Methodenartikel

Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der Histonassemblierung mittels DNA-Vorhangtechnik

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DOI:

10.3791/63501

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9. März 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

DNA-Vorhang, ein Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, bietet eine Plattform für die Echtzeit-Visualisierung verschiedener Protein-DNA-Interaktionen. Das vorliegende Protokoll verwendet die DNA-Vorhangtechnik, um die biologische Rolle und den molekularen Mechanismus von Abo1 zu untersuchen, einer Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase.

Zusammenfassung

Chromatin ist eine Struktur höherer Ordnung, die eukaryotische DNA verpackt. Das Chromatin unterliegt dynamischen Veränderungen in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase und als Reaktion auf Umweltreize. Diese Veränderungen sind essentiell für die genomische Integrität, die epigenetische Regulation und DNA-Stoffwechselreaktionen wie Replikation, Transkription und Reparatur. Die Chromatin-Assemblierung ist entscheidend für die Chromatindynamik und wird durch Histon-Chaperone katalysiert. Trotz umfangreicher Studien sind die Mechanismen, mit denen Histon-Chaperone die Chromatin-Assemblierung ermöglichen, nach wie vor schwer fassbar. Darüber hinaus sind die globalen Eigenschaften von Nukleosomen, die durch Histon-Chaperone organisiert werden, nur unzureichend verstanden. Um diese Probleme anzugehen, beschreibt diese Arbeit eine einzigartige Einzelmolekül-Bildgebungstechnik namens DNA-Vorhang, die die Untersuchung der molekularen Details der Nukleosomenassemblierung durch Histon-Chaperone erleichtert. Der DNA-Vorhang ist eine Hybridtechnik, die Lipidfluidität, Mikrofluidik und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) kombiniert, um eine universelle Plattform für die Echtzeit-Bildgebung verschiedener Protein-DNA-Wechselwirkungen bereitzustellen. Mit Hilfe des DNA-Vorhangs wird die Histon-Chaperon-Funktion von Abo1, der Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase, untersucht und der molekulare Mechanismus, der der Histonassemblierung von Abo1 zugrunde liegt, aufgedeckt. Der DNA-Vorhang bietet einen einzigartigen Ansatz zur Untersuchung der Chromatindynamik.

Einleitung

Eukaryotische DNA ist in eine Struktur höherer Ordnung verpackt, die als Chromatin 1,2 bekannt ist. Das Nukleosom ist die grundlegende Einheit des Chromatins, das aus etwa 147 bp DNA besteht, die um die oktameren Kernhistone 3,4 gewickelt ist. Chromatin spielt eine entscheidende Rolle in eukaryotischen Zellen; So schützt die kompakte Struktur die DNA vor endogenen Faktoren und exogenen Bedrohungen5. Die Chromatinstruktur ändert sich dynamisch in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase und Umweltreizen, und diese Veränderungen steuern den Proteinzugang während DNA-Transaktionen wie Replikation, Transkription und Reparatur6. Die Chromatindynamik ist auch wichtig für die genomische Stabilität und die epigenetische Information.

Chromatin wird dynamisch durch verschiedene Faktoren reguliert, darunter Histonschwanzmodifikationen und Chromatinorganisatoren wie Chromatin-Remodeler, Polycomb-Gruppenproteine und Histon-Chaperone7. Histon-Chaperone koordinieren den Auf- und Abbau von Nukleosomen durch Abscheidung oder Ablösung von Kernhistonen 8,9. Defekte in Histon-Chaperonen induzieren Genominstabilität und verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs 9,10. Verschiedene Histon-Chaperone benötigen keinen chemischen Energieverbrauch wie ATP-Hydrolyse, um Nukleosomen 9,11,12,13 zu montieren oder zu zerlegen. Kürzlich berichteten Forscher, dass Bromodomänen-haltige AAA+-ATPasen (ATPase, die mit verschiedenen zellulären Aktivitäten assoziiert sind) eine Rolle bei der Chromatindynamik als Histon-Chaperone spielen 14,15,16,17. Humanes ATAD2 (ATPase-Familie AAA-Domänen-enthaltendes Protein 2) fördert die Zugänglichkeit von Chromatinen, um die Genexpression zu verbessern18. Als transkriptioneller Co-Regulator reguliert ATAD2 das Chromatin onkogener Transkriptionsfaktoren14, und die Überexpression von ATAD2 ist bei vielen Krebsarten mit einer schlechten Prognose verbunden19. Yta7, das Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)-Homolog von ATAD2, verringert die Nukleosomendichte in Chromatin15. Im Gegensatz dazu erhöht Abo1, das Homolog von ATAD2 von Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), die Nukleosomendichte16. Mit Hilfe einer einzigartigen Einzelmolekül-Bildgebungstechnik, dem DNA-Vorhang, wird untersucht, ob Abo1 zum Auf- oder Abbau von Nukleosomen beiträgt17,20.

Traditionell wurden die biochemischen Eigenschaften von Biomolekülen durch Massenexperimente wie den elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) oder die Co-Immunpräzipitation (co-IP) untersucht, bei denen eine große Anzahl von Molekülen untersucht und ihre durchschnittlichen Eigenschaften charakterisiert werden21,22. In Massenexperimenten werden molekulare Unterzustände durch den Ensemble-Mittelwert-Effekt verschleiert, und die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen ist eingeschränkt. Im Gegensatz dazu umgehen Einzelmolekültechniken die Einschränkungen von Massenexperimenten und ermöglichen die detaillierte Charakterisierung biomolekularer Wechselwirkungen. Insbesondere Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren werden häufig zur Untersuchung von DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt23. Eine dieser Techniken ist der DNA-Vorhang, ein einzigartiges Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, das auf Mikrofluidik und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) basiert24,25. In einem DNA-Vorhang sind Hunderte von einzelnen DNA-Molekülen an der Lipiddoppelschicht verankert, die aufgrund der Lipidfluidität die zweidimensionale Bewegung von DNA-Molekülen ermöglicht. Wenn eine hydrodynamische Strömung angewendet wird, bewegen sich DNA-Moleküle entlang der Strömung auf der Doppelschicht und bleiben an einer Diffusionsbarriere hängen, wo sie ausgerichtet und gestreckt werden. Während die DNA mit Interkalationsmitteln gefärbt wird, werden fluoreszenzmarkierte Proteine injiziert, und TIRFM wird verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in Echtzeit auf Einzelmolekülebene zu visualisieren23. Die DNA-Vorhangplattform erleichtert die Beobachtung von Proteinbewegungen wie Diffusion, Translokation und Kollision 26,27,28. Darüber hinaus kann der DNA-Vorhang für die Proteinkartierung auf DNA mit definierten Positionen, Orientierungen und Topologien oder für die Untersuchung der Phasentrennung von Proteinen und Nukleinsäuren verwendet werden 29,30,31.

In dieser Arbeit wird die DNA-Vorhang-Technik verwendet, um den Nachweis für die Funktion von Chaperonen durch direkte Visualisierung spezifischer Proteine zu erbringen. Da es sich bei DNA-Vorhang um eine Hochdurchsatzplattform handelt, ermöglicht es außerdem einen Umfang der Datenerfassung, der für die statistische Zuverlässigkeit ausreicht. Hier wird beschrieben, wie der DNA-Vorhang-Assay im Detail durchgeführt wird, um die molekulare Rolle der S. pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase Abo1 zu untersuchen.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Durchflusszelle

  1. Bereiten Sie einen gereinigten Objektträger mit Quarzglas vor, der Nano-Trench-Muster gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht25 enthält.
    1. Bohren Sie zwei Löcher mit 1 mm Durchmesser in einen gereinigten Quarzglas-Objektträger (Abbildung 1A) mit einem diamantbeschichteten Bohrer (siehe Materialtabelle).
    2. 250 nm dickes Aluminium (Al) mit DC-Sputter32 (siehe Materialtabelle) mit 10 mTorr Argongas auf den Objektträger auftragen.
    3. Eine 310 nm dicke Schicht aus 4% 950K Poly(methylmethacrylat) (PMMA) (siehe Materialtabelle) bei 4.000 U/min 1 min schleudern und auf einer heißen Platte bei 180 °C 3 min backen.
    4. Zeichnen Sie die Nano-Trench-Muster auf der PMMA-Schicht zwischen den beiden Löchern mit Hilfe der Elektronenstrahllithographie (ebeam)33 mit 0,724 nA Strom bei 80 kV.
      HINWEIS: Die Architektur und die Abmessungen der Nano-Trench-Muster sind in Abbildung 1A dargestellt.
    5. Entfernen Sie das ebeam-exponierte PMMA, indem Sie die Objektträger 2 Minuten lang in der Entwicklungslösung (1:3-Verhältnis von Methylisobutylketon und Isopropanol, siehe Materialtabelle) einweichen.
    6. Ätzen von Al-Schichten mit induktiv gekoppeltem plasmareaktivem Ionenätzen (ICP-RIE) unter Verwendung von Chlor (Cl2) und Bortrichlorid (BCl 3) Gasen.
      HINWEIS: Diese beiden Gase können das Al aus ebeam-exponierten Bereichen entfernen.
    7. Schnitzen Sie Nanogräben in die Objektträger mit Schwefeltetrafluorid (SF4), Tetrafluormethan (CF4) und Sauerstoff (O2) Gasen (siehe Materialtabelle).
    8. Entfernen Sie die restliche Al-Schicht, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Ätzmittel (AZ 300 MIF-Entwickler, siehe Materialtabelle) einweichen.
    9. Spülen Sie die Objektträger nach der Herstellung mit deionisiertem Wasser ab und beschallen Sie sie 30 Minuten lang mit einem badartigen Ultraschallgerät.
    10. Reinigen Sie die Objektträger mindestens 1 Tag lang unter magnetischem Rühren in 2%iger Hellmanex III-Lösung (siehe Materialtabelle).
    11. Beschallen Sie die Objektträger nacheinander 30 min in Aceton und 30 min 1 M NaOH.
    12. Spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie mit einem Stickstoffgas (N2).
  2. Lege ein sauberes Papier (5 mm x 35 mm) auf die Mitte des doppelseitigen Klebebandes. Befestigen Sie das Klebeband über dem Objektträger, um die beiden Löcher und die Nanomuster mit dem Papier zu bedecken.
  3. Schneiden Sie das Papier mit einer sauberen Klinge aus (Abbildung 1A).
  4. Legen Sie ein Deckglas auf das doppelseitige Klebeband und reiben Sie das Deckglas mit einer Pipettenspitze ab, um eine mikrofluidische Kammer zu bilden (Abbildung 1A).
  5. Platzieren Sie die zusammengebaute Durchflusszelle zwischen zwei Objektträgern und clipsen Sie sie.
  6. Die Durchflusszelle in einem 120 °C Vakuumofen 45 min backen.
  7. Befestigen Sie den Flüssigkeitsanschluss (Nanoport) für die chipbasierten Analysen (siehe Materialtabelle) mit einer Heißklebepistole an jedem offenen Loch und verbinden Sie die beiden Leinen des Luer-Lock-Schlauchs.
  8. Schließen Sie eine Luer-Lock-Spritze mit 3 ml deionisiertem Wasser an und waschen Sie die Kammer.
  9. Waschen Sie die Kammer mit 3 ml Lipidpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 100 mM NaCl) über die Tropfen-für-Tropfen-Verbindung.
    HINWEIS: Die Tropfen-für-Tropfen-Verbindung verbindet alle Spritzen mit der Durchflusszelle, um zu vermeiden, dass Luftblasen in die Kammer injiziert werden.
  10. Injizieren Sie 1 ml 0,04x biotinyliertes Lipid in Lipidpuffer in zwei Schüssen mit 5 Minuten Inkubation pro Schuss in die Kammer.
    ANMERKUNG: Die Herstellung von 1x biotinyliertem Lipidstock wird in einem zuvor veröffentlichten Bericht34 beschrieben.
  11. Waschen Sie die Kammer mit 3 ml Lipidpuffer und inkubieren Sie 20 Minuten lang, damit die Lipiddoppelschicht auf der Objektträgeroberfläche reifen kann.
  12. Fügen Sie 1 ml BSA-Puffer hinzu (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 und 0,2 mg/ml BSA) und inkubieren Sie 5 Minutenlang, um die Objektträgeroberfläche zu passivieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann die unspezifische Bindung von Proteinen an die Objektträgeroberfläche reduzieren.
  13. Injizieren Sie 0,025 mg/ml Streptavidin in 1 ml BSA-Puffer mit zwei Schüssen und 10 Minuten Inkubation pro Schuss.
  14. Waschen Sie das restliche Streptavidin mit 3 ml BSA-Puffer aus.
  15. Injizieren Sie ~300 pM (30 μl) biotinylierte Lambda-Phagen-DNA in 1 ml BSA-Puffer mit zwei Schüssen und 10 Minuten Inkubation pro Schuss in die Kammer.
    ANMERKUNG: Die Herstellung von biotinylierter Lambda-DNA wird in einem zuvor veröffentlichten Bericht34 beschrieben.

2. Durchflusszelle an das mikrofluidische System anschließen und auf das Mikroskop laden

  1. Bereiten Sie den Abo1-Bildgebungspuffer vor (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6 % Glukose und 0,1x Gloxy, siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Gloxy ist ein Sauerstofffängersystem, das das Photobleichen von Fluoreszenzfarbstoffen reduziert. Die Herstellung von 100x Gloxy-Stamm mit Glucoseoxidase und Katalase ist in Referenz35 beschrieben.
  2. Schließen Sie eine Spritze mit 10 ml Bildgebungspuffer an eine Spritzenpumpe an und entfernen Sie Blasen in allen Schlauchleitungen im mikrofluidischen System.
  3. Koppeln Sie die vorbereitete Durchflusszelle über eine Tropfen-zu-Tropfen-Verbindung mit dem Mikrofluidiksystem, um eine Blaseninjektion in die Durchflusszelle zu vermeiden (Abbildung 1B).
  4. Montieren Sie die Durchflusszelle und die Durchflusszellenhalter und montieren Sie die Baugruppe auf einem speziell angefertigten TIRF-Mikroskop (Abbildung 1C).
    VORSICHT: Wenn die Durchflusszelle unter das Mikroskop gehalten wird, stellen Sie die Höhe der Objektivlinse sorgfältig ein. Die Durchflusszelle darf die Objektivlinse nicht berühren. Dadurch kann das Objektiv beschädigt werden.
  5. Tropfen Sie das zum Index passende Öl auf die Mitte der Durchflusszelle und setzen Sie ein speziell angefertigtes Taubenprisma (siehe Materialtabelle) auf den Öltropfen.

3. Histon-Assemblierung durch Abo1 unter Verwendung des DNA-Vorhangs

  1. Mischen Sie 5 nM Abo1 und 12,5 nM Cy5-markiertes H3-H4-Histon-Dimer (Cy5-H3-H4) (siehe Materialtabelle) in 150 μl Bildgebungspuffer. Alle Proteine wurden in Anlehnung an den zuvor veröffentlichten Bericht17 hergestellt.
  2. Die Mischung 15 Minuten auf Eis inkubieren.
    HINWEIS: Um ein Photobleichen von Cy5 zu vermeiden, muss die Inkubation im Dunkeln erfolgen.
  3. Injizieren Sie ~20 pM (2 μl) des YOYO-1-Farbstoffs in einen Bildgebungspuffer durch eine 100-μl-Probenschleife, um Lambda-DNA-Moleküle zu färben.
  4. Führen Sie eine Bildgebungssoftware aus (siehe Materialtabelle) und schalten Sie den 488-nm-Laser ein, um zu überprüfen, ob die DNA-Vorhänge gut geformt sind.
    HINWEIS: Wenn DNA-Vorhänge gut ausgebildet sind, werden die DNA-Moleküle, die mit YOYO-1 gefärbt sind, als ausgerichtete Linien an einer Barriere in Gegenwart von Fluss dargestellt. Die gedehnten Linien ziehen sich zurück und diffundieren von der Barriere weg, wenn der Durchfluss abgeschaltet wird.
  5. Injizieren Sie 2 ml Puffer mit hohem Salzgehalt (200 mM NaCl und 40 mM MgCl2), um den YOYO-1-Farbstoff aus der DNA zu entfernen.
  6. Nachdem der YOYO-1-Farbstoff entfernt wurde, injizieren Sie die vorinkubierte Proteinprobe.
  7. Wenn die Proteine den DNA-Vorhang erreichen, schalten Sie die Spritzenpumpe aus, schalten Sie das Absperrventil aus und inkubieren Sie 15 Minuten für die Histonbeladung mit Abo1.
  8. Waschen Sie die ungebundenen Abo1- und Histonproteine 5 Minuten lang aus.
  9. Schalten Sie das Absperrventil ein und setzen Sie die Durchflusseinspritzung fort.
  10. Schalten Sie den 637-nm-Laser ein und bilden Sie die fluoreszierenden Proteine ab, während der Pufferfluss eingeschaltet ist.
  11. Schalten Sie den Pufferfluss vorübergehend aus, um zu überprüfen, ob Histonproteine auf die DNA geladen sind (Abbildung 2C).
  12. Sammeln Sie DNA-Vorhangbilder mit einem Bildaufnahmeprogramm (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Wenn der Pufferfluss vorübergehend stoppt, wird die DNA aus dem flüchtigen Feld der Totalreflexion zurückgeworfen, und fluoreszenzmarkierte Proteine, die an die DNA gebunden sind, verschwinden.

4. Datenanalyse

  1. Wandeln Sie die vom Bildaufnahmeprogramm aufgenommenen Bilder in das TIFF-Format als Bildsequenzen um.
    HINWEIS: Alle Daten wurden unter Verwendung von Bild J (NIH) analysiert, wie in der Referenz20 beschrieben.
  2. Wählen Sie ein einzelnes DNA-Molekül aus den Bildsequenzen aus und zeichnen Sie einen Kymographen.
    HINWEIS: Der Kymograph kann die Änderung der Fluoreszenzintensität jedes Histonproteins, das an ein einzelnes DNA-Molekül gebunden ist, in Abhängigkeit von der Zeit anzeigen.
  3. Erstellen Sie das Fluoreszenzintensitätsprofil aus dem Kymographen und passen Sie es mit mehreren Gaußschen Funktionen an.
  4. Erfassen Sie die Mittelkoordinaten der Peaks aus dem Fluoreszenzintensitätsprofil. In diesem Schritt kann die minimale Intensität der Histonfluoreszenz erhalten werden.
  5. Teilen Sie alle Spitzenintensitäten, die aus den Profilen gesammelt wurden, durch die minimale Intensität. In diesem Schritt wird die Anzahl der an DNA gebundenen H3-H4-Dimere geschätzt.
  6. Führen Sie die Schritte 4.2-4.5 für andere DNA-Moleküle durch.
  7. Erstellen Sie ein Histogramm für die Bindungsverteilung von H3-H4-Dimeren mit einer Bin-Größe von 1 kbp. Die Anzahl der analysierten Moleküle beträgt mindestens 300.

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Ergebnisse

In dieser Arbeit wird das Verfahren zur Flusszellpräparation für den DNA-Vorhang-Assay beschrieben (Abbildung 1A). Der DNA-Vorhang-Assay erleichterte die Untersuchung der Histon-H3-H4-Dimerassemblierung auf DNA durch Abo1. Zunächst wurde die Bildung von DNA-Vorhängen durch Färbung von DNA-Molekülen mit YOYO-1, einem interkalierenden Farbstoff, überprüft. Grüne Linien wurden in parallelen Arrays gezeigt, was darauf hindeutet, dass YOYO-1 in DNA-Moleküle eingelagert war, die gut ausgerichtet u...

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Diskussion

Als Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren wurde der DNA-Vorhang in großem Umfang zur Untersuchung von DNA-Stoffwechselreaktionen eingesetzt43. Der DNA-Vorhang ist ein hybrides System, das Lipidfluidität, Mikrofluidik und TIRFM miteinander verbindet. Im Gegensatz zu anderen Einzelmolekültechniken ermöglicht der DNA-Vorhang eine Hochdurchsatz-Echtzeitvisualisierung von Protein-DNA-Interaktionen. Daher eignet sich die DNA-Vorhang-Technik, um den Mechanismus hinter molekularen Wechselwirkungen zu untersu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich für die freundliche Unterstützung von Abo1 und Cy5-H3-H4 durch Professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., und Juwon Jang, Ph.D., in KAIST, Südkorea. Diese Arbeit wird durch den National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), den intramuralen Forschungsfonds (1.210115.01) des Ulsan National Institute of Science and Technology und das Institute for Basic Science (IBS-R022-D1) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL Luer-Lock-SpritzeBecktonDickinson301321
1' x 3' Schmelz-Silca-ObjektträgerglasG. Finkenbeiner1 Zoll x 3 Zoll rechteckig und 1 mm Dicke
10 mL Luer-Lock-SpritzeBecktonDickinson302149
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375Dies ist ein Bestandteil des biotinylierten Lipidbestands
18:1 Biotinyl cap PEAvanti870273Dies ist ein Bestandteil des biotinylierten Lipidstocks
18:1 PEG2000 PEAvanti880130Dies ist ein Bestandteil des biotinylierten Lipidstocks
3 mL Luer-Lock-SpritzeBecktonDickinson302832
6-Wege-ProbeninjektionsventilIDEXMX Serie II
950K PMMAAllresist671.04
AcetonSAMCHUNA1759
Adenosin 5'-triphosphat Dinatriumsalzhydrat (ATP)SigmaA2383
Aluminium (Al)TASCO, SüdkoreaLT50AI414Durchmesser 4 Zoll, Dicke 1/4 Zoll
Amicon Ultra Zentrifugalfilter, MWCO 10 kDaMilliporeZ648027
AmpicillinMbcell MB-A4128Antibiotika
AZ 300 MIF EntwicklerMerck10454110521Wird zum Entfernen von Aluminium
verwendet KlingeDORCODN5212 mm x 6 m
Bortrichlorid (BCl3)UNIONGASReinheit: >99,99%
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gDies ist ein Bestandteil von 100x gloxy
Material Chlor (Cl2)UNIONGASReinheit: >99,99%
Klares doppelseitiges Klebeband3M313770
D-(+)-GlukoseSigmaG7528
DC SputterSoronaSRM-120Wird für die Abscheidung von Aluminium auf einem Objektträger
Diamantbeschichteter BohrerEurotoolDIB-211.00Wird zum Bohren von Löchern in einen geschmolzenen Quarzglasschieber
verwendet DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
TaubenprismaKorea Electro-Optics Co., Ltd.1906-106Maßgeschneidertes Taubenprisma aus Quarzglas mit Antireflexbeschichtung
BohrerDremelDremel 3000Wird zum Bohren von Löchern in einem geschmolzenen Quarzglasträger verwendet
Elektronenbohnen-LithographieNanobeam Ltd.NB3
Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA)SigmaEDS-1KG
Fingerfeste VerschraubungenIDEXF-300Es wird mit "PFA Tubing Natural" verbunden, um Luer-Lock Schlauch zu bilden
Flanschlose AußenmutterIDEXP-235Es ist mit "PFA Tubing Natural" verbunden, um Luer-Lock Schlauch zu bilden
Gefriertrockner, HyperCOOLLabogeneHC3110Wird zur Gefriertrocknung von flüssigen Proteinen
verwendet GlukoseoxidaseSigmaG2133-50KUDies ist ein Bestandteil von 100x Gloxy Stock
Guanidinium HydrochloridAcros Organics364790025
Hamilton SpritzeHamilton Company80065Diese Spritze wird für die Probeninjektion
Hellmanex IIISigma Z805939
verwendetHiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pgCytiva28-9893-36Verwendet für FPLC (Größenausschluss)
HeizplattenrührerCorningPC-420D
SalzsäureSigmaH1759Verwendet für Tris-HCl
Index passendes ÖlZEISS444970-9000-000
Induktiv gekoppeltes plasmareaktives IonenätzenTop Technology Ltd.FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Glentham Life SciencesGC6586-100gWird zur Induktion von β-Galactosidase-Aktivität Lambda-Phagen-DNA
NEBN0311
LB BouillonBD difco244610Medien für das Wachstum von E.coli-Zellen
Luer-Adapter 10-32IDEXP-659Dies verbindet Luer-Lock Spritze und Schläuche
Magnesiumchlorid-Hexahydrat-Fischer-BioreagenzienBP214
Methylisobutylketon (MIBK)KAYAKU ADVANCED MATERIALSWird für die Entwicklung von Lösungsmikroskop
verwendet (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Inverses Fluoreszenzmikroskop
MikroskopglasDeckglas MARIENFELD10114222 x 50 mm (Nr. 1)
ObjektträgerDURAN GROUPDU.2355013Objektträger Glas geschliffene Kante 45°;, glatt 26 x 76 mm
NanoportIDEXN-333-01
ObjektivNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIImmersionsart: Wasser, Vergrößerung: 60x, Korrektur: 18, Arbeitsabstand: 0,29 (0,31-0,28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemisch kompetent E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Kompetente Zelle zur Überexpression von Proteinen
Sauerstoff (O2)NOBLEGAS, SüdkoreaReinheit: >99,99%
PFA-Schlauch natürlichIDEX1512LEs ist mit "Fingertight Fittings" verbunden, um Luer-Lock-Schlauch zu bilden
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Roche11359061001Proteasehemmer
Sephacryl S-200 High ResolutionCytiva17-0584-01Verwendet für FPLC (Größenausschluss)
AbsperrventilIDEXP-732
NatriumacetatSigma791741
Natriumchlorid (NaCl)SigmaS3014
Natriumhydroxid (NaOH)Sigmas5881
Spectra/Por molekularporöse Membranschläuche, MWCO 6-8 kDaSpectrum Laboratories132660
StreptavidinThermo Fisher ScientificS888
Schwefeltetralfluorid (SF4)NOBLEGAS, SüdkoreaReinheit: >99,99%
SpritzenpumpeKD Scientific78-8210
Tetrafluormethan (CF4)NOBLEGAS, SüdkoreaReinheit: >99,99%
TritonX-100SigmaT9284
Trizma BasisSigmaT1503Verwendet für Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Verwendet für FPLC (Ionenaustausch)
Union AssemblyIDEXP-760Dies verbindet Schläuche
HarnstoffSigmaU5378
VakuumofenJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601Dieser Interkalationsfarbstoff wird in DMSO
β-Mercaptoethanol (BME)SigmaM6250
verwendet verdünnt

Referenzen

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