Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Præimplantationsgenetisk test for aneuploidi på en halvlederbaseret næste generations sekventeringsplatform

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63493
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen præsenterer de overordnede procedurer i laboratoriet, der kræves i genetisk test før implantation for aneuploidi på en halvlederbaseret næste generations sekventeringsplatform. Her præsenterer vi de detaljerede trin i helgenomforstærkning, udvælgelse af DNA-fragment, bibliotekskonstruktion, skabelonforberedelse og sekventering af arbejdsflow med repræsentative resultater.

Abstract

Næste generations sekventering har fået stigende betydning i den kliniske anvendelse i bestemmelsen af genetiske varianter. I den genetiske test før implantation har denne teknik sine unikke fordele i skalerbarhed, gennemstrømning og omkostninger. Til præimplantationsgenetisk test til aneuploidianalyse giver det halvlederbaserede næste generations sekventeringssystem (NGS), der præsenteres her, en omfattende tilgang til bestemmelse af strukturelle genetiske varianter med en minimumsopløsning på 8 Mb. Fra prøveoptagelse til den endelige rapport kræver arbejdsprocessen flere trin med tæt overholdelse af protokoller. Da forskellige kritiske trin kunne bestemme resultatet af forstærkning, bibliotekets kvalitet, dækning af læsninger og output af data, kunne beskrivende information med anden visuel demonstration end ord give flere detaljer til operationen og manipulationen, hvilket kan have stor indflydelse på resultaterne af alle kritiske trin. De metoder, der præsenteres heri, vil vise de procedurer, der er involveret i helgenomforstærkning (WGA) af biopsierede Trophectoderm (TE) celler, genomisk bibliotekskonstruktion, sequencerstyring og endelig generering af kopinummervarianters rapporter.

Introduction

Aneuploidi er abnormiteten i antallet af kromosomer ved tilstedeværelsen af et eller flere ekstra kromosomer eller fraværet af et eller flere kromosomer. Embryoner, der bærer en form for aneuploidi, såsom tab af et X-kromosom (Turner syndrom), ekstra kopier af autosomer, som trisomier af autosom 21 (Downs syndrom), 13 (Patau syndrom) og 18 (Edwards syndrom) eller ekstra kønskromosomer som 47, XXY (Klinefelter syndrom) og 47, XXX (Triple X syndrom), kan overleve til sigt med fødselsdefekter1. Aneuploidi er den primære årsag til aborter i første trimester og in vitro befrugtning (IVF)svigt 2. Det rapporteres, at aneuploidihastigheden kan variere fra 25.4% -84.5% gennem de forskellige alderslag i den naturlige cyklus og medicinsk kontrolgruppe i IVF-praksis3.

Næste generations sekventeringsteknologi bliver vildt anvendt til bestemmelse af genetisk information klinisk; det giver praktisk adgang til genomsekvens med effektivitet og høj gennemstrømning. Især næste generations sekventering revolutionerede også diagnosen af lidelser med genetiske faktorer og test for abnormitet i genomet4. Ved hjælp af halvledersekventeringsteknologi til direkte overførsel af kemiske signaler i sekventeringsbioreaktion til digitale data giver det halvlederbaserede sekvenssystem en direkte realtidsdetektion til sekvensdata i 3-7 h 5,6.

I en IVF-procedure undersøger præimplantationsgenetisk test (PGT) embryoets genetiske profil, inden den overføres til livmoderen for at forbedre IVF-resultatet og reducere risikoen for genetiske lidelser hos nyfødte 1,7. I PGT kombineret med NGS-teknikker forstærkes genetisk materiale ekstraheret fra mindre end 10 celler med helgenomforstærkningssæt eller et uafhængigt udviklet helgenom-amplifikationsreagens. Dette kræver kun et trin i forstærkningsfasen og kræver ikke forforstærkning for at opnå helgenomforstærkningsprodukter. Primere eller paneler til kopinummervariant og speciel genlokalisering er designet og anvendt i det konstruerede bibliotek.

En typisk arbejdsgang for præimplantationsgenetisk testning-aneuploidi (PGT-A) i NGS involverer serielle procedurer og kræver en intens arbejdsbyrde for laboratoriepersonale8. Nogle fejloperation forårsaget procedure roll-back kan føre til uønsket tab af både tid og ressourcer i laboratoriet. En kortfattet og klar standardoperationsprocedure (SOP) for PGS-NGS-arbejdsgangen er nyttig; Ordformatprotokoller kan dog ikke præsentere mere detaljerede oplysninger om prøvebehandling, enhedsmanipulation og instrumenters indstillinger, som kan visualiseres i en videoprotokol. I denne artikel kan en valideret arbejdsgang kombineret med en visualiseret demonstration af driftsdetaljer tilbyde mere direkte og intuitive henvisningsprotokoller i PGT-praksis på en halvledersekventeringsplatform.

Protokollen beskriver her en metode, der understøtter batching op til 16 embryobiopsier parallelt. For større partier anbefales det at bruge en kommerciel kitbaseret protokol til halvledersekventering, såsom Reproes-PGS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller og trophectoderm (TE) biopsi (1.1.1.1 afsnit), der blev anvendt i denne undersøgelse, blev gennemgået og godkendt af den humane forskningsetiske komité på nr. 924 hospital den 18. september 2017 (NO: PLA924-2017-59). Patienterne/deltagerne gav deres skriftlige informerede samtykke til at deltage i dette studie.

1. DNA-isolering fra human embryobiopsi og hel genomisk amplifikation

  1. Protokol for helgenomforstærkning 9,10
    BEMÆRK: Pico PLEX WGA Kit bruges til at udføre helgenomforstærkning.
    1. Prøveindsamling og opbevaring
      1. Trophectoderm biopsi: Tegn i gennemsnit seks til ni celler fra herniated TE af D5/6 embryo efter assisteret ruge for at opnå en kvalificeret mængde DNA til følgende amplifikation.
      2. Prøvecellerne overføres til et PCR-rør i 5 μL PBS.
      3. Prøverne fryses straks ved -80 °C, hvis protokollen ikke direkte fortsætter til DNA-ekstraktionen.
    2. Celle lysis
      BEMÆRK: Supplerende fil 1 viser og tjener som reference for de anbefalede volumener af hver komponent ved forberedelse af masterblandingen under cellelyse og helgenomforstærkning af batcher på 1, 8, 16 og 32 prøver (med overforbrug for at imødekomme pipetteringsfejl). Ved formulering af andre masterblandinger af denne protokol øges volumenet af hver komponent yderligere for at imødekomme komponentforbruget forårsaget af gentagen pipettering. Al kort centrifugering udføres på en bordplade minicentrifuge i 2-10 s ved stuetemperatur (RT) med et fast omdrejningstal på 10.000 med en centrifugalkraft på 5.300 x g. Centrifugalkraften skal være mellem 2.000 x g og 12.000 x g.
      1. Cellelysisblandingen fremstilles med 4,8 μL ekstraktionsenzymfortyndingsbuffer og 0,2 μL af celleekstraktionsenzymet pr. prøve.
      2. 5 μL af den frisklavede cellelysis blandes i hver 5 μL celleprøve i PCR-rør, og røret centrifugeres kortvarigt ved RT i 5 s. Hvirvl ikke røret.
      3. Prøven inkuberes i en termisk cyklus som følger: 75 °C, 10 min. 95 °C, 4 minutter; 25 °C, 14 min. Centrifuger kortvarigt (5 s) røret efter inkubationen.
    3. Forforstærkelse af hele genomets DNA
      1. Forforstærkerblandingen fremstilles med 4,8 μL forforstærkerbufferen og 0,2 μL forforstærkerenzymet pr. prøve.
      2. 5 μL af forforstærkelsesblandingen pipetteres i prøverørene gennem rørets vægge, og centrifuger kortvarigt i 3 s. Undgå, at spidsen når bunden af røret, og hvirvl ikke røret.
      3. Prøven inkuberes i henhold til det termiske cyclerprogram, der er nævnt i tabel 1.
    4. Helgenom DNA-amplifikation
      1. Centrifuger kortvarigt prøven i 5 s og læg forforstærkerinkubationsproduktet på is.
      2. Hele genomamplifikationsblandingen forberedes med 25 μL amplifikationsbufferen, 0,8 μL amplifikationsenzymet og 34,2 μL nukleasefrit vand pr. Prøve.
      3. 60 μL af den frisklavede helgenomamplifikationsblanding blandes med 15 μL præ-amp inkubationsprodukt. det samlede volumen skal være 75 μL. Centrifuger kortvarigt i 5 s. Undgå, at spidsen når bunden af røret, og hvirvl ikke røret.
      4. Placer PCR-røret på den termiske cyklist, og kør det termiske cyclerprogram, der er nævnt i tabel 2.
      5. Rørene centrifugeres kortvarigt i 5 s, og produkterne overføres til et nyt 1,5 ml centrifugerør.
      6. Kvantificer WGA-produktkoncentrationen med et fluorometer11. Prøver kan opbevares tidsmæssigt ved -20 °C i mindre end 2 måneder, hvis de ikke går videre til næste trin.
  2. Protokol for de uafhængigt udviklede WGA-reagenser.
    1. Prøveindsamling og opbevaring
      1. Træk cellerne fra D5/6 embryoet efter assisteret udklækning til følgende forstærkning.
      2. Prøvecellerne overføres med 1,5 μL PBS til et PCR-rør indeholdende 2 μL PBS.
        BEMÆRK: PBS er fri for Mg2+ og Ca2+.
      3. Prøverne fryses straks ved -80 °C, hvis de ikke direkte overføres til DNA-ekstraktionsprotokollen.
    2. Celle lysis
      1. Smelt cellelysisbufferen (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylenglycoltetraeddikesyre (EGTA), 1% (v / v) Triton X-100, 5 mM natriumpyrophosphat, 2 mM β-glycerophosphat, 0,1% SDS) ved RT og læg den på isen. Der tilsættes 2 μL cellelysisbuffer til hver prøve, og centrifuger kortvarigt (5 s).
        BEMÆRK: Rør ikke slangen, og undgå, at pipettespidsen rører væskeoverfladen i røret for at undgå at bringe celler eller DNA ud af reaktionssystemet.
      2. Prøven inkuberes i en termisk cyklist som følger: 55 °C, 20 min. 95 °C, 10 minutter; 4 °C, hold. Centrifuger kortvarigt røret ved RT i 10 s efter inkubationen.
    3. Helgenom DNA-amplifikation
      1. Centrifuger kort cellelyseproduktet i 5 s og læg det på is.
      2. Hele genomamplifikationsblandingen fremstilles for hver prøve ved blanding med 16 μL forblandet amplifikationsopløsning, 1 μL amplifikationsenzym og 28 μL nukleasefrit vand. Bland forsigtigt, centrifuger kort (5 s), og læg blandingen på is. Hvirvl ikke røret.
      3. 45 μL af den frisklavede helgenomforstærkningsblanding pipetteres i cellelysisproduktet fremstillet i trin 1.2.2.2. bland forsigtigt og centrifuger kort i 5 s.
        BEMÆRK: Rør ikke i vand, og undgå, at pipettespidsen rører væsken i røret.
      4. Placer PCR-røret på den termiske cyklist, og kør programmet som beskrevet i tabel 3.
      5. Rørene centrifugeres kort i 5 s, og produkterne overføres til et nyt 1,5 ml centrifugerør.
      6. Kvantificer WGA-produktkoncentrationen med et fluorometer11 , og registrer resultaterne på QA-arket (kvalitetsanalyse). Produkter med kvalificerede koncentrationer kan tidsmæssigt opbevares ved -20 °C i mindre end 2 måneder, hvis de ikke går videre til næste trin.

2. Valg af forstærkningsfragment

BEMÆRK: Materialer, der bruges i dette afsnit, er tilgængelige i bibliotekets forberedelsessæt (materialetabel).

  1. Forberedelse inden start
    1. Ligevægt de magnetiske perler (n x 100 μL) til rensning ved RT i 30 min.
    2. Gendan det tidligere WGA-produkt til RT. Vortex produktet ved RT i 30 s, før det centrifugeres kortvarigt.
    3. Forbered frisk 70% ethanol.
  2. Udvælgelsesprocedure for fragment
    1. 25 μL af WGA-produkterne pipetteres, og der overføres til et 1,5 ml centrifugeglas med 25 μL nukleasefrit vand forudindlæst.
    2. Vortex og bland DNA-oprensningsperlerne godt. Aliquot 50 μL af det i hvert prøverør (original prøve: perler (volumen) = 1: 1), hvirvel og centrifuge kort (5 s). Indstil røret i 5 min ved RT for DNA-bindingsprocessen.
    3. Indsæt 1,5 ml centrifugerøret i et magnetstativ, og vent, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg. Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt 1,5 ml centrifugerør. Undgå at pille perlerne ud.
    4. I henhold til det oprindelige prøvevolumen pipetteres 30 μL (original prøve: perler (volumen) = 1:0,6) magnetiske perler, hvirvel og centrifuge kortvarigt (5 s). Indstil røret i 5 min ved RT for DNA-bindingsprocessen.
    5. Indsæt 1,5 ml centrifugerørene i magnetstativet, og vent i 5 minutter, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten. Undgå at pille perlerne ud.
    6. Pipetter 300 μL 70% ethanol i 1,5 ml centrifugerøret, drej forsigtigt røret to gange med en vinkel på 180 °, og bevæg perlerne langs rørvæggen for en grundig vask. Pipetter og kassér supernatanten. Undgå at pille perlerne ud.
    7. Gentag vaskeproceduren en gang.
    8. Fjern 1,5 ml centrifugerøret fra magnetstativet, og centrifuger kort (5 s). Indsæt rørene tilbage i magnetstativet, og vent, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg.
    9. Pipetter forsigtigt den resterende væske i bunden. Hold røret åbent for at tørre perlerne ved RT i 3-5 min. Hold fugt væk fra perlerne.
      BEMÆRK: Luk låget med det samme, hvis der opstår revner på kuglen.
    10. Fjern rørene fra magnetstativet, pipetter 25-30 μL af DNA-elueringsbufferen i et rør, og luk hætten og hvirvelen. Centrifuger kortvarigt (5 s) for at få den uklare væske til bunden af røret, og indstil røret til RT i 5 min.
    11. Indsæt rørene tilbage i magnetstativerne, og vent, indtil alle perlerne tiltrækkes af rørets sidevæg, og supernatanten bliver gennemsigtig. Overfør forsigtigt DNA-opløsningen til nye 1,5 ml centrifugerør. Undgå at pille perlerne ud.
    12. Kvantificer koncentrationen af DNA efter fragmentvalg med et fluorometer11, opbevar det ved -20 ° C. Typisk varierer koncentrationen af det valgte DNA-fragment fra 1,5-2,4 ng / μL.

3. Udarbejdelse af DNA-biblioteket12

BEMÆRK: Materialer, der bruges i dette afsnit, er tilgængelige i bibliotekets forberedelsessæt (materialetabel).

  1. Afslut reparation
    1. Ligevægt de magnetiske perler ved RT i 30 min.
    2. Ligevægt mellem DNA-produktet fra fragmentudvælgelse i trin 2.2.12 til RT. Kontroller og registrer mærket på hvert hætteglas, der indeholder DNA'et.
    3. Forbered DNA-slutreparationssystemet med 30 μL DNA-produkter, 10 μL endereparationsbuffer, 0,5 μL endereparationsenzym og 9,5 μL nukleasefrit vand i et 1,5 ml centrifugerør. Vortex røret i 30 s og centrifuger kort (5 s) ved RT for at få al væske til rørbunden.
    4. Der inkuberes ved 25 °C i 30 minutter, og røret centrifugeres kortvarigt (5 s) efter inkubation.
    5. Vortex eller omvendt blande de magnetiske perler og overføre 75 μL af de magnetiske perler til et rør indeholdende ende-reparerede DNA-prøver (original prøve: perler (volumen) = 1: 1.5). Pipetter eller hvirvler forsigtigt for at blande perlerne godt og centrifuger kortvarigt (5 s) for at dreje hele suspensionen ned til bunden af røret. Indstil røret i 5 min ved RT for DNA-bindingsprocessen. Vend rørene forsigtigt for at holde perlerne spredt.
    6. Indsæt centrifugerørene i magnetstativet, og vent i 5 minutter, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af sidevæggen, og supernatanten bliver gennemsigtig. Fjern supernatanten, og undgå at pipettere perlerne ud, og hold rørene på stativet, når du pipetterer.
    7. Overfør 300 μL af den nylavede 70% ethanol til rørene, drej forsigtigt rørene to gange i en 180 ° vinkel, og flyt perlerne langs rørvæggen for en grundig vask. Pipetter og kassér supernatanten. Undgå at pille perlerne ud.
    8. Gentag vaskeproceduren en gang.
    9. Fjern 1,5 ml centrifugerørene fra magnetstativet, og centrifuger kortvarigt (5 s). Indsæt rørene tilbage i magnetstativet, og vent i 5 minutter, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg.
    10. Pipetter forsigtigt den resterende væske i bunden. Åbn hætten på 1,5 ml centrifugerør, og tør perlerne ved RT i 3-5 min. Hold fugt væk fra perlerne.
      BEMÆRK: Luk låget med det samme, hvis der opstår revner på kuglen.
    11. Pipetter 33 μL DNA-elueringsbuffer i et rør, luk hætten og hvirvelen. Centrifuger kortvarigt (5 s) for at få den uklare suspension til bunden af røret, og indstil røret til RT i 5 min.
    12. Indsæt rørene tilbage i magnetstativerne, og vent, indtil alle perlerne tiltrækkes af sidevæggen, og opløsningen bliver gennemsigtig. Overfør forsigtigt DNA-opløsningen til nye 1,5 ml centrifugerør med det rigtige mærke, så du undgår at pipettere perlerne ud.
  2. Stregkode ligering
    1. Stregkodeligationsreagenserne anbringes i trin 3.2.2 på is for at smelte alle de frosne reagenser.
    2. Ligeringssystemet forberedes med 32 μL endereparations-DNA-produkter, 10 μL nukleasefrit vand, 5 μL ligasebuffer, 1 μL ligase og 1 μL P1 tilpasser sig i et 1,5 ml centrifugerør. Pipetter 1 μL af hvert stregkodereagens i opløsningsblandingen i røret til en prøve, hvirvel i 5 s, og centrifuger kortvarigt (5 s) for at få al væske i rørbunden.
      BEMÆRK: Når du tilføjer stregkoderne, skal du bekræfte, at antallet af stregkoder og prøver svarer; åbn kun et stregkode hætteglas ad gangen for at undgå blandet forurening af stregkoder; Skift handskerne for hver fem eller seks stregkoder, der tilføjes.
    3. Rørene inkuberes ved 25 °C i 30 min.
    4. 75 μL (original prøve: perler (volumen) = 1:1.5) af magnetperlerne pipetteres i et rør, og pipetter eller forsigtigt hvirvel for at blande perlerne godt. Centrifuger kortvarigt (5 s) for at dreje hele suspensionen ned til bunden, så du undgår perleaggregering. Indstil røret i 5 min ved RT for DNA-bindingsprocessen. Vend forsigtigt rørene for at holde perlerne spredt.
    5. Indsæt centrifugerørene i magnetstativet, og vent i 5 minutter, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af sidevæggen, og supernatanten bliver gennemsigtig. Fjern supernatanten, og undgå at pipettere perlerne ud, og hold rørene på stativet, når de pipetteres.
    6. Overfør 300 μL af den nylavede 70% ethanol i rør, drej forsigtigt rørene to gange i en 180 ° vinkel, og flyt perlerne langs rørvæggen for en grundig vask. Pipetter og kassér supernatanten. Undgå at pille perlerne ud.
    7. Gentag vaskeproceduren en gang.
    8. Fjern 1,5 ml centrifugerørene fra magnetstativet, og centrifuger kortvarigt (5 s). Sæt rørene tilbage i magnetstativet, og vent i 5 minutter, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg. Pipetter forsigtigt den resterende supernatant i bunden.
    9. Hold rørhætten åben for at tørre perlerne ved RT i 3-5 min. Hold fugt væk fra perlerne.
      BEMÆRK: Luk låget med det samme, hvis der opstår revner på kuglen.
    10. Pipetter 15 μL af DNA-elueringsbufferen i røret. Skyl perlernes pille ned til bunden af røret, forsegl hætten og hvirvelen. Centrifuger kortvarigt (5 s) for at få den uklare suspension til bunden af røret og hold røret stabilt ved RT i 5 min.
  3. Forstærkning af fragment
    1. Læg biblioteksbygningen på is, når det frosne reagens opløses.
    2. Overfør 47,5 μL af enzymblandingen og 2,5 μL af primerblandingen i røret indeholdende elueret DNA og perler, hvirvel i 5 s, og centrifuger kortvarigt (5 s) for at få al væske til rørbunden.
    3. Indstil røret til RT i 5 min. Indsæt rørene tilbage i magnetiske stativer, og vent, indtil alle perler tiltrækkes af sidevæggen, og supernatanten bliver gennemsigtig. Overfør forsigtigt DNA-opløsningen til 0,2 ml PCR-rør med mærker markeret tydeligt, og undgå at pipettere perlerne ud.
    4. Inkuber prøven i et termisk cyclersæt med følgende program: 72 ° C, 20 min; 98 °C, 2 minutter; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cyklusser); 70 °C, 5 min. Røret centrifugeres kortvarigt (5 s), når reaktionen er afsluttet, og produkterne opbevares ved 4 °C.
    5. Overfør PCR-produkterne til et 1,5 ml centrifugerør (lav fastgørelse). Der tilsættes 97,5 μL (oprindeligt prøvevolumen: perler (volumen) = 1:1.5) magnetiske perler i røret, når reaktionen slutter, pipetter eller forsigtigt hvirvel for at blande perlerne godt, og centrifuger kortvarigt (5 s) for at dreje al væske ned til bunden. Undgå aggregering af perler. Indstil røret til RT i 5 min. Vend forsigtigt rørene for at holde perlerne spredt.
    6. Indsæt centrifugerørene i magnetstativet, og vent i 5 minutter, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af sidevæggen, og supernatanten bliver gennemsigtig. Fjern supernatanten, undgå at pipettere perlerne ud, og hold rørene stabile på stativet.
    7. Overfør 300 μL af den nylavede 70% ethanol i rør, drej forsigtigt rørene to gange i en 180 ° vinkel, og flyt perlerne langs rørvæggen for en grundig vask. Pipetter og kassér supernatanten. Undgå at pille perlerne ud.
    8. Gentag vaskeproceduren en gang.
    9. Fjern 1,5 ml centrifugerøret fra magnetstativet, og centrifuger kortvarigt (5 s). Sæt røret tilbage i magnetstativet, og vent i 5 minutter, indtil alle magnetiske perler tiltrækkes af rørets sidevæg. Pipetter forsigtigt den resterende væske i bunden.
    10. Hold rørhætten åben for at tørre perlerne ved RT i 3-5 min. Hold fugt væk fra perlerne.
      BEMÆRK: Luk låget med det samme, hvis der opstår revner på kuglen.
    11. Pipetter 22 μL af DNA-elueringsbufferen i røret, skyl perlernes pellet ned, og luk hætten og hvirvelen. Centrifuger kortvarigt (5 s) for at få den uklare væske til bunden af røret, og indstil røret til RT i 5 min.
    12. Kvantificer koncentrationen af konstrueret DNA-bibliotek med et fluorometer11 , og opbevar det konstruerede DNA-bibliotek ved -20 °C; koncentrationen af det valgte DNA-fragment varierer fra 0,6-10 ng/μL. Genkode biblioteksoplysningerne i biblioteksdatabasen og gemme prøverne i overensstemmelse hermed.

4. Udarbejdelse af sekventeringsskabelon 13,14

BEMÆRK: Materialer, der anvendes i dette afsnit, er tilgængelige i skabelonforberedelsessætsættet (reagenser / opløsninger / materialer) i Sekventeringsreaktions universalsættet (materialetabel).

  1. Bibliotek blanding
    1. Udfyld formularen til et forudkørt postark i serversystemet, og mærk prøverøret med bibliotekskoncentration og stregkodenummer. Undgå at bruge de samme stregkoder på forskellige prøver i én kørsel.
    2. Vortex og bland biblioteksprøven, og centrifuger kort (5 s). Alle prøverne fortyndes til 100 pM med nukleasefrit vand, hvirvel i 30 s, og prøven centrifugeres kortvarigt.
      BEMÆRK: I betragtning af at DNA har en gennemsnitlig længde på 260 bp, og 1 bp er 660 g / mol, beregnes omdannelsen af ng / μL til pM ved hjælp af følgende ligning: 1 ng / μL = 5,827,5 pM / L.
    3. Pipetter 10 μL 100 pM fortyndet bibliotek i et 1,5 ml centrifugerør, hvirvel i 30 s og centrifuger kortvarigt i 2 s. Hold det blandede bibliotek på is.
  2. Skabelon forberedelse
    1. Start skabelonforstærkningssystemet, og vælg det rene program. Reaktionsolien tilsættes til 1/2 af røret, og emulgatorbrudsopløsningen tilsættes til 1/3 af røret.
    2. Bekræft, at forstærkningspladen og vaskeadapteren er indstillet i ON-positionen . Rengør affaldsflasken, og sæt en nål i et nyt 50 ml centrifugerør for at opsamle affald. Bekræft de behandlede trin på skærmen i skabelonforstærkningssystemet. Tryk på NÆSTE for at starte et rent program, som tager ca. 15 min.
    3. Udskift forstærkningspladen med en ny efter rengøringsprogrammet, indsæt opsamlingsrørene indeholdende 150 μL brudopløsning II i rotoren, og anbring broen på opsamlingsrørene. Reaktionsolien tilsættes til 1/2 af røret og emulgatorens brudopløsning til 1/3 af røret.
    4. Emulger PCR-reagensforberedelse: Ligevægt den emulgerede PCR-buffer ved RT, indtil den opløses, centrifuger kortvarigt (5 s) alle reagenser og læg dem på is før brug.
    5. Pipette 120 μL af den emulgerede PCR-enzymblanding, 100 μL skabelonion sphere particle (ISP'er) buffer, 170,5 μL nukleasefrit vand og 9,5 μL af det blandede bibliotek (100 pM) i et rør indeholdende 2.000 μL emulgeret PCR-buffer. Bland opløsningen godt med gentagen pipettering.
      BEMÆRK: Den blandede opløsning skal indlæses på skabelonforstærkningssystemet inden for 15 minutter; udføre alle procedurer på RT.
    6. Placer et nyt filter til skabelonforberedelse stabilt på rørstativet med prøveportalen opad. Vortex opløsningen i 5 s, centrifuger kort (5 s), og overfør opløsningen til filterets prøveportal efter gentagen pipettering af 800 μL tre gange. Centrifuger røret for at mindske bobler før den sidste injektion. Undgå at injicere luft i filteret. 200 μL reaktionsolie II injiceres efter den blandede opløsning.
    7. Vend filterets prøveportal nedad, og udskift vasketilpasningen med filteret. Sæt prøvekanylen i rotorlågets midterste hul, og tryk derefter nålen mod bunden.
    8. Tryk på RUN-knappen på skærmen, vælg programmet i henhold til det tilsvarende sæt, og tryk på ASSISTERET for at kontrollere alle trin. Tryk på NÆSTE , indtil kørslen er startet; det tager cirka 4,5 timer at afslutte.
    9. Tryk på NÆSTE , når programmet er færdigt; systemet starter en 10 minutters centrifugering. Når centrifugeringen stopper, skal du trykke på knappen Åbn låg og flytte opsamlingsrørene til stativer. Hvis proceduren ikke går til næste trin om 15 minutter, skal du trykke på Final Spin for at centrifugere igen.
    10. Fjern supernatanten i opsamlingsrøret, og efterlad 100 μL opløsning i røret. Den resterende prøve blandes ved pipettering, og prøven overføres til de nye 1,5 ml centrifugerør mærket OT (One touch 2-system).
      BEMÆRK: Når du pipetterer supernatanten, skal du undgå at røre rørbunden langs siden.
    11. Pipetter 100 μL nukleasefrit vand i hvert af opsamlingsrørene, og overfør opløsningen til OT-røret, der vaskes ved gentagen pipettering. Der tilsættes 600 μL nukleasefrit vand til OT-røret for at gøre det samlede volumen 1 ml, hvirvel i 30 s og centrifugere ved 15.500 x g i 8 min.
    12. Fjern forsigtigt supernatanten i OT-røret med 100 μL tilbage, og brug spidsen til at kassere olielaget grundigt. Der tilsættes 900 μL nukleasefrit vand, hvirvel i 30 s, og centrifuger ved 15.500 x g i 8 min.
    13. Fjern supernatanten, indtil der er 20 μL tilbage, tilsæt skabelongenbrugsopløsning for at gøre volumenet 100 μL, hvirvel i 30 s og centrifugere kort i 2 s.
      BEMÆRK: Opløsningen opnået i dette trin skal fortsætte til næste trin på mindre end 12 timer.
    14. Kør det rene program på skabelonforstærkningssystemet, før du lukker for strømmen.
  3. Skabelon berigelse
    1. Smelteblandingen forberedes med 280 μL tween-80 og 40 μL 1 M NaOH.
    2. Vask C1 perlerne. Vortex C1 perler opløsning til 30 s. Overfør 100 μL perler til et 1,5 ml centrifugerør, indsæt røret på et magnetisk rack i 2 minutter og kassér supernatanten.
    3. Overfør 1 ml af C1 perler vaskeopløsningen i røret og hvirvelen i 30 s. Centrifuger kortvarigt (5 s), indsæt røret i magnetstativet i 2 minutter, og kassér supernatanten. 130 μL C1-perleopsuspensionsopløsning pipetteres i røret, og perlerne blandes ved gentagen pipettering. Undgå at skabe bobler.
    4. Der hældes 100 μL af det fortyndede bibliotek, 130 μL C1-perler, 300 μL x 3 skabelonvaskeopløsning og 300 μL af smelteopløsningen til otte-brøndsstrimlerne, som vist i figur 1.
    5. Monter otte-brøndsstrimlerne på berigelsesmodulet, læg pipetteringsspidsen, og indstil 200 μL centrifugerøret i opsamlingspositionen. Tryk på START for at køre programmet; det tager ca. 35 min.
    6. Prøven opsamles automatisk i 200 μL centrifugerøret; luk låget og centrifuger det ved 15.500 x g i 5 min. Kontroller rørbunden for at kontrollere, om der er nogen C1-perler tilbage.
    7. Hvis der er C1-perler tilbage, pipetteres skabelonopløsningen gentagne gange 10x og indsættes røret på magnetstativet i 4 minutter. Overfør hele supernatanten til et nyt 0,2 ml centrifugerør og centrifuge ved 15.500 x g i 5 min.
    8. Hvis der ikke er synlige C1-perler tilbage, kasseres supernatanten, indtil der er 10 μL tilbage, tilsættes 200 μL nukleasefrit vand og blandes ved pipettering 10x. Centrifuger ved 15.500 x g i 5 min.
    9. Supernatanten kasseres med 10 μL tilbage, og der tilsættes 90 μL nukleasefrit vand for at nå et samlet volumen på 100 μL. Pipetter op og ned 10x for at blande opløsningen, hvirvel i 5 s og centrifugere kortvarigt (5 s). Opløsningen kan opbevares ved 2-8 °C i mindre end 3 dage.

5. Næste generations sekventering 9,15

BEMÆRK: Alle procedurer i dette afsnit udføres på DA8600-sekventeringsplatformen. Materialer, der anvendes i dette afsnit, er tilgængelige i sekventeringssætsættet (reagenser / opløsninger / materialer) i sekventeringsreaktions universalsættet (materialetabel).

  1. Kontroller alle reagenser og materialer, der kræves i en run-on sekventeringsplatform.
    1. Sekventeringsreagens: Kontroller, om der er tilgængeligheden af sekventeringsenzymopløsning (6 μL), sekventeringsprimere (20 μL), kvalitetskontrolskabelon (5 μL) og dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), opbevaret mellem -30-10 °C.
    2. Sekventeringsopløsning: Kontrollér, om der er sekventeringsopløsning II (100 ml), sekventeringsopløsning III (50 ml), udglødningsbuffer (1.015 μL), læssebuffer (10 μL), skummiddel (2 μL), klortablet (1 tablet) og Streptavidinperler (100 μL), opbevaret ved 4 °C.
    3. Materialer: Kontroller, om der er 250 ml reagensrør (8), 250 reagensglasrørhætte (8), sipper II (8), sipper (1), 2 L reagensflaske (1) og sekventeringschip (1), opbevaret ved RT.
  2. Vask chippen før brug.
    1. Sæt en chip stabilt på en arbejdsplade, injicer 100 μL nukleasefrit vand i prøvehullet, fjern opløsningen i udportalen, og gentag proceduren.
    2. 100 μL 0,1 M NaOH-opløsning injiceres i chippen, og der inkuberes i 1 minut ved RT.
    3. 100 μL isopropanol injiceres i prøvehullet, der fjernes ekstra opløsning i udgangsportalen, og proceduren gentages igen.
    4. Dæk udportalen med et filterpapir, flow i nitrogenet for at tørre den resterende isopropanol i chippens flowcelle, og hold den brugsklare chip ved RT.
  3. Sequencer initiering
    1. Tænd for nitrogenventilen, og indstil trykket til 30 psi. Start sequenceren, tryk på CLEAN på hovedskærmen, og vælg vand eller klorid for at vaske maskinen i overensstemmelse hermed.
      BEMÆRK: Vask med vand før hver kørsel, vask med klorid hver uge eller den tid, maskinen står ved med reagenser over 48 timer.
    2. Kloridvask: Vælg en reagensflaske, der er specificeret til kloridvask, vask flasken to gange med 18 MΩ vand og fyld flasken med 1 liter 18 MΩ vand. Sæt en kloridtablet i flasken, opløs tabletten i 10 minutter, tilsæt 1 ml 1 M NaOH, og vend derefter flasken for at blande opløsningen. Brug chloridopløsningen inden for 3 timer efter tilberedning.
    3. 100 ml chloridopløsning filtreres med et 0,45 μm filter og opsamles med to rør. De to kloridrør anbringes i position C1 og C2. Tryk på CLEAN på hovedskærmen, og udstyr en chip til kloridvask.
    4. Tryk på NEXT og kontroller alle trin på skærmen for at starte vaskeprogrammet; programmet slutter om 30 min. Start en vask med vand efter kloridvask.
    5. Vandvask: Marker to rør, der er specifikke for vand med C1 og C2, og vask rørene med 18 MΩ vand to gange. Tilsæt 100 ml 18 MΩ vand til hvert af vandvaskerørene, og indstil dem i henholdsvis C1- og C2-positioner.
    6. Vælg CLEAN-programmet , installer chippen, der er forberedt til vandvask, tryk på NEXT, og kontroller derefter alle trin på skærmen for at starte vaskeprogrammet.
  4. Initialisering
    1. Rengør vaskeflasken med vaskeopløsning II, marker den som W2, og vask den tre gange med 18 MΩ vand.
    2. Rengør nitrogenrøret med luftlagt papir, indsæt det i rørbunden, og indstil luftstrømmen til 0,5 l/min. Aflad ilten i flasken, og fyld flasken med 1.920 ml 18 MΩ vand. Der tilsættes sekvensopløsning II og 10 μL 1 M NaOH til flasken, luk hætten, og vend flasken flere gange for at blande opløsningen.
    3. Marker to nye rør som W1 og W3. Tilsæt 32 μL 1 M NaOH til W1, tilsæt 40-50 ml 1x sekvensopløsning III til W3, og luk hætterne.
      BEMÆRK: 1x sekvensopløsning III skal være i et 37 °C vandbad i 30 minutter, når det anvendes første gang. Sekvensopløsning II skal beskyttes mod lys og opbevares ved RT. Vaskeflasken skal udskiftes med en ny efter brug 20 gange.
    4. Tryk på INITIALISER på hovedskærmen, skift sipper på W1-, W2- og W3-positionerne, indstil rørene til deres position i overensstemmelse hermed, og forsegl dem tæt ved rotation. Installer en chip til initialisering og kontroller maskinens tilstandsparametre.
    5. Tryk på NÆSTE for at starte initialiseringsprogrammet; det tager 40 min i første sektion.
      BEMÆRK: Handskerne skal skiftes, før du skifter den nye sipper for at undgå at forurene sipperens krop. Når de er brugt til vandvask og initialisering, kan chipsene påføres initialisering, men brug ikke de chips, der anvendes til kloridvaskchips til initialisering.
    6. Opløs dGTP, dCTP, dATP og dTTP på is, og hvirvel for at blande. Marker fire nye rør som G, C, A og T, og pipetter 70 μL af opløsningen i henhold til rørets mærke.
  5. Forbered biblioteket til kørsel.
    1. Placer kvalitetskontrolskabelonen, primere og enzymopløsningen på is.
    2. Forbered DNA-biblioteket, når initialiseringsprogrammet har ca. 20 minutter tilbage. Vortex kvalitetskontrolskabelonen i 30 s for at blande, og centrifuge kort i 2 s. Overfør 5 μL af kvalitetskontrolskabelonen til skabelonopløsningen, hvirvel i 5 s, og centrifuger røret i 15.500 x g i 5 min. Fjern supernatanten ved forsigtig pipettering, undgå at røre ved pelleten, og efterlad et volumen på 10 μL i røret.
    3. Der tilsættes 15 μL udglødningsbuffer i røret. opløsningens samlede volumen er 25 μL.
    4. Vortex sekvensprimerne, når den opløses helt på is og centrifugerer kortvarigt i 2 s. Overfør 20 μL af sekvensprimerne til røret fra det tidligere trin, hvirvel i 5 s, centrifuger kort i 2 s, og opbevar derefter på RT før brug.
  6. Indlæsning af prøven og sekventering
    1. Pipetter 55 μL af prøveopløsningen, der er fremstillet i det foregående trin, og injicer den i chippens prøvehul.
    2. Indstil chippen på centrifugen; hold hakket mod ydersiden og prøveportalen indeni, balancer det med en anden brugt chip og centrifuger i 10 minutter.
    3. Forbered indlæsningsopløsningen.
      1. Bland 0,5 ml af udglødningsbufferen og 0,5 ml nukleasefrit vand i et 1,5 ml centrifugerør. Marker det som 50% udglødningsbuffer og brug inden for 7 dage.
      2. Bland 0,5 ml isopropanolopløsning og 0,5 ml udglødningsbuffer. Marker det som 50% vaskebuffer og brug inden for 24 timer.
      3. Bland 6 μL sekvensenzym og 60 μL 50% udglødningsbuffer. Marker det som enzymreaktionsbuffer, og anbring opløsningen på is efter tilberedning.
      4. Bland 49 μL 50% udglødningsbuffer og 1 μL skummiddel, og markér det som skumopløsning.
    4. Blæs 100 μL luft ind i skumopløsningen, pipetter opløsningen gentagne gange, indtil boblerne er i tæt skumdannelse, og hold skumvolumenet omkring 250 μL.
    5. Chippen anbringes på bænken efter centrifuge, indsprøjtning af 100 μL skum i prøvehullet, og den ekstruderede opløsning fjernes i udgangsportalen. Sæt chippen tilbage i centrifugen, og centrifuger kortvarigt i 30 s.
    6. Gentag trin 5.6.4-5.6.5.
    7. Injicer 100 μL 50% vaskebuffer to gange, og fjern den ekstruderede opløsning i udgangsportalen efter hver injektion.
    8. Injicer 100 μL 50% udglødningsbuffer tre gange, og fjern den ekstruderede opløsning i udportalen efter hver injektion.
    9. Injicer 65 μL 50% enzymreaktionsbuffer, undgå bobler, og fjern den ekstruderede opløsning i udportalen.
    10. Stabilisere den indlæste chip ved RT i 5 minutter, og installer chippen på sequencer-chipportalen. Vælg den plan, der er programmeret i trin 6, kontroller oplysningerne, og start kørslen; det tager cirka 1,5 time at afslutte.
    11. Udfør vandvaskprogrammet inden for 72 timer efter løbets afslutning. Udfør kloridvask før vandvask, når tiden overstiger 72 timer. Luk sequenceren, og luk nitrogenventilen.

6. Planlæg en instrueret sekventeringskørsel i reporterserversystemet16

BEMÆRK: Alle procedurer i dette afsnit udføres på Ion Proton Sequencer med reporterserversystemet.

  1. Log ind på serversystemet, vælg fanen Plan , og klik på Plan skabelon Kør. Vælg hele genomet som kørselstype, og vælg den relevante skabelon på listen over planlagte kørselsskabeloner.
  2. Angiv eller foretag følgende valg under fanen Plan :
    1. Indtast et nyt kørselsplannavn i henhold til batchen af prøver, vælg hg19 (Homo sapiens) på rullelisten Referencebibliotek , og vælg Ingen på rullelisten Målområder og Hotspotområder .
    2. Angiv antallet af stregkoder, der bruges i eksempelsættet, vælg en stregkode på rullelisten for hvert eksempel, og angiv et entydigt, beskrivende navn, som kan være nyttigt til at gruppere og spore prøven. Undgå at bruge standardprøve 1 osv.
    3. Vælg Ingen under fanen Ion Reporter , klik på Næste, og vælg DNA i programmet og Helgenom som målteknik.
    4. På fanen Kits skal du kontrollere valgene eller foretage ændringer, mens det er passende for en kørsel.
      1. Vælg Ion Plus Fragment Library Kit på rullelisten Library Kit Type . Vælg Ion PI HI-Q OT2 200 kit på rullelisten Template Kit , og vælg OneTouch som standard. Vælg Ion PI HI-Q Sekventering 200 kit fra rullelisten Sekventering Kit .
      2. Indtast 300 flows, vælg Ion PITM Chip fra Chip Type rulleliste, og vælg IonXpress fra stregkode sæt rulleliste.
      3. Annuller markeringen af Markér som dubletter læser og markeringen af Aktivér justering.
    5. Vælg det relevante plugin på fanen Plugins for at udføre dataanalyse i trin 7. Udfyld valgene i projekttrinnet, klik på Næste, og klik på Plan Kør i nederste højre hjørne for at liste de planlagte kørsler.
    6. På fanen Planlagte kørsler skal du vælge den nyoprettede kørsel og kontrollere alle indstillingerne i gennemgangsvinduet.

7. Analyse af data

  1. Analyser kopinummervarianterne (CNV'er) ved hjælp af en bioinformatikarbejdsgang.
    BEMÆRK: CNV'erne blev analyseret i bioinformatik workflow med implementeringen af en algoritme baseret på en skjult Markov-model (HMM)17; modellen bruger læsedækning på tværs af genomet til at forudsige kopinummeret eller heltal ploidy status (dvs. 0, 1, 2, 3 osv.). Den overordnede bioinformatiske pipeline blev bygget i pluginet til et sekvensserversystem, hvilket er vist i figur 2. Bioinformatikanalysetrinnet tager i gennemsnit 4 timer at gennemføre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når sekvensplanen er færdig efter den kørende proces i maskinen, rapporterer sekvensserversystemet oversigten med beskrivende oplysninger om genererede data, chipstatus, isp-indlæsningshastighed og bibliotekskvalitet, som vist i figur 2. I denne resultatdemonstration blev der opnået 17,6 G data i den samlede base, og den samlede belastningshastighed for ISP var 88% i chippens samlede brønde; varmekortet viste, at prøven var jævnt belastet på chippens samlede areal (figur 2A). I det repræsentative løb blev der opnået 99.761.079 samlede aflæsninger, hvor 77% var anvendelige; i alle brønde fyldt med internetudbyder havde 100% skabeloner beriget, hvor 78% var klonale. Ud af alle klonale skabeloner var 97% kvalificeret som det endelige bibliotek (figur 2B). Den gennemsnitlige længde af læsningen var 117 bp, 176 bp og 174 bp med henholdsvis middelværdi, median og tilstand (figur 2C). Peak counts af T, C og A i tilpasning af skabeloner var ~76, hvilket er over den kvalificerede cut-off linje på 50 (figur 2D). I alle adresserbare brønde med levende internetudbydere blev 99,5% kvalificeret som det konstruerede bibliotek, og et 20% polyklonalt bibliotek og lavkvalitetsbibliotek blev filtreret ud. 76,6 % af internetudbyderne var kvalificerede til yderligere analyse (figur 2E).

Resultatet af kopinummervarianter fra en enkelt prøve S19030109-3 er vist i figur 3; den sorte bindestreg er normaliseret som et euploidisegment på tværs af 22 autosomer og kønskromosomer, den røde linje normaliseres som aneuploidikromosomregion, der repræsenterer en 182,16 Mb mosaiktrisomi af p16,3-q35,2 på kromosom 4 og et 33,13 Mb monosomisegment på q11,1-q13,33 på kromosom 22.

Repræsentative rapporter om 12 prøver ved hjælp af WGA-sæt og 13 prøver ved hjælp af ettrinsmetoden ved hjælp af uafhængigt udviklede WGA-reagenser er vist i henholdsvis tabel 4 og tabel 5, som indeholder sammenfattende oplysninger om stregkode-id, prøvenavn, unikt antal læsninger, justerede læsninger middellængde, gennemsnitlig dybde, procentdel af GC-indhold og kromosomvarianter mærke. Kromosomvarianterne markerede demonstreret kønskromosom, placering og størrelse af duplikering og sletning på kromosomer.

Figure 1
Figur 1: Diagram over prøvebelastningsposition på 8-brønds strimmel. Hver brønd med lasteindhold angivet henholdsvis. U står for uberiget prøve, B står for perler, og W står for vaskeopløsning; de tomme brønde er også noteret i figuren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kørselsoversigt: datastørrelse, isp-indlæsning og målinger af bibliotekskvalitet. (A) Den samlede status, herunder samlede baser, nøglesignal og isp-indlæsningshastighed med et varmekort. (B) Samlet antal læsninger, brugbar læsehastighed og resumé af isp-oplysninger i hvert reaktionstrin. (C) Histogrammet for læselængde. (D) Konsensusnøgle 1-Mer i TCA. (E) Adresserbare brønde og IPS klonal status. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på visualiseret kopinummervarianter plot: S19030109-3. Kopinummersignaler (CN) visualiseres i et plot med blå og grønne intervaller for kromosomer ved siden af hinanden. Det givne eksempel viser en øget observation af CN i kromosom 4 og en nedsat observation af CN i kromosom 22, da den gennemsnitlige CNV-linje noteret i røde fald udlignes fra 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Nej. af cyklusser Temperatur Tidspunkt
1 cyklus 95 °C 2 minutter
12 cykler 95 °C 15 s
15 °C 50 s
25 °C 40 s
35 °C 30 s
65 °C 40 s
75 °C 40 s
1 cyklus 4 °C Holde

Tabel 1: Termisk cyklusprogram til forforstærkning. Termiske reaktionsbetingelser såsom temperatur, tid og cyklusser vises.

Skridt Temperatur Tidspunkt Nej. af cyklusser
1 95 °C 2 minutter 1
2 95 °C 15 s 14
65 °C 1 minut
75 °C 1 minut
3 4 °C holde 1

Tabel 2: Termisk cyklusprogram til helgenomforstærkning med helgenomforstærkningssæt. Termiske reaktionsbetingelser såsom temperatur, tid og cyklusser vises.

Skridt Temperatur (°C) Tidspunkt Nej. af cyklusser
1 95 °C 2 min 30 s 1
2 95 °C 30 s 6
25°C 2 minutter
0,3 °C/s til 72 °C ——
72 °C 1 min 30 s
3 95 °C 30 s 20
62 °C 30 s
72 °C 1 minut
4 72 °C 2 minutter 1
5 4 °C holde 1

Tabel 3: Termisk cyklusprogram til helgenomforstærkning med de uafhængigt udviklede reagenser. Termiske reaktionsbetingelser såsom temperatur, tid og cyklusser vises.

Eksempel navn Unikt antal læsninger Justerede læsninger Gennemsnitlig længde Gennemsnitlig dybde CG% Sd Tegn
S19030109-1 913830 99.86 177.05 0.114 46.84 2.501 XY
S19030109-2 1277192 99.88 176.7 0.164 47.01 2.641 XX, +chr8
{p23.3->q24.3(139.13Mb)}
S19030109-3 992646 99.89 177.06 0.122 46.77 2.388 XX, +chr4{p16.3->q35.2(182.16Mb)},
-chr22{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S19030401-5 1657811 99.93 176.23 0.193 45.02 2.649 XY
S19030401-6 1738015 99.93 176.45 0.203 44.93 2.73 XY
S19030401-7 1444375 99.92 177.01 0.174 44.9 2.459 XX, +chr11{p15.5->q25(128.36Mb)},
-chr7{p22.3->q36.3(151.74Mb)}
S19030401-8 1792390 99.92 176.48 0.214 44.81 2.283 XY
S19030401-9 1802221 99.93 176.72 0.216 44.85 2.614 Xx
S19030401-10 1932425 99.95 176.5 0.233 45.41 3.405 Xx
S19030402-1 1916686 99.92 176.83 0.239 45.06 3.452 XY,+chr15
{q11.1->q21.1(23.93Mb)}
S19030402-2 1608840 99.94 176.92 0.191 44.71 2.65 XX,-chr22
{q11->q13.1(21.19Mb)}
S19030402-3 1505603 99.92 176.56 0.18 44.74 2.34 XY

Tabel 4: Eksempel på output af kopinummervariation ved hjælp af helgenomforstærkningssæt i serversystemrapport. Et typisk outputark indeholder parametre som prøvenavn, unikt læseantal, justerede aflæsninger, gennemsnitslængde, middeldybde, CG-procentdel, standardafvigelsen for længde og for de fleste mærket kromosomstatus med kønskromosom mærket med XY og afsluttet CNV-detalje. En detekteret CNV er markeret med kromosomplacering og fragmentstørrelse.

Eksempel navn Unikt antal læsninger Justerede læsninger Gennemsnitlig længde Gennemsnitlig dybde GC% Sd Tegn
S21032201-8 1046608 99.93 178.69 0.055 40.49 2.532 XY
S21032201-9 1152585 99.95 178.17 0.051 40.93 2.437 Xx
S21032201-10 1072667 99.94 178.31 0.046 40.69 2.687 XY,+chr21
{q11.2->q22.3(32.03Mb)}
S21032201-11 1067195 99.96 178.05 0.052 40.51 2.847 XX,-chr2
{p25.3->p11.2(80.34Mb)}
S21032203-1 1539227 99.93 177.96 0.064 40.84 2.109 Xx
S21032203-2 1577847 99.96 178.11 0.044 40.52 2.508 XYY,+chr2
{p25.3->q37.3(231.59Mb)}
S21032203-3 1240175 99.96 177.35 0.043 40.57 2.594 XY
S21032203-4 1216749 99.95 178.49 0.044 40.71 2.434 Xx
S21032203-5 1191443 99.94 177.57 0.04 41.06 2.464 XX,-chr22
{q11.1->q13.33(33.13Mb)}
S21032203-6 1045673 99.9 177.86 0.039 41 2.418 XY
S21032211-1 962063 99.94 177.62 0.041 40.4 2.729 XX,+chr15
{q11.1->q13.3(12.66Mb)},
+chr2 {p25.3->p25.1(11.19Mb)}
S21032211-2 915407 99.95 178.15 0.034 40.48 2.747 Xx
S21032211-3 911129 99.92 178.53 0.055 40.59 2.436 XY

Tabel 5: Eksempel på output af kopinummervariation ved et-trins metode med de uafhængigt udviklede helgenomforstærkningsreagenser i serversystemrapport. Et typisk outputark indeholder parametre som prøvenavn, unikt læseantal, justerede aflæsninger, gennemsnitslængde, middeldybde, CG-procentdel, standardafvigelsen for længde og for de fleste mærket kromosomstatus med kønskromosom mærket med XY og afsluttet CNV-detalje. En detekteret CNV er markeret med kromosomplacering og fragmentstørrelse.

Supplerende fil 1: Den anbefalede volumen af hver komponent ved tilberedning af en masterblanding af forskellige batchstørrelser. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kromosomal aneuploidi af embryoner er årsagen til en stor del af graviditetstabet, uanset om det er undfanget naturligt eller in vitro befrugtning (IVF). I den kliniske praksis med IVF foreslås det, at screening af embryoaneuploidi og overførsel af euploidiembryoet kan forbedre resultatet af IVF. Fluorescens in situ hybridisering er den tidligste teknik, der er vedtaget til kønsselektion og PGT-A; Denne teknik kræver dog mere teknisk ekspertise fra laboratoriepersonale og er relativt arbejdskrævende. Stigende undersøgelser af PGT-A ved hjælp af fluorescens in situ hybridisering viser ingen forbedring i levende fødselsrater17,18.

Der er dog gjort hurtige fremskridt inden for teknologier til at vurdere kopinummeranalysen i genetisk testning før implantation; forskellige metoder har deres fordele og ulemper. Nyudviklede omfattende molekylære teknikker såsom kvantitativ fluorescens PCR, enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP) array, array komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og næste generations sekventering viste løfte om forbedring af IVF-resultater7. Blandt disse har NGS høj konsistens med array-komparativ genomisk hybridisering på trods af dens skalerbarhed, højere gennemstrømning, lettere automatisering og mere potentiale til at reducere omkostningerne 19,20,21.

I kombination med WGA-teknikker kan NGS-analyse af embryobiopsi give mere nøjagtige sekvensoplysninger og har også en levedygtig udvidelse for flere mål for enkeltnukleotidniveau. Med den stigende anvendelse af næste generations sekventering til påvisning af genetisk abnormitet er der et presserende behov for at opbygge standarder for prøve- / dataproces både i laboratoriet og klinisk praksis 22,23,24.

I vejen fra adskillelse til aneuploidiidentifikation af PGT-A-processen omfatter de vigtigste trin adskillelse, udvælgelse af helgenomforstærkningsmetode, udvælgelse af næste generations sekventeringsplatform og analyse af sekventeringsdata. Hele genomforstærkningsprocessen er det mest kritiske trin i PGT-A, som bestemmer integriteten og ensartetheden af sekventeringsdata. Tre helgenomforstærkningsstrategier blev sammenlignet i en tidligere undersøgelse, og det er bevist, at picoPLEX kvasi-tilfældig primermetode fungerer næsten lige så godt som multiple displacement amplification (MDA) metoder med hensyn til integriteten og ensartetheden af sekventeringsdata25. Da klinisk praksis fokuserer på kopinummervariationer (CNV'er) ved en opløsning på ~ 10 Mbp snarere end enkeltnukleotidvariation i PGT-A, blev picoPLEX WGA-kittet og de uafhængigt udviklede WGA-reagenser valgt på grund af økonomiske bekymringer. I forstærkningsfasen kræver sidstnævnte kun et trin for at fuldføre forstærkningen af hele genomet uden behov for forforstærkning.

Der er to vigtigste kommercielle platforme på markedet, der i øjeblikket bruges til PGT: MiSeq fra Illumina26 og Ion Proton fra Thermo-Fisher Scientific27. Både Miseq og Proton kan identificere hele kromosomaneuploidi, men Miseq er kun designet til at identificere aneuploidi af hele kromosomet, mens protonen også kan identificere store deletioner (dels) eller duplinger (dups), herunder klinisk signifikante dels eller dups ned til en opløsning på ca. 800 kb til 1 Mb28. Proton-platformen har omkostningsfordele og stærk lokal teknisk support. Af disse grunde blev Proton-platformen valgt til senere klinisk praksis.

Bioinformatikanalysen af næste generations sekventeringsdata er kompliceret og udfordrende for klinikere i kliniske applikationer. Med stigningen i data i det offentlige arkiv af humane genetiske varianter og fortolkninger som Clinvar29, 1000 genome30 og Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)31 er der udviklet flere CNV-annotationssoftwareapplikationer og er tilgængelige til offentlig og privat brug32,33. Her blev et lokalt designet informationssystem, Darui-LIMS, anvendt til at hjælpe laboratoriepersonale og klinikere med at gennemføre CNV-dataanalysen med et enkelt klik i klinisk praksis af PGT-A34.

Vores metoder er designet specielt til PGT-A og har en god balance mellem opløsning, nøjagtighed og omkostninger. Standardprocedurer inden for genetisk materialebehandling og bioinformatik pipeline kunne producere konsistente data til klinisk analyse. Med nye fremskridt inden for teknologier baseret på NGS-systemet kan yderligere kromosomstrukturelle abnormiteter såsom translokation testes og diagnosticeres til klinisk forstærkning i PGT-cyklussen35,36. Til disse tests skal der udvikles og anvendes mere specialiserede metoder. Alligevel ville disse metoder som en specifikation til styring af den kliniske praksis for PGT-A være nyttige for laboratoriepersonale og klinikere i laboratoriepraksis af PGT-A på DA8600 næste generations sekventeringsplatform.

Denne metode har dog visse begrænsninger. I protokollen er det maksimale antal prøver, som et magnetisk rack kan understøtte, 16; Afhængigt af det faktiske antal kliniske prøver kan man naturligvis også vælge et magnetisk rack til at understøtte flere prøver ad gangen eller øge antallet af magnetstativet for at udføre flere prøveoperationer. Dette kan dog øge risikoen for driftsfejl. Derfor anbefales kommercielle kits baseret på halvledersekventering, når der arbejdes på batcher af 32 prøver eller større, såsom Ion ReproSeq PGS Kits fra Thermo-Fisher Scientific.

I henhold til de tekniske evalueringsretningslinjer for kvalitetskontrolteknologi for præimplantationschromosomale aneuploididetektionsreagenser (High Throughput Sequencing), der er offentliggjort af China National Institutes for Food and Drug Control, er kravet til det gyldige datavolumen for en enkelt prøve ikke mindre end 1 M. Der er 60-80 M aflæsninger pr. chip i henhold til Ion PI-produktoversigten, og baseret på den eksperimentelle erfaring er de gyldige unikke læsetal ikke mindre end 50% af de originale data. Efter beregning er det effektive datavolumen for hver eksperimentel prøve ikke mindre end 2 M. For at sikre nøjagtigheden af de eksperimentelle resultater anbefaler vi derfor en maksimal kapacitet på 16 prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Zhangyong Ming og Mr. Rongji Hou for deres råd om LIMS udvidet ansøgning. Denne undersøgelse er støttet af PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (nr. 20-065-76) og Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm Syringe Filter Unit Merkmillipore Millex-HV
1.5 mL DNA LoBind Tubes Eppendorf 30108051
15 mL tubes Greiner Bio-One 188261
2.0 mLDNA LoBind Tubes Eppendorf 30108078
50 mL tubes Greiner Bio-One 227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) FAPON
 Anstart Tap DNA Polymerase FAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) Beckman A63881 https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis buffer Southern Medical University Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVar NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution buffer NEB T1016L
dNTP Vazyme P031-AA
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Ethyl alcohol Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific http://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagents Southern Medical University The reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit Thermo Fisher Scientific A26434 Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit   Thermo Fisher Scientific A26433
Ion Proton System Life Technologies 4476610
Ion Reporter Server System Life Technologies 4487118
isopropanol Guangzhou Chemical Reagent Factory http://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation Kit Daan Gene Co., Ltd 114 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOH Sigma-Aldrich S5881-1KG
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9932
Oligo WGA-P2 Sangon Biotech 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 System Life Technologies 4474779  Template amplification and enrichment system
PCR tubes Axygen PCR-02D-C
PicoPLEX WGA Kit Takara Bio USA R300671
Pipette tips Quality Scientific Products https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300 Qilinbeier E0122
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 Fluorometer
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Sequencer server system Thermo Fisher Scientific Torrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal Kit Daan Gene Co., Ltd 113 https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solution Sigma 72068-100ML
Thermal Cycler Life Technologies 4375786

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Tags

Genetik udgave 186
Præimplantationsgenetisk test for aneuploidi på en halvlederbaseret næste generations sekventeringsplatform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L.,… More

Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter