Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

Katarina Milićević; Andrej Korenić; Milena Milošević; Pavle R. Andjus

doi:10.3791/63483

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Methodenartikel

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

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DOI:

10.3791/63483

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23. Juni 2022

Katarina Milićević¹ , Andrej Korenić¹ , Milena Milošević¹ , Pavle R. Andjus¹

¹Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren hier ein Protokoll zur Vorbereitung von Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus Rattenkortices für die Zeitraffer-Videobildgebung von intrazellulärem Ca²⁺ für die Erforschung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose im hSOD1^{G93A-Rattenmodell} .

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden und wie diese Zellen zur Untersuchung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im hSOD1^G93A-Modell der Ratte verwendet werden können. Zuerst zeigt das Protokoll, wie Astrozyten und Mikroglia aus postnatalen Rattenkortikern isoliert und kultiviert werden, und dann, wie diese Kulturen durch Immunzytochemie unter Verwendung des Gliafibrillär-sauren Proteins (GFAP) -Markers von Astrozyten und des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1) Mikrogliamarkers charakterisiert und getestet werden. Im nächsten Schritt werden Methoden zur Farbstoffbeladung (calciumsensitives Fluo 4-AM) von kultivierten Zellen und die Aufzeichnung von Ca²⁺ Veränderungen in Videobildgebungsexperimenten an lebenden Zellen beschrieben.

Die Beispiele für Videoaufnahmen bestehen aus: (1) Fällen von Ca²⁺-Bildgebung von kultivierten Astrozyten, die akut Immunglobulin G (IgG) ausgesetzt waren, das von ALS-Patienten isoliert wurde und eine charakteristische und spezifische Reaktion im Vergleich zur Reaktion auf ATP zeigte, wie im selben Experiment gezeigt. Beispiele zeigen auch einen ausgeprägteren vorübergehenden Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration, hervorgerufen durch ALS-IgG in hSOD1^{G93A-Astrozyten} im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen; (2) Ca 2+ Bildgebung von kultivierten Astrozyten während einer Erschöpfung der Calciumspeicher durch Thapsigargin (Thg), einem nicht-kompetitiven Inhibitor des endoplasmatischen Retikulums Ca 2+ ATPase, gefolgt von einem speicherbetriebenen Calciumeintritt, der durch die Zugabe von Calcium in der Aufnahmelösung hervorgerufen wird, was den Unterschied zwischen dem Ca ²⁺-Speicherbetrieb in hSOD1^G93A und in nicht-transgenen Astrozyten zeigt; (3) Ca 2+-Bildgebung der kultivierten Mikroglia zeigte überwiegend eine mangelnde Reaktion auf ALS-IgG, während die ATP-Anwendung eine Ca²⁺-Veränderung hervorrief. Dieses Papier betont auch mögliche Vorbehalte und Vorsichtsmaßnahmen in Bezug auf kritische Zelldichte und Reinheit von Kulturen, indem die richtige Konzentration des Ca²⁺ Farbstoffs und der Farbstoffladetechniken gewählt wird.

Einleitung

Zellkulturtechniken haben zu zahlreichen Fortschritten in verschiedenen Bereichen der zellulären Neurophysiologie in Gesundheit und Krankheit geführt. Insbesondere primäre Zellkulturen, frisch isoliert aus dem neuronalen Gewebe eines Labortieres, ermöglichen es dem Experimentator, das Verhalten verschiedener Zellen in verschiedenen biochemischen Medien und physiologischen Setups genau zu untersuchen. Die Verwendung verschiedener fluoreszierender physiologischer Indikatoren wie der Ca²⁺-sensitiven Farbstoffe in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ermöglicht einen besseren Einblick in die zellulären biophysikalischen und biochemischen Prozesse in ....