Method Article

Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen aus mikrodissektierten Maus-Aderhautplexus

DOI:

10.3791/63487

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Brain-Immune Communication Lab, Institut Pasteur, 2Cytometry platform, CB UTechS, Institut Pasteur

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Gehirn wird nicht mehr als ein isoliert funktionierendes Organ betrachtet; Sich häufende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen im peripheren Immunsystem die Gehirnfunktion indirekt beeinflussen können. An der Schnittstelle zwischen dem Gehirn und dem systemischen Kreislauf wurden die Aderhautplexus (CP), die die Blut-Cerebrospinal-Flüssigkeitsschranke bilden, als Schlüsselort der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation hervorgehoben. CP produziert die Zerebrospinalflüssigkeit, neurotrophe Faktoren und Signalmoleküle, die die Homöostase des Gehirns beeinflussen können. CP sind auch eine aktive immunologische Nische. Im Gegensatz zum Hirnparenchym, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich von Mikroglia besiedelt wird, rekapituliert die Heterogenität der CP-Immunzellen die Vielfalt anderer peripherer Organe. Die Vielfalt und Aktivität der CP-Immunzellen ändert sich mit Alterung, Stress und Krankheit und moduliert die Aktivität des CP-Epithels, wodurch die Gehirnfunktion indirekt beeinflusst wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, murine CP zu isolieren und etwa 90% der wichtigsten Immununtergruppen, die sie bevölkern, zu identifizieren. Diese Methode ist ein Werkzeug, um CP-Immunzellen zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Orchestrierung der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation zu verstehen. Das vorgeschlagene Protokoll könnte helfen zu entschlüsseln, wie CP-Immunzellen indirekt die Gehirnfunktion in der Gesundheit und über verschiedene Krankheitszustände hinweg modulieren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seit der Entdeckung der Blut-Hirn-Schranke durch Paul Erhlich im späten 19. Jahrhundert gilt das Gehirn als praktisch getrennt von den anderen Organen und dem Blutkreislauf. In den letzten zehn Jahren ist jedoch das Konzept entstanden, dass die Gehirnfunktion von verschiedenen biologischen Faktoren wie Darmmikrobiota und systemischen Immunzellen und -signalen geprägt wird1,2,3,4. Parallel dazu wurden andere Hirngrenzen wie Hirnhäute und Aderhautplexus (CP) als Schnittstellen des aktiven Immun-Hirn-Cross-Talks und nicht als inertes Barrieregewebe identifiziert5,6,7,8.

Die CP bilden die Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsschranke, eine der Grenzen, die das Gehirn und die Peripherie trennen. Sie befinden sich in jedem der vier Ventrikel des Gehirns, d.h. im dritten, vierten und beiden lateralen Ventrikeln, und grenzen an Bereiche an, die an der Neurogenese beteiligt sind, wie die subventrikuläre Zone und die subgranulare Zone des Hippocampus3. Strukturell bestehen die CP aus einem Netzwerk von fenestrierten Blutkapillaren, die von einer Monoschicht von Epithelzellen umgeben sind, die durch enge und adhärene Übergänge miteinander verbunden sind9,10. Zu den wichtigsten physiologischen Rollen des CP-Epithels gehören die Produktion von Zerebrospinalflüssigkeit, die das Gehirn von Abfallmetaboliten und Proteinaggregaten spült, sowie die Produktion und kontrollierte Blut-zu-Gehirn-Passage verschiedener Signalmoleküle, einschließlich Hormone und neurotropher Faktoren11,12,13. Sekretierte Moleküle aus CP beeinflussen die Aktivität des Gehirns, d.h. durch Modulation der Neurogenese und der Mikrogliafunktion14,15,16,17,18,19, was CP für die Homöostase des Gehirns entscheidend macht. CP engagieren sich auch in verschiedenen Immunaktivitäten; Während der Hauptimmunzelltyp im Gehirnparenchym unter nicht-pathologischen Bedingungen Mikroglia ist, ist die Vielfalt der CP-Immunzellpopulationen so breit wie in peripheren Organen3,7, was darauf hindeutet, dass verschiedene Kanäle der Immunregulation und -signalisierung am CP am Werk sind.

Der Raum zwischen den Endothel- und Epithelzellen, das CP-Stroma, wird hauptsächlich von grenzassoziierten Makrophagen (BAM) bevölkert, die proinflammatorische Zytokine und Moleküle im Zusammenhang mit der Antigenpräsentation als Reaktion auf Entzündungssignale exprimieren3. Ein weiterer Subtyp von Makrophagen, Kolmers Epiplexuszellen, sind auf der apikalen Oberfläche des CP-Epithels20 vorhanden. CP-Stroma ist auch eine Nische für dendritische Zellen, B-Zellen, Mastzellen, Basophile, Neutrophile, angeborene lymphatische Zellen und T-Zellen, die meist Effektor-Gedächtnis-T-Zellen sind, die in der Lage sind, Antigene des zentralen Nervensystems zu erkennen7,21,22,23,24. Darüber hinaus ändert sich die Zusammensetzung und Aktivität von Immunzellpopulationen am CP bei systemischer oder Gehirnstörung, beispielsweise während des Alterns10,14,15,21,25, der Störung der Mikrobiota7, des Stress26 und der Krankheit27,28. Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass diese Veränderungen indirekt die Gehirnfunktion beeinflussen, d.h. eine Verschiebung von CP CD4 + T-Zellen in Richtung Th2-Entzündung tritt bei der Gehirnalterung auf und löst Immunsignale aus dem CP aus, die den altersbedingten kognitiven Verfall beeinflussen können14,15,21,25,29 . Die Beleuchten der Eigenschaften der CP-Immunzellen wäre daher entscheidend, um ihre regulatorische Funktion auf die Physiologie und Sekretion des CP-Epithels besser zu verstehen und dadurch ihren indirekten Einfluss auf die Gehirnfunktion unter gesunden und Krankheitsbedingungen zu entschlüsseln.

CP sind kleine Strukturen, die nur wenige Immunzellen enthalten. Ihre Isolierung erfordert eine Mikrodissektion nach einem vorbereitenden Perfusionsschritt; Immunzellen im Blutkreislauf würden sonst große Verunreinigungen darstellen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die myeloischen und T-Zell-Teilmengen des CP mittels Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese Methode identifiziert etwa 90% der Immunzellpopulationen, die Maus-CP unter nicht-entzündlichen Bedingungen bilden, in Übereinstimmung mit kürzlich veröffentlichten Arbeiten, die andere Methoden zur Sezierung der Immun-CP-Heterogenität verwenden7,10,28. Dieses Protokoll könnte angewendet werden, um Veränderungen im CP-Immunzellkompartiment mit Krankheit und anderen experimentellen Paradigmen in vivo zu charakterisieren.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren, die mit den Leitlinien der Europäischen Kommission für den Umgang mit Versuchstieren, Richtlinie 86/609/EWG, übereinstimmen. Sie wurden von den Ethikkommissionen Nr. 59, von der CETEA/CEEA Nr. 089, unter der Nummer dap210067 und APAFIS #32382-2021070917055505 v1 genehmigt.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Lagern Sie alle Antikörper (Materialtabelle) bei 4 °C, geschützt vor Lichteinwirkung.
  2. DAPI-Stammlösung (1 mg/ml): Resuspendiert das Pulver in PBS-/- (Table of Materials), aliquot und lagern bei -20 °C.
  3. DAPI-Arbeitslösung (0,1 mg/ml): Verdünnung der DAPI-Stammlösung mit PBS-/- im Verhältnis 1:10.
  4. Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) Puffer: Herstellen Sie 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) (Tabelle der Materialien) in PBS-/-.
  5. Kollagenase-IV-Stammlösung (20 HE/μL): Resuspendiert das Pulver in PBS+/+ (Table of Materials), Aliquot und lagern bei -20 °C.
    HINWEIS: Kollagenase IV erfordert, dass MgCl2 voll aktiv ist; Kollagenase-IV-Lösung nicht einfrieren und auftauen.
  6. Anästhesie-analgetische Lösung: Mischen Sie 150 μL Ketamin (150 mg/kg), 25 μl Xylazin (5 mg/kg) und 330 μl Buprecare (0,1 mg/kg) in 1 ml PBS-/-.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Anästhesie-Analgetikum-Lösung spontan vor und bewahren Sie sie nicht länger als einen Tag auf.
  7. Heparinlösung (100 E/ml): Resuspendiert das Pulver in PBS-/-.
  8. Bereiten Sie das Infusionseinsatzsystem vor, das einen Schlauch mit einem mit PBS-/- gefüllten Dekanter Erlenmeyer verbindet. Verbinden Sie eine 23-G-Nadel mit der Extremität des Infusionsschlauchs. Öffnen Sie den Infusionseinschub und lassen Sie das PBS laufen, bis sich keine Blasen mehr im Schlauch befinden.
  9. Bereiten Sie die mit einem Licht ausgestattete binokulare Lupe vor.

2. Gehäuse von C57BL/6 Mäusen

  1. Für die Analyse der myeloischen oder T-Zellen von CP verwenden Sie jeweils vier Mäuse und poolen die vier CP (zwei von jedem lateralen Ventrikel, den dritten Ventrikel und den vierten Ventrikel CP; für insgesamt acht Mäuse). Das Nicht-Pooling von CP birgt das Risiko, die seltenen Immunpopulationen in CP aufgrund ihrer geringen Häufigkeit nicht zu erkennen.
  2. Lassen Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor dem Experimentieren akklimatisieren. Halten Sie die Mäuse unter pathogenfreien Bedingungen bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit, in einem 12/12 h oder 14/10 h Hell/Dunkel-Zyklus, mit Wasser und Standard-Pelletfutter ad libitum.

3. PBS-Perfusion und Hirndissektion

  1. Jede Maus wird gewichtet und 10 μL/g der Anästhesie-Analgetika-Mischlösung (Schritt 1.6) intraperitoneal injiziert.
  2. Warten Sie etwa 30 Minuten auf eine effiziente Analgesie (überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Ziffern der Maus kneifen).
  3. Positionieren Sie die betäubte Maus flach auf dem Rücken, auf der Dissektionsstütze, und kleben Sie ihre Handflächen an die Dissektionsstütze.
  4. Kneifen Sie die Haut des Tieres mit einer Pinzette und mit einer Schere, öffnen Sie den Bauch, das Zwerchfell und den Thorax, um das Herz freizulegen.
    HINWEIS: Wenn der Thorax geöffnet wird, wird das Gehirn anoxisch. Man muss präzise und schnell durch die nächsten Schritte der Perfusion gehen.
  5. Injizieren Sie 20 μL 100 HE/ml Heparinlösung direkt in den linken Ventrikel.
  6. Machen Sie mit einer feinen Schere einen Schnitt von mindestens 3 mm im rechten Vorhof, damit das Blut aus dem Körper fließen kann.
  7. Unmittelbar danach führen Sie die 23-G-Nadel ein, die am Ende des Infusionsschlauchs durch die Spitze des linken Ventrikels platziert ist.
  8. Öffnen Sie das Infusionssystem maximal und warten Sie auf die vollständige Perfusion: Mit einer 23 G Nadel bei einer Durchflussrate von ca. 6 ml/min ist die Perfusion in 3 min abgeschlossen.
    HINWEIS: Die gleichmäßige Verfärbung von Organen wie der Leber bescheinigt die Wirksamkeit der Perfusion.
  9. Schließen Sie das Infusionssystem und entfernen Sie die Nadel aus dem Herzventrikel.
  10. Entfernen Sie das Klebeband von den Handflächen der Maus. Stellen Sie die Maus in eine ventrale Position.
  11. Kneifen Sie die Haut des Tieres mit einer Pinzette und mit einer Schere, entfernen Sie die Haut der Oberseite des Kopfes von den Augen zu den Ohren.
  12. Schneiden Sie mit Hilfe einer Schere zuerst den Schädel zwischen den Augen und dann seitlich von jedem Auge zum Rückenmark direkt über den Massetermuskeln. Verwenden Sie dazu die Extremität der Schere und gehen Sie vorsichtig vor, um zu vermeiden, dass das Gehirn mit der Schere beschädigt wird.
  13. Öffnen Sie den Schädel mit einer Pinzette, indem Sie ihn aus der Extremität zwischen den Augen kneifen.
  14. Verwenden Sie eine Schere, um das Rückenmark zu durchschneiden und das Gehirn mit einer Pinzette zu extrahieren, indem Sie ihre beiden Punkte auf der seitlichen Seite des Gehirns platzieren, um es zu kippen und in eine Petrischale zu legen, die mit eiskaltem PBS + / + gefüllt ist. Die CP werden dann sofort gesammelt.
    HINWEIS: Überprüfen Sie auf Verfärbungen des Gehirns, um die Wirksamkeit der Perfusion zu überprüfen.

4. Dissektion des Plexus choroidus aus dem Gehirn

  1. Positionieren Sie die dorsale Gehirnseite nach oben in der Petrischale und unterhalb der Ziele der binokularen Lupen.
  2. Setzen Sie mit Hilfe einer Pinzette die beiden Enden einer anderen Pinzette durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären ein, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten.
  3. Verwenden Sie die Pinzette, um den Kortex mit dem Callosum und dem Hippocampus vom Septum wegzuziehen und den lateralen Ventrikel und einen Teil des dritten Ventrikels freizulegen.
  4. Identifizieren Sie den lateralen CP als einen langen Schleier, der den seitlichen Ventrikel auskleidet, der an beiden Enden aufflammt. Verwenden Sie die beiden Enden einer dünnen Pinzette, um die laterale CP zu fangen. Achten Sie darauf, den dreieckigen hinteren Teil zu sammeln, der von der hinteren Falte des Hippocampus verdeckt sein kann.
  5. Ziehen Sie den Kortex mit dem Corpus callosum und dem Hippocampus der kontralateralen Hemisphäre vom Septum weg, um den gesamten dritten Ventrikel und den gegenüberliegenden lateralen Ventrikel freizulegen.
  6. Sammeln Sie mit einer feinen Pinzette den dritten CP, der als kurze Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt identifiziert werden kann.
  7. Sammeln Sie die anderen lateralen CP.
  8. Setzen Sie die beiden Enden einer Pinzette zwischen Kleinhirn und Mittelhirn ein. Lösen Sie das Kleinhirn von den Pons und Medulla, um den vierten Ventrikel freizulegen.
  9. Identifizieren Sie den vierten CP als eine lange kugelförmige Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt, der den vierten Ventrikel vom lateralen rechten Ende zum linken Ende zwischen dem Kleinhirn und der Medulla auskleidet. Sammeln Sie den vierten CP mit einer feinen Pinzette.
    HINWEIS: Die Silan-Basisbeschichtung der Pinzette kann die Klebrigkeit von CP auf der Pinzette verhindern.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-4.9 für jedes der anderen sieben Mäuse. In der Zwischenzeit kann der gesammelte CP zeitlich in einer auf Eis gelegten Röhre aufbewahrt werden.

5. Vorbereitung der Proben für die Durchflusszytometrie-Analyse

  1. Füllen Sie das Röhrchen mit allen sezierten CP auf 750 μL PBS+/+.
    HINWEIS: Die Abscheidung von seziertem CP mit dünner Pinzette in der Röhre bringt ein kleines Volumen von PBS+/+. Vervollständigen Sie lieber das vorhandene Volumen auf 750 μL, als es zu entfernen und durch frische 750 μL PBS+/+ zu ersetzen, um einen möglichen Verlust des CP-Gewebes zu vermeiden.
  2. 15 μL 20 E/μL Collagenase IV-Stammlösung (siehe Schritt 1.5) für eine Endkonzentration von 400 E/ml zugeben.
    HINWEIS: DNAse I (150 μg/ml) kann eine übermäßige Zellverklumpung verhindern.
  3. CP mit Kollagenase IV bei 37 °C unter leichter Bewegung (300 U/min) 45 min inkubieren.
  4. Pipettieren Sie vorsichtig etwa 10 Mal auf und ab, um die CP-Dissoziation abzuschließen.
  5. Füllen Sie das CP-Röhrchen auf 1,5 ml mit MACS-Puffer (siehe Rezeptschritt 1.4), um die Kollagenase-IV-Aktivität zu stoppen.
    HINWEIS: Die Aktivität von Kollagenase IV wird bei niedriger Temperatur gestoppt und durch Serumalbumin gehemmt.
  6. Die Zellen werden bei 500 x g, 5 min, bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 1,5 ml MACS-Puffer.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min, bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 220 μL MACS-Puffer.
  8. Trennen Sie ein Aliquot von 10 μL von der Zellsuspension, die als unbefleckte Kontrolle verwendet werden soll (nächster Schritt 5.18).
  9. Trennen Sie ein Aliquot von 10 μL von der Zellsuspension, die als DAPI-Mono-gefärbte Kontrolle verwendet werden soll (nächster Schritt 5.12).
  10. Die verbleibenden 200 μL mit einem Anti-Maus-CD16/CD32-blockierenden Antikörper (1:100) für 20 min bei 4 °C vorbrüten, um unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen zu blockieren.
  11. Teilen Sie die Zellen in zwei 100-μL-Röhrchen auf (eine für die Analyse myeloischer Zellen, die andere für die T-Zell-Analyse) (nächster Schritt 5.14).
  12. Entnehmen Sie die Probe mit 10 μL Zellen für die DAPI-Mono-Färbungskontrolle (Schritt 5.9) und füllen Sie sie bis zu 100 μL mit MACS-Puffer (nächster Schritt 5.14).
  13. Es werden elf neue Röhrchen mit 100 μL MACS für den Antikörper mono-gefärbte (Schritt 5.14.4) und alle gefärbten Kontrollen (Schritt 5.14.5) vorbereitet und jeweils ein Tropfen Kompensationsperlen hinzugefügt.
    HINWEIS: Die Kompensationskontrollen ermöglichen es, die Spannung des Fluoreszenz-Detektionslasers einzustellen und die potenzielle unspezifische Signaldetektion von Fluoreszenzfarbstoff in den anderen Kanälen zu bewerten, die weiter kompensiert werden.
  14. Antikörper-Inkubation von Proben:
    1. Myeloische Probe: Zugabe von 0,1 mg/ml DAPI (1:100) (siehe Schritt 1.3), FITC Anti-Maus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 Anti-Maus CD11b (1:100), APC Anti-Maus CX3CR1 (1:100), BV711 Anti-Maus Ly6C (1:100), PE Anti-Maus F4/80 (1:100) und APC-Cy7 Anti-Maus IA-IE (1:100).
    2. T-Zellprobe: Zugabe von 0,1 mg/ml DAPI (1:100), FITC Anti-Maus CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 Anti-Maus CD11b (1:100), APC Anti-Maus TCRβ (1:100), PE Anti-Maus CD8a (1:100) und APC-Cy7 Anti-Maus CD4 (1:50).
    3. DAPI-Monofärbung (ab Schritt 5.12): Fügen Sie 0,1 mg/ml DAPI (1:100) hinzu.
    4. Antikörper-Mono-gefärbte Kompensationskügelchen: Fügen Sie jeden der neun zuvor verwendeten Antikörper für myeloische und T-Zellproben (gleiche Verdünnung) separat (einen für jedes Röhrchen) zu den neun Röhrchen hinzu, die die Kügelchen enthalten.
      HINWEIS: Die einfach gefärbten Kompensationskontrollen ermöglichen die Bestimmung positiver Fluoreszenzspitzen für jeden der verwendeten fluoreszierenden Marker während des Kompensationsschritts. Der Analysator vergleicht sie mit dem negativen Signal, das in den unbefleckten Kontroll-CP-Zellen beobachtet wurde.
    5. Antikörper-All-Stained Compensation Beads: Fügen Sie alle Antikörper, die für die myeloische Färbung verwendet werden, zu einem Röhrchen und diejenigen, die für die Färbung von T-Zellen verwendet werden, zu einem anderen hinzu.
      HINWEIS: Die vollständig gebeizten Kompensationssteuerungen ermöglichen die Einstellung der Spannung jeder fluoreszierenden Laserdetektion und die Bewertung der potenziellen unspezifischen Signaldetektion von Fluoreszenzfarbstoffen in den anderen Kanälen.
    6. Inkubieren Sie für 30-45 min auf Eis, geschützt vor Lichteinwirkung.
  15. Füllen Sie alle Röhrchen bis zu 1,5 ml mit MACS-Puffer. Zellen zentrifugieren und Kompensationskügelchen bei 500 x g, 5 min, bei 4 °C.
  16. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen und Kompensationsperlen in 1,5 ml MACS-Puffer.
  17. Zellen zentrifugieren und Kompensationskügelchen bei 500 x g, 5 min, bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
  18. Resuspendieren Sie die Zellen und Kompensationsperlen in 500 μL MACS-Puffer. Bedruckungsfreie Steuerung (Schritt 5.8) bis 500 μL mit MACS-Puffer füllen.
  19. Filtern Sie jedes Röhrchen mit CP-Zellen durch ein 70-μm-Sieb (unbefleckte CP-, DAPI-Mono-Färbe-Kontroll- und myeloische und T-Zellproben).

6. Durchflusszytometrie

HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete Durchflusszytometer ist mit den folgenden 5 Lasern ausgestattet: einem 355-nm-UV-Laser, einem 405-nm-Violettlaser, einem 488-nm-Blaulaser, einem 561-nm-Gelb-Grün-Laser und einem 637-nm-Rotlaser.

  1. Führen Sie die täglichen Qualitätskontrollprüfungen am Zytometer mithilfe der CST-Schnittstelle (Cytometer Setup, Tracking) und der CST-Kontrollperlen durch, um die Konsistenz zwischen den Analysen, die Gerätequalität und die konsistenten Zielfluoreszenzintensitäten sicherzustellen.
  2. Um das Durchflusszytometrie-Experiment einzurichten, erstellen Sie ein neues Experiment mit bivariaten Diagrammen und Histogrammen. Stellen Sie sicher, dass ein Vorwärtsstreubereich (FSC-A) und ein Seitenstreubereich (SSC-A) sowie Histogrammdiagramme für jede Farbe einbezogen werden, um die Erfassung zu überwachen.
  3. Definieren Sie die Zellmorphologie, indem Sie die PMT-Spannung für FSC-A- und SSC-A-Parameter auf unbefleckten Kontroll-CP-Zellen einrichten.
  4. Definieren Sie die Spannungen jedes fluoreszierenden Markers, indem Sie die negativen Peaks der Fluorochrome auf unbefleckten Kontroll-CP-Zellen und die positiven Peaks der Fluorochrome unter Verwendung von Kompensationsperlen, die mit allen Antikörpern angefärbt sind, einrichten und sicherstellen, dass die Detektorsignale nicht außerhalb der Skala liegen und in anderen Kanälen nicht zu stark kreuzdetektiert werden.
  5. Erstellen Sie eine Kompensationsmatrix, um jedes der einfarbigen Kompensationssteuerelemente zu analysieren. Nachdem Sie die entsprechenden FSC-A/SSC-A-Populationen aktiviert haben, überprüfen Sie einfach gefärbte Kontrollen auf Histogrammdiagrammen und Datensatzkompensationskontrollen. Nachdem Sie alle einfach gefärbten Proben aufgezeichnet haben, berechnen Sie die Kompensationsmatrix.
  6. Zeichnen Sie alle Ereignisse auf, die sowohl für myeloische als auch für T-Zell-Populationen erkannt wurden.

7. CP myeloische Zellen Gating

  1. Wählen Sie FSC-A vs. SSC-A und Gate für Zellen (basierend auf der Größe).
  2. Erstellen Sie ein Tochtergatter für einzelne Zellen mit FSC-A vs. Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H).
  3. Erstellen Sie ein Tochtertor für lebende Zellen mit DAPI vs. FSC-A, um DAPI+- Zellen auszuschließen.
  4. Erstellen Sie ein Tochtertor für CD45+ Immunzellen mit CD45 vs. FSC-A.
  5. Erstellen Sie ein Tochtertor aus den CD45+-Zellen und wählen Sie CD11b vs. F4/80, identifizieren Sie die folgenden zwei Gruppen: die CD11b+ F4/80+ und die CD11b+ F4/80- Populationen (nächster Schritt 7.8).
  6. Erstellen Sie ein Tochtertor für CD11b+ F4/80+-Zellen und wählen Sie CX3CR1 im Vergleich zu IA-IE aus. Identifizieren Sie sowohl CX3CR1+ IA-IE+ BAM, die weiter als CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM bezeichnet werden, als auch CX3CR1+ IA-IE- Makrophagen.
  7. Erstellen Sie ein Tochtertor für CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- Makrophagen und wählen Sie F4/80 vs. CD11b. Identifizieren Sie sowohl die CD11bhigh F4/80intermediate als auch die CD11b+ F4/80high Populationen, die weiter als CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer's epiplexus macrophages und CD11b+ F4/80high CX3 bezeichnet werden. CR1+ IA-IE- BAM, beziehungsweise.
    HINWEIS: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- und CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- Zellen schienen etwas gemischt zwischen F4/80intermediate-F4/80high und CD11bhigh-CD11b+ Pegeln zu sein.
  8. Ab der CD11b+ F4/80- Population (Schritt 7.5), Gate für Ly6C vs. IA-IE. Wählen Sie sowohl IA-IE+ Ly6C- Population als auch IA-IE- Ly6C+ Zellen aus, die hauptsächlich Monozyten/Neutrophilen entsprechen.
    HINWEIS: Eine hohe Präsenz von IA-IE- Ly6C + - Zellen spiegelt wahrscheinlich Probleme in der Perfusionswirksamkeit von Tieren ohne entzündliche Erkrankung wider; ihre Häufigkeit sollte gering sein.
  9. Erstellen Sie ein Tochtertor für CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- Population und wählen Sie CD11b vs. CX3CR1, identifizieren Sie sowohl CD11bhigh CX3CR1low als auch CD11b+ CX3CR1- Populationen.

8. CP T Zellen Gating

  1. Wählen Sie FSC-A vs. SSC-A und Gate für Zellen (basierend auf der Größe).
  2. Erstellen Sie ein Tochtergatter für einzelne Zellen mit FSC-A vs. Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H).
  3. Erstellen Sie ein Tochtertor für lebende Zellen mit DAPI vs. FSC-A, um DAPI+- Zellen auszuschließen.
  4. Erstellen Sie ein Tochtertor für CD45+ Immunzellen mit CD45 vs. FSC-A.
  5. Erstellen Sie ein Tochtergatter aus den CD45+-Zellen und wählen Sie TCRβ vs. CD11b. Schließen Sie CD11b+ myeloische Zellen aus und wählen Sie TCRβ+ CD11b- T-Zellpopulation.
  6. Erstellen Sie ein Tochtertor für TCRβ+ CD11b- Population und wählen Sie CD4 vs. CD8a. Identifizieren Sie sowohl CD8- CD4+ T-Zellen als auch CD8+ CD4-T-Zellen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier vorgestellten Durchflusszytometrie-Analysen zeigten erfolgreich die wichtigsten Teilmengen der myeloischen und T-Zellen (Abbildung 1 bzw. Abbildung 2) und ihre relative Gesamtzahl pro Maus in einer hochgradig reproduzierbaren Weise (Abbildung 3).

Die Durchflusszytometrie-Analyse myeloischer Zellen zeigte, dass CP mit CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM bestückt sind, was...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studien, die darauf abzielen, die immunologischen Beiträge zur Homöostase und Erkrankung des Gehirns zu verstehen, konzentrierten sich hauptsächlich auf Zellen, die sich im Gehirnparenchym befinden, und vernachlässigten Gehirngrenzen wie CP, die dennoch entscheidend zur Gehirnfunktion beitragen2,3. Die Analyse von Immunzellpopulationen bei CP ist aufgrund der geringen Größe von CP, der geringen Anzahl residenter Immunzellen und des komplizierten Zugangs zu diesem...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Institut Pasteur Animalerie Centrale und den Mitgliedern der CB-UTechS-Einrichtung für ihre Hilfe. Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur finanziell unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Maus CD16/CD32BD Biosciences553142Durchflusszytometrie Antikörper
Albumin, RinderMP Biomedicals160069Blockierungsreagenz
APC Anti-Maus CX3CR1BioLegend149008Durchflusszytometrie Antikörper
APC Anti-Maus TCRbBioLegend109212Durchflusszytometrie Antikörper
APC-Cy7 Anti-Maus CD4BioLegend100414Durchflusszytometrie Antikörper
APC-Cy7 Anti-Maus IA-IEBioLegend107628Durchflusszytometrie Antikörper
BD FACSymphony A5 Cell AnalyzerBD BiosciencesDurchflusszytometrie Analysator
BV711 Anti-Maus Ly6CBioLegend128037Durchflusszytometrie Antikörper
Kollagenase IVGibco17104-019Enzym zu Dissoziation von CP-Gewebe
DAPIThermo Scientific62248Lebend-/Totmarkierung
EDTAIonenchelator
FeinschereFST14058-11Sezierwerkzeug
FITC Anti-Maus CD45BioLegend103108Durchflusszytometrie Antikörper
Durchflussregler InfusionseinschubCareFusionRG-3-CBlutperfusion Einsatz
FlowJo SoftwareBD BiosciencesAnalysesoftware
PinzetteFST11018-12Präparierwerkzeug
HeparinSigma-AldrichH3149-10KUAntikoagulans
ImalgeneBoehringer IngelheimKetamin, Anästhesie
OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-42Kontrollkügelchen zu realisieren Kompensation
PBS-/-Gibco14190-094Puffer
PBS+/+Gibco14040-091Puffer
PE Anti-Maus CD8aBioLegend100708Durchflusszytometrie Antikörper
PE Anti-Maus F4/80BioLegend123110Durchflusszytometrie Antikörper
PE-Dazzle 594 Anti-Maus CD11bBioLegend101256Durchflusszytometrie Antikörper
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  2. Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
  3. Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
  4. Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
  5. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  6. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  7. van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  8. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
  9. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
  10. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  11. Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
  12. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  13. Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
  14. Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
  15. Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  16. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  17. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  18. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
  19. da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  20. Schwarze, E. -W. The origin of (Kolmer's) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
  21. Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
  22. Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
  23. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
  24. Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
  25. Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
  26. Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111(2019).
  27. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  28. Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
  29. Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
  30. Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967(2015).
  31. Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
  32. Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
  33. Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
  34. Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
  35. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  36. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).

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