Methodenartikel

Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform

DOI:

10.3791/63493

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17. August 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll stellt die gesamten Laborverfahren dar, die für Präimplantations-Gentests auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Hier präsentieren wir die detaillierten Schritte der Amplifikation des gesamten Genoms, der DNA-Fragmentauswahl, des Bibliotheksaufbaus, der Template-Vorbereitung und des Sequenzierungs-Arbeitsablaufs mit repräsentativen Ergebnissen.

Zusammenfassung

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Die Next-Generation-Sequenzierung hat in der klinischen Anwendung bei der Bestimmung genetischer Varianten zunehmend an Bedeutung gewonnen. Im Präimplantations-Gentest hat diese Technik ihre einzigartigen Vorteile in Bezug auf Skalierbarkeit, Durchsatz und Kosten. Für den Präimplantations-Gentest für die Aneuploidie-Analyse bietet das hier vorgestellte halbleiterbasierte Next-Generation-Sequencing-System (NGS) einen umfassenden Ansatz zur Bestimmung struktureller genetischer Varianten mit einer Mindestauflösung von 8 Mb. Von der Probenaufnahme bis zum Abschlussbericht erfordert der Arbeitsprozess mehrere Schritte unter strikter Einhaltung der Protokolle. Da verschiedene kritische Schritte das Ergebnis der Verstärkung, die Qualität der Bibliothek, die Abdeckung der Lesevorgänge und die Ausgabe von Daten bestimmen könnten, könnten beschreibende Informationen mit visueller Demonstration außer Wörtern mehr Details zur Bedienung und Manipulation bieten, was einen großen Einfluss auf die Ergebnisse aller kritischen Schritte haben kann. Die hier vorgestellten Methoden zeigen die Verfahren, die an der gesamten Genomamplifikation (WGA) von biopsierten Trophektodermzellen (TE), der genomischen Bibliothekskonstruktion, dem Sequenzermanagement und schließlich der Erstellung von Berichten über Kopienzahlvarianten beteiligt sind.

Einleitung

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Aneuploidie ist die Anomalie in der Anzahl der Chromosomen durch das Vorhandensein eines oder mehrerer zusätzlicher Chromosomen oder das Fehlen eines oder mehrerer Chromosomen. Embryonen, die eine Art von Aneuploidie tragen, wie den Verlust eines X-Chromosoms (Turner-Syndrom), zusätzliche Kopien von Autosomen, wie Trisomien von Autosom 21 (Down-Syndrom), 13 (Patau-Syndrom) und 18 (Edwards-Syndrom), oder zusätzliche Geschlechtschromosomen wie 47, XXY (Klinefelter-Syndrom) und 47, XXX (Triple-X-Syndrom), können mit Geburtsfehlern1 überleben. Aneuploidie ist die Hauptursache für Fehlgeburten im ersten Trimester und Versagen der In-vitro-Fertilisation (IVF)2. Es wird berichtet, dass die Aneuploidierate zwischen 25,4% und 84,5% durch die verschiedenen Altersschichten des natürlichen Zyklus und der medizinischen Kontrollgruppe in IVF-Praxis3 liegen könnte.

Die Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation wird bei der klinischen Bestimmung genetischer Informationen immer häufiger eingesetzt. Es bietet einen praktischen Zugang zur Genomsequenz mit Effizienz und hohem Durchsatz. Insbesondere revolutionierte die Next-Generation-Sequenzierung auch die Diagnose von Störungen mit genetischen Faktoren und Tests auf Anomalien im Genom4. Unter Verwendung der Halbleitersequenzierungstechnologie zur direkten Übertragung chemischer Signale bei der Sequenzierung von Bioreaktionen in digitale Daten bietet das halbleiterbasierte Sequenzsystem eine direkte Echtzeit-Detektion von Sequenzdaten in 3-7 h 5,6.

In einem IVF-Verfahren untersucht die Präimplantationsdiagnostik (PGT) das genetische Profil des Embryos, bevor er in die Gebärmutter übertragen wird, um das IVF-Ergebnis zu verbessern und das Risiko genetischer Störungen bei Neugeborenen zu verringern 1,7. Bei der PGT in Kombination mit NGS-Techniken wird genetisches Material, das aus weniger als 10 Zellen extrahiert wurde, mit ganzen Genomamplifikationskits oder einem unabhängig entwickelten gesamten Genomamplifikationsreagenz amplifiziert. Dies erfordert nur einen Schritt in der Amplifikationsphase und erfordert keine Voramplifikation, um Amplifikationsprodukte für das gesamte Genom zu erhalten. Primer oder Panels für Kopienzahlvarianten und spezielle Genloci Sequenzierung werden entworfen und in der konstruierten Bibliothek angewendet.

Ein typischer Arbeitsablauf der Präimplantations-Gentest-Aneuploidie (PGT-A) bei NGS umfasst serielle Eingriffe und erfordert eine intensive Arbeitsbelastung des Laborpersonals8. Einige Fehlbedienungen, die zu einem Rollback des Verfahrens führen, können zu einem unerwünschten Verlust von Zeit und Ressourcen des Labors führen. Eine prägnante und klare Standardarbeitsanweisung (SOP) für den PGS-NGS-Workflow ist hilfreich. Protokolle im Word-Format können jedoch keine detaillierteren Informationen zur Probenverarbeitung, Gerätemanipulation und Geräteeinstellungen enthalten, die in einem Videoprotokoll visualisiert werden können. In diesem Artikel könnte ein validierter Workflow in Kombination mit einer visualisierten Demonstration von Betriebsdetails direktere und intuitivere Referenzprotokolle in der PGT-Praxis auf einer Halbleitersequenzierungsplattform bieten.

Das Protokoll beschreibt hier eine Methode, die die parallele Batches von bis zu 16 Embryobiopsien unterstützt. Für größere Chargen wird empfohlen, ein kommerzielles Kit-basiertes Protokoll für die Halbleitersequenzierung wie Reproes-PGS zu verwenden.

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Protokoll

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Alle Protokolle und die Trophektoderm (TE) Biopsie (Abschnitt 1.1.1.1), die in dieser Studie angewendet wurden, wurden am 18. September 2017 von der Ethikkommission für Humanforschung des Krankenhauses Nr. 924 überprüft und genehmigt (NO: PLA924-2017-59). Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie.

1. DNA-Isolierung aus menschlicher Embryobiopsie und ganzgenomischer Amplifikation

  1. Protokoll für die Amplifikation des gesamten Genoms 9,10
    HINWEIS: Das Pico PLEX WGA Kit wird verwendet, um die Amplifikation des gesamten Genoms durchzuführen.
    1. Probenentnahme und -lagerung
      1. Trophektodermbiopsie: Ziehen Sie durchschnittlich sechs bis neun Zellen aus herniiertem TE von D5/6-Embryonen nach assistiertem Schlüpfen, um eine qualifizierte Menge an DNA für die folgende Amplifikation zu erhalten.
      2. Die Probenzellen werden in ein PCR-Röhrchen in 5 μL PBS überführt.
      3. Die Proben werden sofort bei -80 °C eingefroren, wenn das Protokoll nicht direkt zur DNA-Extraktion übergeht.
    2. Zelllyse
      HINWEIS: Die ergänzende Datei 1 listet die empfohlenen Volumina jeder Komponente auf und dient als Referenz für diese bei der Vorbereitung der Mastermischung während der Zelllyse und der Amplifikation des gesamten Genoms von Chargen von 1, 8, 16 und 32 Proben (mit Überschuss zur Berücksichtigung von Pipettierfehlern). Bei der Formulierung anderer Mastermischungen dieses Protokolls wird das Volumen jeder Komponente zusätzlich erhöht, um dem durch wiederholtes Pipettieren verursachten Komponentenverbrauch Rechnung zu tragen. Alle kurzen Zentrifugen werden auf einer Tisch-Minizentrifuge für 2-10 s bei Raumtemperatur (RT) mit einer festen Drehzahl von 10.000 bei einer Zentrifugalkraft von 5.300 x g durchgeführt. Die Zentrifugalkraft muss zwischen 2.000 x g und 12.000 x g liegen.
      1. Die Zelllysemischung wird mit 4,8 μL des Extraktionsenzym-Verdünnungspuffers und 0,2 μL des Zellextraktionsenzyms pro Probe hergestellt.
      2. 5 μL der frisch zubereiteten Zelllysemischung in jede 5 μL Zellprobe in PCR-Röhrchen pipettieren und das Röhrchen bei RT für 5 s kurz zentrifugieren. Wirbeln Sie den Schlauch nicht durch.
      3. Die Probe wird wie folgt in einem Thermocycler inkubiert: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 Min. Zentrifugieren Sie das Röhrchen nach der Inkubation kurz (5 s).
    3. Voramplifikation der gesamten Genom-DNA
      1. Die Voramplifikationsmischung wird mit 4,8 μL des Vorverstärkerpuffers und 0,2 μL des Vorverstärkerenzyms pro Probe hergestellt.
      2. 5 μL der Voramplifikationsmischung durch die Wände des Röhrchens in die Probenröhrchen pipettieren und 3 s kurz zentrifugieren. Vermeiden Sie, dass die Spitze den Boden des Röhrchens erreicht, und wirbeln Sie das Rohr nicht durch.
      3. Inkubieren Sie die Probe gemäß dem in Tabelle 1 genannten Thermocycler-Programm.
    4. DNA-Amplifikation des gesamten Genoms
      1. Zentrifugieren Sie die Probe kurz für 5 s und legen Sie das Vorverstärker-Inkubationsprodukt auf Eis.
      2. Bereiten Sie die gesamte Genomamplifikationsmischung mit 25 μL des Amplifikationspuffers, 0,8 μL des Amplifikationsenzyms und 34,2 μL nukleasefreiem Wasser pro Probe vor.
      3. Mischen Sie 60 μL der frisch zubereiteten gesamten Genomamplifikationsmischung mit dem 15 μL Pre-Ampere-Inkubationsprodukt; Das Gesamtvolumen muss 75 μL betragen. Kurz 5 s zentrifugieren. Vermeiden Sie, dass die Spitze den Boden des Röhrchens erreicht, und wirbeln Sie das Rohr nicht durch.
      4. Setzen Sie das PCR-Röhrchen auf den Thermocycler und führen Sie das in Tabelle 2 beschriebene Thermocycler-Programm aus.
      5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz für 5 s und geben Sie die Produkte in ein neues 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
      6. Quantifizieren Sie die WGA-Produktkonzentration mit einem Fluorometer11. Die Proben können bei -20 °C für weniger als 2 Monate zwischengelagert werden, wenn nicht mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
  2. Protokoll der unabhängig entwickelten WGA-Reagenzien.
    1. Probenentnahme und -lagerung
      1. Entnehmen Sie die Zellen aus dem D5/6-Embryo nach dem assistierten Schlüpfen für die folgende Amplifikation.
      2. Die Probenzellen mit 1,5 μL PBS werden in ein PCR-Röhrchen mit 2 μL PBS überführt.
        HINWEIS: PBS ist frei von Mg 2+ und Ca2+.
      3. Die Proben werden sofort bei -80 °C eingefroren, wenn nicht direkt mit dem DNA-Extraktionsprotokoll fortgefahren wird.
    2. Zelllyse
      1. Den Zelllysepuffer (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM Natriumpyrophosphat, 2 mM β-Glycerophosphat, 0,1% SDS) bei RT schmelzen und auf das Eis legen. Zu jeder Probe 2 μL Zelllysepuffer geben und kurz zentrifugieren (5 s).
        HINWEIS: Wirbeln Sie das Röhrchen nicht und vermeiden Sie, dass die Pipettenspitze die Flüssigkeitsoberfläche im Röhrchen berührt, um zu vermeiden, dass Zellen oder DNA aus dem Reaktionssystem gelangen.
      2. Die Probe wird wie folgt in einem Thermocycler inkubiert: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, halten. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz bei RT für 10 s nach der Inkubation.
    3. DNA-Amplifikation des gesamten Genoms
      1. Zentrifugieren Sie das Zelllyseprodukt kurz für 5 s und legen Sie es auf Eis.
      2. Bereiten Sie die gesamte Genomamplifikationsmischung für jede Probe vor, indem Sie sie mit 16 μL vorgemischter Amplifikationslösung, 1 μL Amplifikationsenzym und 28 μL nukleasefreiem Wasser mischen. Vorsichtig mischen, kurz zentrifugieren (5 s) und die Mischung auf Eis legen. Wirbeln Sie den Schlauch nicht durch.
      3. 45 μl der frisch hergestellten gesamten Genomamplifikationsmischung werden in das in Schritt 1.2.2.2 hergestellte Zelllyseprodukt pipettiert; Vorsichtig mischen und 5 s kurz zentrifugieren.
        HINWEIS: Wirbeln Sie das Rohr nicht und vermeiden Sie, dass die Pipettenspitze die Flüssigkeit im Röhrchen berührt.
      4. Setzen Sie das PCR-Röhrchen auf den Thermocycler und führen Sie das Programm wie in Tabelle 3 beschrieben aus.
      5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz für 5 s und geben Sie die Produkte in ein neues 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
      6. Quantifizieren Sie die WGA-Produktkonzentration mit einem Fluorometer11 und notieren Sie die Ergebnisse auf dem QS-Blatt (Qualitätsanalyse). Produkte mit qualifizierten Konzentrationen können bei -20 °C für weniger als 2 Monate zwischengelagert werden, wenn nicht mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.

2. Auswahl der Verstärkungsfragmente

HINWEIS: Die in diesem Abschnitt verwendeten Materialien sind im Library Preparation Kit (Materialverzeichnis) verfügbar.

  1. Vorbereitung vor dem Start
    1. Die magnetischen Kügelchen (n x 100 μL) für die Reinigung bei RT für 30 min ausgleichen.
    2. Stellen Sie das vorherige WGA-Produkt auf RT wieder her. Wirbeln Sie das Produkt 30 s lang bei RT ab, bevor Sie es kurz zentrifugieren.
    3. Bereiten Sie frisches 70% Ethanol zu.
  2. Verfahren zur Fragmentauswahl
    1. 25 μL der WGA-Produkte pipettieren und in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen mit 25 μL nukleasefreiem Wasser vorgeladen geben.
    2. Vortex und mischen Sie die DNA-Reinigungsperlen gut. Aliquot 50 μL davon in jedes Probenröhrchen (Originalprobe: Perlen (Volumen) = 1:1), Wirbel und Zentrifuge kurz (5 s). Stellen Sie das Röhrchen für 5 min bei RT für den DNA-Bindungsprozess ein.
    3. Führen Sie das 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen in ein Magnetgestell ein und warten Sie, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand des Röhrchens angezogen werden. Geben Sie den Überstand vorsichtig in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
    4. Entsprechend dem ursprünglichen Probenvolumen 30 μL (Originalprobe: Perlen (Volumen) = 1:0,6) magnetische Kügelchen, Wirbel und Zentrifuge kurz pipetten (5 s). Stellen Sie das Röhrchen für 5 min bei RT für den DNA-Bindungsprozess ein.
    5. Führen Sie die 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen in das Magnetgestell ein und warten Sie 5 Minuten, bis alle Magnetperlen von der Seitenwand des Röhrchens angezogen werden. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
    6. Pipettieren Sie 300 μL 70% Ethanol in das 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, drehen Sie das Röhrchen vorsichtig zweimal mit einem Winkel von 180 ° und bewegen Sie die Perlen entlang der Röhrchenwand für eine gründliche Wäsche. Pipettieren und entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
    7. Wiederholen Sie den Waschvorgang einmal.
    8. Nehmen Sie das 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie es kurz (5 s). Führen Sie die Röhren wieder in das Magnetgestell ein und warten Sie, bis alle Magnetperlen von der Seitenwand des Rohrs angezogen werden.
    9. Pipetten Sie vorsichtig die restliche Flüssigkeit am Boden heraus. Halten Sie das Röhrchen offen, um die Perlen bei RT für 3-5 min zu trocknen. Halten Sie Feuchtigkeit von den Perlen fern.
      HINWEIS: Schließen Sie den Deckel sofort, wenn Risse auf dem Perlenpellet auftreten.
    10. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetgestell, pipettieren Sie 25-30 μL des DNA-Elutionspuffers in ein Röhrchen und schließen Sie die Kappe und den Wirbel. Zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die trübe Flüssigkeit auf den Boden des Röhrchens zu bekommen, und stellen Sie das Röhrchen auf RT für 5 min.
    11. Führen Sie die Röhren wieder in die Magnetgestelle ein und warten Sie, bis alle Perlen von der Röhrenseitenwand angezogen werden und der Überstand transparent wird. Übertragen Sie die DNA-Lösung vorsichtig in neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
    12. Quantifizieren Sie die Konzentration der DNA nach der Fragmentauswahl mit einem Fluorometer11, lagern Sie sie bei -20°C. Typischerweise liegt die Konzentration des ausgewählten DNA-Fragments zwischen 1,5 und 2,4 ng/μL.

3. Vorbereitung der DNA-Bibliothek12

HINWEIS: Die in diesem Abschnitt verwendeten Materialien sind im Library Preparation Kit (Materialverzeichnis) verfügbar.

  1. Reparatur beenden
    1. Die magnetischen Kügelchen bei RT für 30 min ausgleichen.
    2. Das DNA-Produkt der Fragmentselektion in Schritt 2.2.12 wird auf RT abgeglichen. Überprüfen und notieren Sie den Tag auf jeder Durchstechflasche, die die DNA enthält.
    3. Bereiten Sie das DNA-Endreparatursystem mit 30 μL DNA-Produkten, 10 μL Endreparaturpuffer, 0,5 μL Endreparaturenzym und 9,5 μL nukleasefreiem Wasser in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor. Wirbeln Sie das Rohr für 30 s und zentrifugieren Sie kurz (5 s) bei RT, um die gesamte Flüssigkeit auf den Röhrchenboden zu bringen.
    4. Bei 25 °C 30 min inkubieren und das Röhrchen nach der Inkubation kurz zentrifugieren (5 s).
    5. Wirbeln oder umgekehrt mischen Sie die magnetischen Kügelchen und überführen 75 μL der magnetischen Beads in ein Röhrchen mit endreparierten DNA-Proben (Originalprobe: Perlen (Volumen) = 1:1,5). Pipetten oder vorsichtig wirbeln, um die Perlen gut zu mischen, und kurz zentrifugieren (5 s), um die gesamte Suspension bis zum Boden des Röhrchens zu drehen. Stellen Sie das Röhrchen für 5 min bei RT für den DNA-Bindungsprozess ein. Drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um, damit die Perlen verteilt bleiben.
    6. Führen Sie die Zentrifugenröhrchen in das Magnetgestell ein und warten Sie 5 Minuten, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand angezogen werden und der Überstand transparent wird. Entfernen Sie den Überstand und vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren, und halten Sie die Röhrchen beim Pipettieren auf dem Rack.
    7. 300 μL des neu aufbereiteten 70% Ethanols in die Röhrchen geben, die Röhrchen zweimal vorsichtig in einem Winkel von 180° drehen und die Perlen entlang der Röhrenwand bewegen, um sie gründlich zu waschen. Pipettieren und entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
    8. Wiederholen Sie den Waschvorgang einmal.
    9. Nehmen Sie die 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie kurz (5 s). Führen Sie die Röhrchen wieder in das Magnetgestell ein und warten Sie 5 Minuten, bis alle Magnetperlen von der Seitenwand des Rohrs angezogen werden.
    10. Pipetten Sie vorsichtig die restliche Flüssigkeit im Boden heraus. Öffnen Sie die Kappe von 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und trocknen Sie die Perlen bei RT für 3-5 min. Halten Sie Feuchtigkeit von den Perlen fern.
      HINWEIS: Schließen Sie den Deckel sofort, wenn Risse auf dem Perlenpellet auftreten.
    11. Pipettieren Sie 33 μL DNA-Elutionspuffer in ein Röhrchen, schließen Sie die Kappe und wirbeln Sie. Zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die trübe Aufhängung auf den Boden des Röhrchens zu bekommen, und stellen Sie das Röhrchen auf RT für 5 min.
    12. Führen Sie die Röhrchen wieder in die Magnetgestelle ein und warten Sie, bis alle Perlen von der Seitenwand angezogen werden und die Lösung transparent wird. Übertragen Sie die DNA-Lösung vorsichtig in neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit dem richtigen Tag, um das Pipettieren der Perlen zu vermeiden.
  2. Barcode-Ligatur
    1. Legen Sie die Barcode-Ligationsreagenzien in Schritt 3.2.2 auf Eis, um alle gefrorenen Reagenzien zu schmelzen.
    2. Bereiten Sie das Ligationssystem mit 32 μL endreparierten DNA-Produkten, 10 μL nukleasefreiem Wasser, 5 μL Ligasepuffer, 1 μL Ligase und 1 μL P1 in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor. Pipettieren Sie 1 μL jedes Barcode-Reagenzes in die Lösungsmischung im Röhrchen für eine Probe, Wirbel für 5 s und zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die gesamte Flüssigkeit in den Röhrchenboden zu bekommen.
      HINWEIS: Vergewissern Sie sich beim Hinzufügen der Barcodes, dass die Anzahl der Barcodes und Proben übereinstimmt. jeweils nur eine Durchstechflasche mit Barcode öffnen, um eine gemischte Verschmutzung der Barcodes zu vermeiden. Wechseln Sie die Handschuhe für jeweils fünf oder sechs hinzugefügte Barcodes.
    3. Die Röhrchen bei 25 °C für 30 min inkubieren.
    4. 75 μL (Originalprobe: Perlen (Volumen) = 1:1,5) der magnetischen Kügelchen in ein Röhrchen pipettieren und pipetten oder vorsichtig wirbeln, um die Perlen gut zu mischen. Zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die gesamte Aufhängung nach unten zu drehen und die Kugelaggregation zu vermeiden. Stellen Sie das Röhrchen für 5 min bei RT für den DNA-Bindungsprozess ein. Drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um, damit die Perlen verteilt bleiben.
    5. Führen Sie die Zentrifugenröhrchen in das Magnetgestell ein und warten Sie 5 Minuten, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand angezogen werden und der Überstand transparent wird. Entfernen Sie den Überstand und vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren, und halten Sie die Röhrchen beim Pipettieren auf dem Rack.
    6. 300 μL des neu hergestellten 70% Ethanols in Röhrchen geben, die Röhrchen zweimal vorsichtig in einem Winkel von 180° drehen und die Perlen entlang der Tubenwand bewegen, um sie gründlich zu waschen. Pipettieren und entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
    7. Wiederholen Sie den Waschvorgang einmal.
    8. Nehmen Sie die 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie kurz (5 s). Führen Sie die Schläuche wieder in das Magnetgestell ein und warten Sie 5 Minuten, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand der Röhre angezogen werden. Pipetten Sie vorsichtig den verbleibenden Überstand im Boden heraus.
    9. Halten Sie die Schlauchkappe offen, um die Perlen bei RT für 3-5 min zu trocknen. Halten Sie Feuchtigkeit von den Perlen fern.
      HINWEIS: Schließen Sie den Deckel sofort, wenn Risse auf dem Perlenpellet auftreten.
    10. 15 μL des DNA-Elutionspuffers in das Röhrchen pipettieren. Spülen Sie das Pellet der Perlen bis zum Boden des Röhrchens ab, verschließen Sie die Kappe und wirbeln Sie sie. Zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die trübe Aufhängung auf den Boden des Röhrchens zu bekommen, und halten Sie das Röhrchen 5 Minuten lang stabil bei RT.
  3. Fragmentverstärkung
    1. Legen Sie die Bibliotheksbaureagenzien auf Eis, wenn sich das gefrorene Reagenz auflöst.
    2. 47,5 μL der Enzymmischung und 2,5 μL der Primermischung in das Röhrchen mit eluierter DNA und Perlen, Wirbel für 5 s und Zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die gesamte Flüssigkeit auf den Röhrchenboden zu bringen.
    3. Stellen Sie die Röhre auf RT für 5 min. Stecken Sie die Röhrchen wieder in Magnetgestelle und warten Sie, bis alle Perlen von der Seitenwand angezogen werden und der Überstand transparent wird. Übertragen Sie die DNA-Lösung vorsichtig in 0,2-ml-PCR-Röhrchen mit deutlich markierten Tags und vermeiden Sie das Pipettieren der Perlen.
    4. Inkubieren Sie die Probe in einem Thermocycler-Set mit folgendem Programm: 72°C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 Zyklen); 70 °C, 5 Min. Das Röhrchen nach Beendigung der Reaktion kurz zentrifugieren (5 s) und die Produkte bei 4 °C lagern.
    5. Die PCR-Produkte werden in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen (geringe Befestigung) überführt. Fügen Sie 97,5 μL (ursprüngliches Probenvolumen: Perlen (Volumen) = 1:1,5) magnetische Kügelchen in das Röhrchen hinzu, wenn die Reaktion beendet ist, pipettieren oder vorsichtig wirbeln, um die Perlen gut zu mischen, und zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die gesamte Flüssigkeit nach unten zu schleudern. Vermeiden Sie die Aggregation von Perlen. Stellen Sie die Röhre auf RT für 5 min. Drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um, damit die Perlen verteilt bleiben.
    6. Führen Sie die Zentrifugenröhrchen in das Magnetgestell ein und warten Sie 5 Minuten, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand angezogen werden und der Überstand transparent wird. Entfernen Sie den Überstand, vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren, und halten Sie die Röhrchen stabil auf dem Rack.
    7. 300 μL des neu hergestellten 70% Ethanols in Röhrchen geben, die Röhrchen zweimal vorsichtig in einem Winkel von 180° drehen und die Perlen entlang der Tubenwand bewegen, um sie gründlich zu waschen. Pipettieren und entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Perlen herauszupipettieren.
    8. Wiederholen Sie den Waschvorgang einmal.
    9. Nehmen Sie das 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie kurz (5 s). Führen Sie die Röhre wieder in das Magnetgestell ein und warten Sie 5 Minuten, bis alle magnetischen Perlen von der Seitenwand der Röhre angezogen werden. Pipetten Sie vorsichtig die restliche Flüssigkeit im Boden heraus.
    10. Halten Sie die Schlauchkappe offen, um die Perlen bei RT für 3-5 min zu trocknen. Halten Sie Feuchtigkeit von den Perlen fern.
      HINWEIS: Schließen Sie den Deckel sofort, wenn Risse auf dem Pellet der Perlen auftreten.
    11. Pipettieren Sie 22 μL des DNA-Elutionspuffers in das Röhrchen, spülen Sie das Pellet der Perlen ab und schließen Sie die Kappe und den Wirbel. Zentrifugieren Sie kurz (5 s), um die trübe Flüssigkeit auf den Boden des Röhrchens zu bekommen, und stellen Sie das Röhrchen auf RT für 5 min.
    12. Quantifizierung der Konzentration der konstruierten DNA-Bibliothek mit einem Fluorometer11 und Speicherung der konstruierten DNA-Bibliothek bei -20 °C; Die Konzentration des ausgewählten DNA-Fragments liegt zwischen 0,6-10 ng/μL. Kodieren Sie die Bibliotheksinformationen in der Bibliotheksdatenbank neu und speichern Sie die Proben entsprechend.

4. Erstellung der Sequenzierungsvorlage13,14

HINWEIS: Die in diesem Abschnitt verwendeten Materialien sind im Template Preparation Kit Set (Reagenzien/Lösungen/Materialien) des Sequencing Reactions Universal Kit (Table of Materials) verfügbar.

  1. Bibliotheks-Mix
    1. Füllen Sie das Formular eines Pre-Run-Datensatzblatts im Serversystem aus und markieren Sie das Probenröhrchen mit Bibliothekskonzentration und Barcode-Nummer. Vermeiden Sie es, dieselben Barcodes auf verschiedenen Proben in einem Durchlauf zu verwenden.
    2. Vortex und mischen Sie die Bibliotheksprobe und zentrifugieren Sie kurz (5 s). Verdünnen Sie alle Proben auf 100 pM mit nukleasefreiem Wasser, Wirbel für 30 s, und zentrifugieren Sie die Probe kurz.
      HINWEIS: Da DNA eine mittlere Länge von 260 bp hat und 1 bp 660 g / mol ist, berechnen Sie die Umwandlung von ng / μL in pM mit der folgenden Gleichung: 1 ng / μL = 5.827,5 pM / L.
    3. 10 μL 100 pM verdünnte Bibliothek in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen pipettieren, 30 s Wirbel und 2 s kurz zentrifugieren. Halten Sie die gemischte Bibliothek auf Eis.
  2. Vorlagenvorbereitung
    1. Starten Sie das Template-Amplifikationssystem und wählen Sie das Clean-Programm. Fügen Sie das Reaktionsöl zu 1/2 des Röhrchens hinzu und fügen Sie die Emulgatorbruchlösung zu 1/3 des Röhrchens hinzu.
    2. Vergewissern Sie sich, dass die Verstärkungsplatte und der Waschadapter in der Position EIN eingestellt sind. Reinigen Sie die Abfallflasche und stecken Sie eine Nadel in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen, um den Abfall zu sammeln. Bestätigen Sie die verarbeiteten Schritte auf dem Bildschirm des Schablonenverstärkungssystems. Drücken Sie WEITER , um ein sauberes Programm zu starten, was etwa 15 Minuten dauern wird.
    3. Ersetzen Sie die Verstärkungsplatte nach dem sauberen Programm durch eine neue, führen Sie die Sammelröhrchen mit 150 μL Bruchlösung II in den Rotor ein und legen Sie die Brücke auf die Sammelrohre. Das Reaktionsöl zu 1/2 des Röhrchens und die Emulgatorbruchlösung zu 1/3 des Röhrchens zugeben.
    4. PCR-Reagenzzubereitung emulgieren: Den emulgierten PCR-Puffer bei RT ausgleichen, bis er sich aufgelöst hat, alle Reagenzien kurz zentrifugieren (5 s) und vor Gebrauch auf Eis legen.
    5. 120 μL der emulgierten PCR-Enzymmischung, 100 μL Template-Ionenkugelpartikelpuffer (ISPs), 170,5 μL nukleasefreies Wasser und 9,5 μL der gemischten Bibliothek (100 pM) werden in ein Röhrchen mit 2.000 μL emulgiertem PCR-Puffer pipettiert. Mischen Sie die Lösung gut mit wiederholtem Pipettieren.
      HINWEIS: Die Mischlösung muss innerhalb von 15 Minuten auf das Schablonenverstärkungssystem geladen werden. Führen Sie alle Verfahren bei RT durch.
    6. Setzen Sie einen neuen Filter zur Schablonenvorbereitung stabil auf das Rohrgestell mit dem Probenportal nach oben. Wirbeln Sie die Lösung für 5 s, zentrifugieren Sie kurz (5 s) und überführen Sie die Lösung in das Probenportal des Filters, nachdem Sie dreimal wiederholt 800 μL pipettiert haben. Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um Blasen vor der letzten Injektion zu verringern. Vermeiden Sie es, Luft in den Filter einzublasen. Nach der Mischlösung werden 200 μL Reaktionsöl II eingespritzt.
    7. Drehen Sie das Probenportal des Filters nach unten und ersetzen Sie die Waschanpassung durch den Filter. Führen Sie die Probennadel in das mittlere Loch des Rotordeckels ein und drücken Sie die Nadel dann auf den Boden.
    8. Drücken Sie die RUN-Taste auf dem Bildschirm, wählen Sie das Programm entsprechend dem entsprechenden Kit aus und drücken Sie ASSIST , um alle Schritte zu überprüfen. Drücken Sie WEITER , bis die Ausführung gestartet ist. Es dauert ungefähr 4,5 Std., um fertig zu sein.
    9. Drücken Sie WEITER , wenn das Programm beendet ist. Das System startet eine 10-minütige Zentrifugation. Wenn die Zentrifugation beendet ist, drücken Sie die Taste Open Lid und bewegen Sie die Auffangröhrchen in die Racks. Wenn der Vorgang nicht in 15 Minuten zum nächsten Schritt führt, drücken Sie Final Spin , um erneut zu zentrifugieren.
    10. Entfernen Sie den Überstand im Sammelröhrchen und lassen Sie 100 μL Lösung im Röhrchen. Mischen Sie die verbleibende Probe durch Pipettieren und übertragen Sie die Probe in die neuen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung OT (One Touch 2-System).
      HINWEIS: Wenn Sie den Überstand pipettieren, vermeiden Sie es, den Röhrchenboden an der Seite zu berühren.
    11. 100 μL nukleasefreies Wasser werden in jedes der Sammelröhrchen pipettiert und die Lösung in das mit wiederholtem Pipettieren gewaschene OT-Röhrchen überführt. Geben Sie 600 μL nukleasefreies Wasser in das OT-Röhrchen, um das Gesamtvolumen 1 ml zu erhalten, Wirbel für 30 s, und zentrifugieren Sie bei 15.500 x g für 8 min.
    12. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand im OT-Röhrchen mit 100 μL Rest und verwenden Sie die Spitze, um die Ölschicht gründlich zu entsorgen. 900 μL nukleasefreies Wasser hinzufügen, 30 s Wirbel ziehen und bei 15.500 x g für 8 min zentrifugieren.
    13. Entfernen Sie den Überstand, bis 20 μL übrig sind, fügen Sie eine Schablonen-Resuspendierungslösung hinzu, um das Volumen 100 μL zu machen, Wirbel für 30 s und zentrifugieren Sie kurz für 2 s.
      HINWEIS: Die in diesem Schritt erhaltene Lösung muss in weniger als 12 h zum nächsten Schritt übergehen.
    14. Führen Sie das saubere Programm auf dem Vorlagenverstärkungssystem aus, bevor Sie die Stromversorgung herunterfahren.
  3. Vorlagenanreicherung
    1. Die Schmelzmischung wird mit 280 μL Tween-80 und 40 μL 1 M NaOH hergestellt.
    2. Waschen Sie die C1-Perlen. Wirbeln Sie die C1-Perlenlösung für 30 s. 100 μL Perlen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben, das Röhrchen 2 min lang auf ein Magnetgestell einführen und den Überstand entsorgen.
    3. 1 ml der C1-Perlenwaschlösung für 30 s in das Röhrchen und den Wirbel geben. Kurz zentrifugieren (5 s), Röhrchen 2 min in das Magnetgestell einführen und den Überstand entsorgen. 130 μl C1-Perlen-Resuspensionslösung in das Röhrchen pipettieren und die Perlen durch wiederholtes Pipettieren mischen. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen.
    4. Füllen Sie 100 μL der verdünnten Bibliothek, 130 μL C1-Perlen, 300 μL x 3 Schablonenwaschlösung und 300 μL der Schmelzlösung in die acht Vertiefungsstreifen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
    5. Installieren Sie die acht Well-Streifen auf dem Anreicherungsmodul, laden Sie die Pipettierspitze und stellen Sie das 200-μL-Zentrifugenröhrchen in die Sammelposition. Drücken Sie auf START , um das Programm auszuführen. Es dauert ca. 35 min.
    6. Die Probe wird automatisch im 200 μL Zentrifugenröhrchen gesammelt; Schließen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie ihn bei 15.500 x g für 5 min. Überprüfen Sie den Boden der Röhre, um zu überprüfen, ob noch C1-Perlen vorhanden sind.
    7. Wenn noch C1-Perlen vorhanden sind, pipetten Sie die Schablonenlösung wiederholt 10x und führen Sie das Rohr für 4 min in das Magnetgestell ein. Der gesamte Überstand wird in ein neues 0,2 ml Zentrifugenröhrchen überführt und bei 15.500 x g für 5 min zentrifugiert.
    8. Wenn keine sichtbaren C1-Perlen mehr vorhanden sind, verwerfen Sie den Überstand, bis 10 μL übrig sind, fügen Sie 200 μL nukleasefreies Wasser hinzu und mischen Sie durch 10x-Pipettieren. Zentrifuge bei 15.500 x g für 5 min.
    9. Verwerfen Sie den Überstand mit verbleibenden 10 μL und fügen Sie 90 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 μL zu erreichen. Pipettieren Sie 10x nach oben und unten, um die Lösung zu mischen, wirbeln Sie für 5 s und zentrifugieren Sie kurz (5 s). Die Lösung kann bei 2-8 °C für weniger als 3 Tage gelagert werden.

5. Sequenzierung der nächsten Generation 9,15

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Abschnitt werden auf der DA8600-Sequenzierungsplattform ausgeführt. Die in diesem Abschnitt verwendeten Materialien sind im Sequencing Kit Set (Reagenzien/Lösungen/Materialien) des Sequencing Reactions Universal Kit (Table of Materials) verfügbar.

  1. Überprüfen Sie alle Reagenzien und Materialien, die in einer Run-On-Sequenzierungsplattform benötigt werden.
    1. Sequenzierungsreagenz: Überprüfen Sie die Verfügbarkeit von Sequenzierungsenzymlösung (6 μL), Sequenzierungsprimern (20 μL), Qualitätskontrollvorlage (5 μL) und dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), gelagert zwischen -30-10 °C.
    2. Sequenzierlösung: Überprüfen Sie die Verfügbarkeit von Sequenzierlösung II (100 ml), Sequenzierungslösung III (50 ml), Glühpuffer (1.015 μL), Ladepuffer (10 μL), Schaummittel (2 μL), Chlortablette (1 Tablette) und Streptavidinperlen (100 μL), gelagert bei 4 °C.
    3. Materialien: Überprüfen Sie die Verfügbarkeit von 250-ml-Reagenzienröhrchen (8), 250-Reagenzien-Röhrchenverschluss (8), Sipper II (8), Sipper (1), 2-L-Reagenzflasche (1) und Sequenzierungschip (1), gelagert bei RT.
  2. Waschen Sie den Chip vor Gebrauch.
    1. Stellen Sie einen Chip stabil auf eine Arbeitsplatte, injizieren Sie 100 μL nukleasefreies Wasser in das Probenloch, entfernen Sie die Lösung im Ausgangsportal und wiederholen Sie den Vorgang.
    2. 100 μL 0,1 M NaOH-Lösung in den Chip injizieren und 1 min bei RT inkubieren.
    3. Injizieren Sie 100 μL Isopropanol in das Probenloch, entfernen Sie zusätzliche Lösung im Ausgangsportal und wiederholen Sie den Vorgang erneut.
    4. Decken Sie das Ausgangsportal mit einem Filterpapier ab, fließen Sie den Stickstoff ein, um das verbleibende Isopropanol in der Durchflusszelle des Chips zu trocknen, und halten Sie den gebrauchsfertigen Chip bei RT.
  3. Sequenzer-Initiierung
    1. Schalten Sie das Stickstoffventil ein und stellen Sie den Druck auf 30 psi ein. Starten Sie den Sequenzer, drücken Sie CLEAN auf dem Hauptbildschirm und wählen Sie Wasser oder Chlorid, um das Gerät entsprechend zu waschen.
      HINWEIS: Waschen Sie mit Wasser vor jedem Lauf, waschen Sie mit Chlorid jede Woche oder die Zeit, in der die Maschine mit Reagenzien über 48 h steht.
    2. Chloridwäsche: Wählen Sie eine Reagenzflasche, die für die Chloridwäsche vorgesehen ist, waschen Sie die Flasche zweimal mit 18 MΩ Wasser und füllen Sie die Flasche mit 1 L 18 MΩ Wasser. Geben Sie eine Chloridtablette in die Flasche, lösen Sie die Tablette für 10 min auf, fügen Sie 1 ml 1 M NaOH hinzu und kehren Sie dann die Flasche um, um die Lösung zu mischen. Verwenden Sie die Chloridlösung innerhalb von 3 h nach der Zubereitung.
    3. 100 ml Chloridlösung mit einem 0,45 μm Filter filtrieren und mit zwei Röhrchen sammeln. Installieren Sie die beiden Chloridröhrchen an den Positionen C1 und C2. Drücken Sie CLEAN auf dem Hauptbildschirm und rüsten Sie einen Chip für die Chloridwäsche aus.
    4. Drücken Sie auf NEXT und überprüfen Sie alle Schritte auf dem Bildschirm, um das Waschprogramm zu starten. Das Programm endet in 30 Minuten. Beginnen Sie nach der Chloridwäsche eine Wäsche mit Wasser.
    5. Wasserwäsche: Markieren Sie zwei wasserspezifische Röhrchen mit C1 und C2 und waschen Sie die Röhrchen zweimal mit 18 MΩ Wasser. Fügen Sie 100 ml 18 MΩ Wasser zu jedem der Wasserwaschschläuche hinzu und stellen Sie sie in C1- bzw. C2-Positionen.
    6. Wählen Sie das Programm CLEAN , installieren Sie den für die Wasserwäsche vorbereiteten Chip, drücken Sie WEITER, und überprüfen Sie dann alle Schritte auf dem Bildschirm , um das Waschprogramm zu starten.
  4. Initialisierung
    1. Reinigen Sie die Waschflasche mit Waschlösung II, markieren Sie sie als W2 und waschen Sie sie dreimal mit 18 MΩ Wasser.
    2. Reinigen Sie den Stickstoffschlauch mit luftgelegtem Papier, führen Sie ihn in den Röhrchenboden ein und stellen Sie den Luftstrom auf 0,5 l/min ein. Entleeren Sie den Sauerstoff in der Flasche und füllen Sie die Flasche mit 1.920 ml 18 MΩ Wasser. Sequenzlösung II und 10 μL 1 M NaOH in die Flasche geben, den Verschluss schließen und die Flasche mehrmals umkehren, um die Lösung zu mischen.
    3. Markieren Sie zwei neue Röhren als W1 und W3. 32 μL 1 M NaOH zu W1 geben, 40-50 ml 1x Sequenzlösung III zu W3 geben und die Kappen schließen.
      HINWEIS: 1x Sequenzlösung III muss bei der ersten Anwendung 30 min in einem 37 °C heißen Wasserbad stehen. Sequenzlösung II muss vor Licht geschützt und bei RT gelagert werden. Die Waschflasche muss nach 20-maligem Gebrauch durch eine neue ersetzt werden.
    4. Drücken Sie INITIALIZE auf dem Hauptbildschirm, ändern Sie den Sipper an den Positionen W1, W2 und W3, stellen Sie die Röhrchen entsprechend in ihre Position und verschließen Sie sie durch Drehen fest. Installieren Sie einen Chip für die Initialisierung und überprüfen Sie die Zustandsparameter der Maschine.
    5. Drücken Sie WEITER , um das Initialisierungsprogramm zu starten. Es dauert 40 Minuten im ersten Abschnitt.
      HINWEIS: Die Handschuhe müssen vor dem Wechsel des neuen Sippers gewechselt werden, um eine Kontamination des Körpers des Sippers zu vermeiden. Nach der Verwendung zum Waschen und Initialisieren von Wasser können die Chips zur Initialisierung verwendet werden, verwenden jedoch nicht die Chips, die für Chloridwaschchips zur Initialisierung verwendet werden.
    6. Lösen Sie dGTP, dCTP, dATP und dTTP auf Eis auf und Wirbel zum Mischen auf. Markieren Sie vier neue Röhrchen als G, C, A und T und pipettieren Sie 70 μL der Lösung entsprechend dem Tag des Röhrchens.
  5. Bereiten Sie die Bibliothek für die Ausführung vor.
    1. Legen Sie die Qualitätskontrollschablone, die Primer und die Enzymlösung auf Eis.
    2. Bereiten Sie die DNA-Bibliothek vor, wenn das Initialisierungsprogramm noch etwa 20 Minuten Zeit hat. Vortex die Qualitätskontrollschablone für 30 s mischen, und kurz für 2 s zentrifugieren. 5 μL der Qualitätskontrollschablone in die Schablonenlösung überführen, 5 s durchziehen und das Röhrchen für 15.500 x g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand durch vorsichtiges Pipettieren, vermeiden Sie es, das Pellet zu berühren, und lassen Sie ein Volumen von 10 μL im Röhrchen.
    3. 15 μL Glühpuffer in das Röhrchen geben; Das Gesamtvolumen der Lösung beträgt 25 μL.
    4. Wirbeln Sie die Sequenzprimer, wenn sie sich vollständig auf Eis auflösen und zentrifugieren Sie kurz für 2 s. 20 μL der Sequenzprimer aus dem vorherigen Schritt in das Röhrchen überführen, Wirbel für 5 s, kurz für 2 s zentrifugieren und dann vor Gebrauch bei RT lagern.
  6. Laden der Probe und Sequenzierung
    1. Pipettieren Sie 55 μL der im vorherigen Schritt vorbereiteten Probenlösung und injizieren Sie sie in das Probenloch des Chips.
    2. Setzen Sie den Chip auf die Zentrifuge; Halten Sie die Kerbe nach außen und das Probenportal nach innen, balancieren Sie es mit einem anderen gebrauchten Chip aus und zentrifugieren Sie für 10 min.
    3. Bereiten Sie die Ladelösung vor.
      1. Mischen Sie 0,5 ml des Glühpuffers und 0,5 ml nukleasefreies Wasser in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Markieren Sie es als 50% Glühpuffer und verbrauchen Sie es innerhalb von 7 Tagen.
      2. Mischen Sie 0,5 ml Isopropanollösung und 0,5 ml Glühpuffer. Markieren Sie es als 50% Waschpuffer und verbrauchen Sie es innerhalb von 24 Stunden.
      3. Mischen Sie 6 μL Sequenzenzym und 60 μL 50% Glühpuffer. Markieren Sie es als Enzymreaktionspuffer und legen Sie die Lösung nach der Zubereitung auf Eis.
      4. Mischen Sie 49 μL 50% Glühpuffer und 1 μL Schaumbildner und markieren Sie es als Schaumlösung.
    4. Blasen Sie 100 μL Luft in die Schaumlösung, pipettieren Sie die Lösung wiederholt, bis die Blasen in einem dichten schäumenden Zustand sind, und halten Sie das Schaumvolumen bei etwa 250 μL.
    5. Legen Sie den Chip nach der Zentrifuge auf die Bank, injizieren Sie 100 μL Schaum in das Probenloch und entfernen Sie die extrudierte Lösung in das Ausgangsportal. Setzen Sie den Chip wieder in die Zentrifuge und zentrifugieren Sie ihn kurz für 30 s.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5.6.4-5.6.5.
    7. Injizieren Sie zweimal 100 μL 50% Waschpuffer und entfernen Sie die extrudierte Lösung nach jeder Injektion in das Ausgangsportal.
    8. Injizieren Sie dreimal 100 μL 50%igen Glühpuffer und entfernen Sie die extrudierte Lösung nach jeder Injektion in das Ausgangsportal.
    9. Injizieren Sie 65 μL 50% Enzymreaktionspuffer, vermeiden Sie Blasen und entfernen Sie die extrudierte Lösung im Außenportal.
    10. Stabilisieren Sie den geladenen Chip bei RT für 5 min und installieren Sie den Chip auf dem Sequenzer-Chipportal. Wählen Sie den in Schritt 6 programmierten Plan, überprüfen Sie die Informationen und starten Sie den Lauf. Es dauert ungefähr 1,5 Std., um fertig zu sein.
    11. Führen Sie das Wasserwaschprogramm innerhalb von 72 Stunden nach Ende des Laufs durch. Führen Sie die Chloridwäsche vor der Wasserwäsche durch, wenn die Zeit 72 h überschreitet. Schalten Sie den Sequenzer aus und schließen Sie das Stickstoffventil.

6. Planen eines instruierten Sequenzierungslaufs im Reporterserversystem16

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Abschnitt werden auf Ion Proton Sequencer mit dem Reporter-Serversystem ausgeführt.

  1. Melden Sie sich beim Serversystem an, wählen Sie die Registerkarte Plan und klicken Sie auf Plan Template Run (Vorlage ausführen). Wählen Sie das gesamte Genom als Ausführungstyp und wählen Sie die entsprechende Vorlage aus der Liste der geplanten Ausführungsvorlagen aus.
  2. Geben Sie auf der Registerkarte Plan die folgenden Optionen ein, oder treffen Sie eine Auswahl:
    1. Geben Sie einen neuen Ausführungsplannamen entsprechend dem Probenstapel ein, wählen Sie hg19 (Homo sapiens) aus der Dropdown-Liste Referenzbibliothek aus, und wählen Sie in den Dropdown-Listen Zielregionen und Hotspot-Regionen die Option Keine aus.
    2. Geben Sie die Anzahl der im Sampleset verwendeten Barcodes ein, wählen Sie einen Barcode aus der Dropdown-Liste für jede Probe aus, und geben Sie einen eindeutigen, beschreibenden Namen ein, der hilfreich sein kann, um die Probe zu gruppieren und zu verfolgen. Vermeiden Sie die Verwendung der Standardstichprobe 1 usw.
    3. Wählen Sie auf der Registerkarte Ion Reporter die Option Keine aus, klicken Sie auf Weiter, und wählen Sie DNA in der Anwendung und Gesamtes Genom als Zieltechnik aus.
    4. Überprüfen Sie auf der Registerkarte Kits die Auswahl, oder nehmen Sie Änderungen vor, solange dies für einen Lauf geeignet ist.
      1. Wählen Sie Ion Plus Fragment Library Kit aus der Dropdown-Liste Library Kit Type aus. Wählen Sie Ion PI HI-Q OT2 200 kit in der Dropdown-Liste Template Kit und dann OneTouch als Standard aus. Wählen Sie Ion PI HI-Q Sequencing 200 Kit aus der Dropdown-Liste Sequencing Kit aus.
      2. Geben Sie 300 Flows ein, wählen Sie Ion PITM Chip aus der Dropdown-Liste Chip Type (Chip-Typ ) und IonXpress (IonXpress ) aus der Dropdown-Liste Barcode Set ( Barcode-Set ) aus.
      3. Heben Sie die Auswahl von Als Duplikatlesevorgänge markieren und die Auswahl von Neuausrichtung aktivieren auf.
    5. Wählen Sie das entsprechende Plugin auf der Registerkarte Plugins aus, um die Datenanalyse in Schritt 7 durchzuführen. Schließen Sie die Auswahl im Projektschritt ab, klicken Sie auf Weiter und klicken Sie auf Plan Run in der unteren rechten Ecke, um die geplanten Läufe aufzulisten.
    6. Wählen Sie auf der Registerkarte Geplante Läufe den neu erstellten Lauf aus und überprüfen Sie alle Einstellungen im Überprüfungsfenster.

7. Datenanalyse

  1. Analysieren Sie die Kopienzahlvarianten (CNVs) mithilfe eines bioinformatischen Workflows.
    HINWEIS: Die CNVs wurden im bioinformatischen Workflow mit der Implementierung eines Algorithmus analysiert, der auf einem versteckten Markov-Modell (HMM)17 basiert; Das Modell verwendet die Leseabdeckung über das gesamte Genom, um die Kopienzahl oder den Ploidiestatus der ganzen Zahl (d. h. 0, 1, 2, 3 usw.) vorherzusagen. Die gesamte Bioinformatik-Pipeline wurde im Plugin eines Sequenzserversystems erstellt, was in Abbildung 2 demonstriert ist. Der Schritt der bioinformatischen Analyse dauert durchschnittlich 4 Stunden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wenn der Sequenzplan nach dem laufenden Prozess in der Maschine abgeschlossen ist, meldet das Sequenzserversystem die Zusammenfassung mit beschreibenden Informationen zu generierten Daten, Chipstatus, ISP-Laderate und Bibliotheksqualität, wie in Abbildung 2 dargestellt. In dieser Ergebnisdemonstration wurden 17,6 G-Daten in der Gesamtbasis erhalten, und die Gesamtladerate von ISP betrug 88% in den Gesamtwells des Chips; Die Heatmap zeigte, dass die Probe gleichmäßig auf die Gesamtfläche des ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die chromosomale Aneuploidie von Embryonen ist die Ursache für einen großen Teil des Schwangerschaftsverlustes, unabhängig davon, ob es sich um eine natürliche Empfängnis oder eine In-vitro-Fertilisation (IVF) handelt. In der klinischen Praxis der IVF wird vorgeschlagen, dass das Screening der Embryo-Aneuploidie und der Transfer des Euploidie-Embryos das Ergebnis der IVF verbessern könnte. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist die früheste Technik für die Geschlechtsselektion und PGT-A; Diese Techn...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten Dr. Zhangyong Ming und Herrn Rongji Hou für ihre Beratung zur erweiterten Anwendung von LIMS danken. Diese Studie wird von PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) und Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 μ m Spritzenvorsatz-FiltereinheitMerkmilliporeMillex-HV
1,5 mL DNA LoBind RöhrchenEppendorf30108051
15 mL RöhrchenGreiner Bio-One188261
2,0 mLDNA LoBind RöhrchenEppendorf30108078
50 mL RöhrchenGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Puffer (Mg2+ Plus)FAPON
  Anstart Tap DNA-PolymeraseFAPON
AMPure XP Reagenz (magnetische Beads für die DNA-Bindung)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
ZelllysepufferSouthern Medical UniversityZelllysepuffer mit 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 1 % (v/v) Triton X-100, 5 mM Natrium Pyrophosphat, 2 mM β-Glycerophosphat, 0,1 % SDS
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA-ElutionspufferNEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
EthylalkoholGuangzhou Chemisches Reagenzhaus Thermo Fisher Wissenschaftlichehttp://www.chemicalreagent.com/
Unabhängig entwickelte Reagenzien für die Amplifikation des gesamten GenomsSouthern Medical UniversityDie Reagenzien bestehen aus den folgenden Komponenten:
1. Zelllyse
2. Amplifikation Vorgemischte Lösung
      1) Grundierung WGA-P2 (10 μ M)
      2) dNTP (10 mM)
      3) 5x Anstart Taq Puffer (Mg2+ Plus)
3. Amplifikationsenzym
      1) Anstart Tap DNA-Polymerase (5 U/μ L)
Ion PI Hi-Q OT2 200 KitThermo Fisher ScientificA26434Kit, das in Schritt 4.2.8 erwähnt
wurde Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher ScientificA26433
IonenprotonensystemLife Technologies4476610
Ion Reporter Server SystemLife Technologies4487118
IsopropanolGuangzhou Chemisches Reagenzienfabrikhttp://www.chemicalreagent.com/
BibliotheksvorbereitungskitDaan Gene Co., Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
Nuklease-freies WasserLife TechnologiesAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'OneTouch
2 SystemLife Technologies4474779  Template-Amplifikations- und Anreicherungssystem
PCR-RöhrchenAxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA KitTakara BioUSA R300671
PipettenspitzenQualität Wissenschaftliche Produktehttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Tragbare Mini-Zentrifuge LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 FluorometerLife TechnologiesQ33216Fluorometer
Qubit Assay RöhrchenLife TechnologiesQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
Sequenzierer-ServersystemThermo Fisher ScientificTorrent Suite Software
Sequenzierung Reaktionen Universal KitDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
Dieses Kit enthält folgende Komponenten:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR Buffer
Emulsion PCR Enzyme mix
Template Carrier solution

1.2 Template Preparation Lösungen:
Template Preparation Reaktionsöl I
Emulgator aufbrechende Lösung II
Template Preparation Reaktionsöl II
Nukleasefreies Wasser
Tween Lösung
Demulgierlösung I
Template-Waschlösung
C1-Bead-Waschlösung
C1-Bead-Resuspensionslösung
Template-Resuspensionslösung

1.3 Matrizenvorbereitungsmaterialien:
Reagenzröhrchen I
Anschluss
Entnahmeröhrchen
Reagenzröhrchenpipette I
Amplifikationsplatte
8 Vertiefungen strip
Spezielle Tipps
Schablonenvorbereitung Waschadapter
Schablonenvorbereitungsfilter

2. Sequenzierungskit Set

2.1 Sequenzierungskit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequenzierungsenzymlösung
Sequenzierungsprimer
Vorlagen für Qualitätskontroll

2.2  Sequenzierlösungen:
Sequenzierlösung II
Sequenzierlösung IIII
Glühpuffer
Ladepuffer
Schaumbildner
Chlortabletten
C1 bead

2.3 Sequenzierungsmaterialien:
Reagenzröhrchen II
Reagenzröhrchendeckel
Reagenzröhrchen-Schlüpfer  II
Reagenzflasche sipper
Reagenzflaschen

3. Chip
NatronlaugeSigma72068-100ML
ThermocyclerLife4375786
Technologies

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341(2012).
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