Methodenartikel

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

DOI:

10.3791/63495

⸱

31. März 2022

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1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Field-Effect Biosensing (FEB) ist eine markierungsfreie Technik zum Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen. Es misst den elektrischen Strom durch den Graphen-Biosensor, an den die Bindungsziele immobilisiert werden. Die FEB-Technologie wurde verwendet, um biomolekulare Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bewerten und eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen wurde nachgewiesen.

Zusammenfassung

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Biomolekulare Wechselwirkungen spielen in zahlreichen zellulären Prozessen eine vielseitige Rolle, indem sie funktionell relevante biologische Ereignisse regulieren und koordinieren. Biomoleküle wie Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine, Fettsäuren, Nukleinsäuren und Enzyme sind grundlegende Bausteine von Lebewesen; Sie fügen sich zu komplexen Netzwerken in Biosystemen zusammen, um eine Vielzahl von Lebensereignissen zu synchronisieren. Proteine nutzen typischerweise komplexe Interaktomnetzwerke, um ihre Funktionen auszuführen; Daher ist es zwingend erforderlich, solche Wechselwirkungen zu bewerten, um ihre Bedeutung in Zellen sowohl auf zellulärer als auch auf organismischer Ebene zu entschlüsseln. Um dieses Ziel zu erreichen, führen wir eine schnell aufstrebende Technologie ein, die Feldeffekt-Biosensorik (FEB), um spezifische biomolekulare Wechselwirkungen zu bestimmen. FEB ist eine Benchtop-, markierungsfreie und zuverlässige biomolekulare Detektionstechnik zur Bestimmung spezifischer Wechselwirkungen und verwendet hochwertige elektronisch-basierte Biosensoren. Die FEB-Technologie kann aufgrund der biokompatiblen Nanomaterialien, die auf ihrer Biosensoroberfläche verwendet werden, Wechselwirkungen im nanomolaren Bereich überwachen. Als Proof of Concept wurde die Protein-Protein-Interaktion (PPI) zwischen Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) und Zellteilungszyklus 37 (Cdc37) aufgeklärt. Hsp90 ist ein ATP-abhängiges molekulares Chaperon, das eine wesentliche Rolle bei der Faltung, Stabilität, Reifung und Qualitätskontrolle vieler Proteine spielt und dadurch mehrere lebenswichtige Zellfunktionen reguliert. Cdc37 gilt als Proteinkinase-spezifisches molekulares Chaperon, da es spezifisch Proteinkinasen zu Hsp90 erkennt und rekrutiert, um ihre nachgeschalteten Signaltransduktionswege zu regulieren. Daher gilt Cdc37 als Co-Chaperone von Hsp90. Der Chaperon-Kinase-Signalweg (Hsp90/Cdc37-Komplex) ist bei mehreren Malignomen, die das Zellwachstum fördern, hyperaktiviert; Daher ist es ein potenzielles Ziel für die Krebstherapie. Die vorliegende Studie demonstriert die Effizienz der FEB-Technologie anhand des Modellsystems Hsp90/Cdc37. FEB wies einen starken PPI zwischen den beiden Proteinen nach (K-D-Werte von 0,014 μM, 0,053 μM und 0,072 μM in drei unabhängigen Experimenten). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FEB eine markierungsfreie und kostengünstige PPI-Erkennungsplattform ist, die schnelle und genaue Messungen ermöglicht.

Einleitung

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Biomolekulare Wechselwirkungen:
Proteine sind wesentliche Bestandteile von Organismen und an zahlreichen molekularen Signalwegen wie Zellstoffwechsel, Zellstruktur, Zellsignalisierung, Immunantwort, Zelladhäsion und mehr beteiligt. Während einige Proteine ihre Funktion(en) unabhängig voneinander ausführen, interagieren die meisten Proteine mit anderen Proteinen über eine Bindungsgrenzfläche, um die richtige biologische Aktivität zu koordinieren1.

Biomolekulare Wechselwirkungen können hauptsächlich auf der Grundlage der unterschiedlichen strukturellen und funktionellen Eigenschaften der beteiligten....

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Protokoll

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HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten rekombinanten Proteine, Hsp90 und Cdc37, wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Chip-Aktivierung

HINWEIS: Alle Materialien, die im Experiment verwendet werden sollen, sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt. Filtern Sie alle vorbereiteten Lösungen durch einen sterilen 0,2-μm-Filter.

  1. Es wird eine 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)-Lösung hergestellt, indem 2 mg EDC zu 2,5 ml 1 M2-(N-morpholino)-Ethansulfonsäure (MES)-Puffer (pH = 6,0) in einem 15-ml-Röhrchen zugegeben werde....

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Ergebnisse

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Ergebnisse aus Experiment 1:
Das Zielprotein Hsp90 (500 nM) wurde nach dem oben beschriebenen Zielimmobilisierungsprotokoll auf den Chip immobilisiert. Für das erste Experiment wurden 10 Konzentrationen des Analytproteins Cdc37 im Bereich von 25 nM bis 5.000 nM auf der Grundlage der in der Literatur verfügbaren Daten hergestellt (siehe Tabelle 1).

Die Schritte des Experiments können in Echtzeit überwacht werden, indem die in der I-Antwort auftretenden Verän.......

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Diskussion

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In dieser Studie wurde die Machbarkeit der Verwendung der FEB-Technologie (ein kinetischer Charakterisierungsansatz in Echtzeit) bewertet, um die biomolekulare Wechselwirkung zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bestimmen. Das erste explorative Experiment (erstes Experiment) schlug vor, dass die Auswahl der richtigen Analytkonzentrationen ein kritischer Teil des Experiments ist und dass das Experiment durch Einbeziehung von Konzentrationspunkten über und unter dem KD-Wert entworfen werden sollte, die auf der Grundlage .......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte, weder finanziell noch anderweitig.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss der Binational Science Foundation (BSF) an S.K.S. und N.Q. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Automatisierte AnalysesoftwareAgile plus Software, Cardea (Nanomed)NA
CAS-Nummer: NA		Wird im Text als die mit dem Gerät gelieferte automatisierte Analysesoftware bezeichnet. Generiert automatisierte Analysen.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)Agile plus Software, Cardea (Nanomed)NA
CAS-Nummer: NA		Biosensor-Chip
DatenüberprüfungssoftwareDatalign 1.0, Cardea (Nanomed)NA
CAS-Nummer: NA		Wird im Text als mitgelieferte Datenüberprüfungssoftware bezeichnet. Wird mit dem Gerät geliefert und ermöglicht das Überprüfen und Exportieren der Informationsdatenpunkte.
DialysetascheCelluSep,  MembranfiltrationsprodukteT2-10-15
CAS-Nummer: NA		T2-Schläuche (6.000-8.000 MWCO), (10 mm fw, 6,4 mm & Oslash;, 0,32 ml/cm, 15 m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid)Cardea (Nanomed)EDC160322-02
CAS-Nummer: 25952-53-8		Weißes
Pulver-ITC-System (Isotherme Titrationskalorimetrie)Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, Vereinigtes Königreich)NA
CAS-Nummer:
MES (2-(N-Morpholino) Ethan Sulfonsäure) PufferMerckM3671-50G
CAS-Nummer: 4432-31-9		Weißes Pulver
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid) ChipsCardea (Nanomed)NA
CAS-Nummer: NA		Graphen-basierter Chip
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) X 10Bio-Lab001623237500 
CAS-Nummer: 7758-11-4		Flüssige transparente Lösung
PipetteThermo Scientific11855231
CAS-Nummer: NA		Finnpipette F3 5-50 & micro; L, gelb
Quench 1 (3,9 mM Amino-PEG5-Alkohol in 1 x PBS)Cardea (Nanomed)0105-001-002-001
CAS-Nummer: NA		Flüssige, transparente Lösung
Quench 2 (1 M Ethanolamin (pH=8,5))Cardea (Nanomed)0105-001-003-001
CAS-Nummer: NA		Flüssige, transparente Lösung
Rekombinantes Protein Cdc37Abcamab256157
CAS-Nummer: NA
Rekombinantes Protein Hsp90 betaAbcamab80033
CAS-Nummer: NA
SpreadsheetExcel, Microsoft officeNA
CAS-Nummer: NA
StatistiksoftwareGraphPad, PrismNA
CAS-Nummer: NA		Wird als die andere Statistiksoftware bezeichnet. Sigma Plot, Phyton oder andere statistische Programme können ebenfalls verwendet werden
Sulfo-NHSCardea (Nanomed)NHS160321-07
CAS-Nummer: 106627-54-7		Weißes Pulver
TipsAlex redLC 1093-800-000
CAS-Nummer: NA		Tip 1-200 µ L, in loser Schüttung, 1.000 Stück
NA

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Hsp90 Cdc37 InteraktionProtein Protein Interaktionmarkierungsfreie DetektionBiosensor ChipDissoziationskonstanteChip Funktionalisierung

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