnahme von FDG zu ermöglichen und das Signal-Rausch-Verhältniszu verbessern 12.
    2. Legen Sie das Tier in einen Anästhesie-Induktionskasten und verschließen Sie die Oberseite.
    3. Schalten Sie den Sevofluran-Vaporizer ein (5% für Induktion in 100%O2).
    4. Wenn die Ratte betäubt ist, schalten Sie den Gasfluss auf den Nasenzapfen um.
  2. FDG-Injektions- und Aufnahmezeit
    ACHTUNG: FDG ist ein Radiotracer, also erwägen Sie Strahlenschutzmaßnahmen, um eine Radioaktivitätsbelastung zu vermeiden. Bestätigen Sie, dass die Einrichtung über alle Genehmigungen verfügt, mit radioaktiven Verbindungen zu arbeiten.
    1. Bewahren Sie die FDG-Durchstechflasche in einem mit Blei ausgekleideten Schrank auf, bis sie verwendet wird, um unerwünschte Radioaktivitätsexposition zu vermeiden.
    2. Füllen Sie eine kleine Spritze (~27G) mit ~37 MBq der FDG-Lösung in dem weniger möglichen Volumen, wie in einem Aktivimeter gemessen.
    3. Legen Sie ein Heizkissen unter den Schwanz des Tieres oder verwenden Sie Infrarotlicht, um die Schwanzvenen zu erweitern.
    4. Sobald die Seitenvenen in der Spitze des Schwanzes sichtbar sind, reinigen Sie den Bereich mit Hygienealkohol (96%).
    5. Injizieren Sie die FDG-Lösung durch eine der seitlichen Schwanzvenen und nähern Sie sich der Vene mit einer Spritze parallel zu ihrer Flugbahn und mit der Abschrägung der Nadel nach oben.
    6. Schalten Sie die Narkose aus und setzen Sie das Tier wieder in seinen Käfig, um sich unter einer Heizlampe vollständig zu erholen.
    7. Lassen Sie 45 Minuten Radiotracer aufnehmen, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen. Halten Sie das Tier während dieser Zeit wach und in einer bleiabgeschirmten Kammer.
    8. Im Falle der D2-Studie ist DBS wie unten in Abschnitt 4 (Verabreichung elektrischer Stimulation) während der FDG-Aufnahmephase erläutert.
  3. PET-Erfassung und Bildgebungsrekonstruktion
    HINWEIS: Die Spezifikationen für die PET-Bildaufnahme hängen vom Scanner und der Scanzeit ab. Für dieses Protokoll wurde ein statisches PET-Bild für 45 min mit einem Kleintier-PET/CT-Scanner unter Verwendung eines Energiefensters von 400-700 keV 7,8,9 aufgenommen. Überprüfen Sie die Spezifikationen der PET/CT-Ausrüstung, bevor Sie das Erfassungsprotokoll entwerfen.
    1. 45 Minuten nach der FDG-Injektion das Tier in eine Anästhesie-Induktionsbox geben und die Oberseite versiegeln.
    2. Schalten Sie den Sevofluran-Vaporizer ein (5% für Induktion in 100%O2).
    3. Das Tier wird in das PET/CT-Bett gebracht und in Rückenlage gelegt, wobei die Nase am Nasenzapfen der Anästhesie befestigt und die Sevofluran-Anästhesie aufrechterhalten wird (3% für die Aufrechterhaltung in 100% O2). Bestätigen Sie den Zustand der Anästhesie, indem Sie die Rattenpfote kneifen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3.
    5. Suchen Sie den Kopf in der Mitte des Sichtfeldes des PET-Scanners.
    6. Erfassen Sie das statische PET-Bild mit Erfassungsparametern gemäß den Spezifikationen des Scanners.
    7. Rekonstruieren Sie das Bild mit einem 2D-OSEM (Ordered Subset Expectation Maximization Algorithm) und wenden Sie Zerfalls- und Totzeitkorrekturen 7,8,9 an.
    8. Wenn der In-vivo-PET-Scan abgeschlossen ist, halten Sie den Fluss von Sevofluran zur Ratte aufrecht, um anschließend mit der CT-Erfassung fortzufahren, ohne die Kopfposition des Tieres auf dem Scannerbett zu verschieben.
  4. CT-Akquisition
    1. Ohne die Position des Tieres in Bezug auf die vorherige PET-Aufnahme zu ändern, fahren Sie mit der Aufnahme des CT-Bildes fort.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3-1.2.5.
    3. Sobald der In-vivo-CT-Scan abgeschlossen ist, stoppen Sie den Sevofluran-Fluss und setzen Sie die Ratte zur Erholung in ihren jeweiligen Käfig.
    4. Führen Sie die Schritte 1.3.6 aus. und 1.3.7.
    5. Halten Sie das Tier in einer bleiabgeschirmten Kammer, bis die Radioaktivität vollständig zerfällt.

4. Verabreichung von Elektrostimulation

HINWEIS: Die elektrische Stimulation erfolgt während der FDG-Aufnahmephase in der D2-Bildgebungssitzung. Für dieses Protokoll wurde die Stimulation mit einem isolierten Stimulator durchgeführt, mit einer hochfrequenten (130 Hz) elektrischen Stimulation in einem Konstantstrommodus, 150 μA, und einer Pulsbreite von 100 μs 7,13,14.

  1. Konfiguration des DBS-Stimulators
    1. Bereiten Sie den isolierten Stimulator und die erforderlichen Drähte in einem breiten und ruhigen Raum vor, mit genügend Platz für die Tierkäfige und minimalem Einfluss von potenziell störenden Reizen.
    2. Verbinden Sie die Stimulationsdrähte mit den Drehgelenken, damit sich die Tiere in ihren Käfigen und mit dem Stimulator frei bewegen können.
    3. Stellen Sie die Stimulationsparameter entsprechend den Anforderungen der Studie ein.
    4. Verwenden Sie ein Oszilloskop, um den aktuellen Modus, die Frequenz und die Pulsbreite zu überprüfen. Bestätigen Sie die biphasische Wellenform mit einer rechteckigen Impulsform (Abbildung 1D).
  2. DBS-Lieferung
    1. Nach der D1-Bildgebung und bis zur D2-Erfassung werden die Tiere einem täglichen Gewöhnungsprotokoll (45 min/Tag) unterzogen, um sie an das Stimulationssystem und die Handhabung durch den Bediener zu gewöhnen, um unerwünschte Stressreaktionen in D2 zu vermeiden. Verbinden Sie das Stimulationssystem mit jedem Tier, ohne jedoch die Stimulation einzuschalten.
    2. Sobald der Stimulator eingerichtet und dem Tier FDG injiziert wurde, verbinden Sie den Schwenk mit den Elektroden und schalten Sie den Stimulator ein.
    3. Schalten Sie nach 45 Minuten den Stimulator aus, trennen Sie das Tier vom Wirbel und übertragen Sie es schnell in eine Anästhesieinduktionskammer, um Schritt 3.3 zu beginnen.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Versuchsplan . (A) Zusammenfassung der in diesem Protokoll befolgten Versuchsschritte. (B) Repräsentative Bilder einer Halteranpassung zur besseren Fixierung der Elektrode, mit (links) und ohne (rechts) Elektrode. (C) Fusionsbild eines MRT mit einem CT eines operierten Tieres, das die korrekte Elektrodenplatzierung im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) zeigt. (D) Screenshot des Oszilloskopbildschirms mit der biphasischen Stimulationswellenform. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. PET-Bildverarbeitung und -analyse

HINWEIS: Führen Sie die gleiche Bildverarbeitung für Bilder von D1 und D2 durch, um vergleichbare Daten für die nachfolgende voxelweise statistische Analyse zu erhalten.

  1. Räumliche Erfassung von PET-Bildern
    1. Verwenden Sie spezielle Bildbearbeitungssoftware. Der gesamte Registrierungsworkflow ist in Abbildung 2 dargestellt.
    2. Zentrieren und schneiden Sie jedes PET- und CT-Bild in das Sichtfeld. Registrieren Sie das PET-Bild in seinem CT unter Verwendung eines automatischen starren Registrierungsalgorithmus, der auf gegenseitigen Informationen basiert15.
      HINWEIS: Starre Registrierungsmethoden sind nur dann geeignet, wenn es keine signifikanten Unterschiede in Körpergewicht oder Körpergröße zwischen den Tieren gibt. Andernfalls sollten Sie die Verwendung elastischer Methoden in Betracht ziehen.
    3. Registrieren Sie jedes CT-Bild in einem Referenz-CT, das räumlich im Paxinos und Watson Rattenhirnatlas11 registriert ist, wie in Schritt 5.1.2. Speichern Sie die resultierenden Transformationsparameter.
    4. Wenden Sie die in Schritt 5.1.3 erhaltenen Transformationsparameter an. zu jedem registrierten PET-Bild, das das auf dem Referenz-CT-Bild registrierte PET-Bild erhält.
    5. Speichern Sie alle fertigen PET-Bilder im Nifti-Format.
  2. Intensitätsnormalisierung und Glättung von PET-Bildern
    HINWEIS: Die Normalisierung und Glättung der Intensität erfolgt mit verschiedenen internen Skripten, die auf öffentlich verfügbaren Ressourcen basieren.
    1. Glätten Sie die PET-Bilder mit einem isotropen Gaußkern von 2 mm Full-Width Half Maximum (FWHM), um mögliche Registrierungsfehler zu korrigieren.
      HINWEIS: Die Größe des Glättungsfilters hängt von der Auflösung der PET-Erfassung ab, es wird jedoch empfohlen, einen Filter mit der 2-3-fachen Voxelgröße von FWHM zu verwenden.
    2. Normalisieren Sie die Intensität der PET-Voxelwerte unter Verwendung einer geeigneten Referenzcluster-Normalisierungsmethode16.
    3. Segmentieren Sie eine Gehirnmaske aus einem Referenz-MRT, das für das Referenz-CT-Bild registriert ist.
    4. Tragen Sie die Gehirnmaske auf jedes PET-Bild auf, um Voxel außerhalb des Gehirns von der voxelweisen Analyse auszuschließen.
  3. Voxel-weise Analyse
    HINWEIS: Die statistische Analyse, bestehend aus einer voxelweisen Analyse der PET-Bilddaten, wurde mit einer speziellen Bildanalysesoftware17 durchgeführt.
    1. Vergleichen Sie D1- und D2-PET-Bilder mit einem gepaarten T-Test und legen Sie angemessene statistische signifikante Schwellenwerte fest.
    2. Betrachten Sie als definitive Ergebnisse der Analyse nur die Cluster, die größer als 50 benachbarte Voxel sind, um Typ-I-Fehler zu reduzieren.
    3. Stellen Sie die Ergebnisse in T-Maps dar, die auf einem T2-MRT überlagert sind und die Veränderungen im Glukosehirnstoffwechsel zeigen, die durch DBS induziert werden (kalte Farben für FDG-Reduktion und warme Farben für FDG-Inkrement).

figure-protocol-2
Abbildung 2: Registrierungs-Workflow für Mikro-PET/CT-Bildgebung. Detaillierte Schritte der räumlichen Normalisierungsverarbeitung von PET-Bildern für die anschließende voxelweise Analyse mit SPM-Software (Statistical Parametric Mapping). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Ergebnisse

Die Tiere wurden am Ende der Studie oder wenn das Wohlergehen des Tieres beeinträchtigt war, mit CO2 geopfert. Ein Beispiel für eine vollständige PET/CT-Studie an einem operierten Tier ist in Abbildung 3 dargestellt. So kann die in das Rattengehirn eingeführte Elektrode in dem in Abbildung 3A gezeigten CT-Bild deutlich beobachtet werden. Diese Bildgebungsmodalität liefert gute anatomische Informationen und erleichtert die Registrierung von FDG-PET-Bil...

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Diskussion

Angesichts der Fortschritte im Verständnis der Gehirnfunktion und der neuronalen Netzwerke, die an der Pathophysiologie neuropsychiatrischer Erkrankungen beteiligt sind, erkennen immer mehr Forschungen das Potenzial von THS in einer Vielzahl von neurologisch basierten Pathologien2. Der Wirkmechanismus dieser Therapie bleibt jedoch unklar. Mehrere Theorien haben versucht, die unter spezifischen pathologischen und stimulierenden Umständen erzielten Wirkungen zu erklären, aber die Heterogenität der v...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass im Zusammenhang mit diesem Artikel keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken Prof. Christine Winter, Julia Klein, Alexandra de Francisco und Yolanda Sierra für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Optimierung der hier beschriebenen Methodik. MLS wurde vom Ministerio de Ciencia e Innovación, Instituto de Salud Carlos III (Projektnummer PI17/01766 und Fördernummer BA21/0030) unterstützt, kofinanziert vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE), "A way to make Europe"; CIBERSAM (Projektnummer CB07/09/0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (Projektnummer 2017/085); Fundación Mapfre; und Fundación Alicia Koplowitz.  MCV wurde von der Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno als Stipendiatin dieser Einrichtung und dem EU Joint Programme - Neurodegenerative Disease Research (JPND) unterstützt. DRM wurde unterstützt von Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid, kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds "Investing in your future" (Förderkennzeichen PEJD-2018-PRE/BMD-7899). NLR wurde unterstützt vom Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019". Die MD-Arbeit wurde vom Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) und dem Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) unterstützt (PT20/00044). Das CNIC wird vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dem Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) und der Stiftung Pro CNIC unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
7-Tesla Biospec 70/20 ScannerBruker, DeutschlandSN0021MRT-Scanner für die Bildgebung von Kleintieren
BetadineMeda Pharma S.L., Spanien644625.6Jodlösung (Jodopovidon)
Beurer IL 11BeurerSN87318Infrarotlicht Bipolares
Kabel 50 cm mit 50 cm Maschenweite bis zu 100 cmPlastics One, USA305-305 (CM)
Bipolares Kabel TT2  50 cm bis 100 cmPlastics One, USA305-340/2Bipolares Kabel TT2  50 cm bis 100 cm
BuprexSchering-Plough, S.A961425Buprenorphin (schmerzlindernd)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IMLaboratorio Reig Jofré S.A., Spanien624239.1Ceftriaxon (Antibiotikum)
KommutatorPlastics One, USASL2+2C4-Kanal-Kommutator für DBS
Konzentrische bipolare Platin-Iridium-ElektrodenPlastics One, USAMS303/8-AIU/SPCElektroden für DBS
DrillerBoshT58704Driller
FDGCurium Pharma Spain S.A., Spanien-----2-[18F]Fluor-2-desoxy-D-glucose (PET-Radiotracer)
HeizkissenDAGA, Spanien23115Heizkissen
KetolarPfizer S.L., Spanien776211.9Ketamin (Anästhetikum)
Lipolasic 2 mg/gBausch & Lomb S.A., Spanien65277Ophthalmisches Gleitgel
MatLab R2021aThe MathWorks, IncSupport-Software für SPM12
MRIcroMcCausland Center for Brain Imaging,  University of South Carolina, USAv2.1.58-0Software für die Vorverarbeitung und Analyse von Bildern
Multimodality Workstation (MMWKS)BiiG, SpanienSoftware für die Verarbeitung und Analyse von Bildern
Omicrom VISION VETRGB Medical Devices, Spanien731100 ReV BHerz-Kreislauf-Monitor für kleine
Bildgebung Prevex WattestäbchenPrevex, Finnland-----Wattestäbchen
SevoraneAbbVie Spain, S.L.U, Spain673186.4Sevofluran (Inhalationsanästhesie)
Kleine SchraubenMax Witte GmbH1,2 x 2 DIN 84 A2Kleine Schrauben
Standard U-Frame Stereotaxic Instrument für Ratte, 18° OhrstangeHarvard Apparatus, USA75-1801Zweiarmiger stereotaktischer Rahmen für
Ratten Statistical Parametric Mapping (SPM12)The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UKSPM12Software für voxelweise Bildgebungsanalyse
STG1004Multi Channel Systems GmbH, DeutschlandSTG1004Isolierter Stimulator
SuperArgus PET/CT-ScannerSedecal, SpanienNanoPET/CT-Scanner für die Bildgebung von Kleintieren
Nahtfaden mit Nadel, 1/ºLorca Marí n S.A., Spanien55325Geflochtene Naturseide nicht resorbierbare Naht 1/0, mit Dreiecksnadel
Technovit 4004 (Pulver und Flüssigkeit)Kulzer Technique, Deutschland64708471; 64708474Zahnzement aus Acryl für Kraniotomie-Hahn
Wistar Ratten (Rattus norvergicus)Charles River, SpanienTiereinrichtungTiermodell verwendet
XylagesicLaboratorios Karizoo, A.A, Spanien572599-4Xylazin (Anästhetikum)
Normon S.A., Spanien602910Mepivacain in Gel zur topischen Anwendung
S0026403

Referenzen

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FDG PET BildgebungHirnstoffwechselstereotaktische Chirurgiepr frontaler KortexElektrodenimplantationneuronale Netzwerkaktivit tBildgebung des Rattengehirnsvoxelweise Analyse
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